腺相关病毒操作技巧——轻松入门
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介13.2AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3第四章主要流程2 4第二章应用重组腺病毒的优点4.1技术3 将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 第三章AdEasyTM4.1.13 3.1技术概况缩写英文全称中文全称AdAdenovirus腺病毒LBLuria-Bertani(broth)LB培养基MCSMultipleCloningSite5Ad5Adenovirusserotype5血清型腺病毒多克隆位点分钟腺病毒载体MinMinuteAdV AdenoviralVector AmpAmpicillin氨苄青霉素感染复数MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell) -半乳糖苷酶β-Galβ-GalactosidaseβRNA mRNAMessengerRNA信使MWCOMOIecularWeightCut-offbpBasePair碱基对PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresisBSABovineSerumAlbumin小牛血清白蛋白聚丙烯凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液互补cDNAComplementaryDNADNADNA 闭环螺旋空斑形成单位PFUPlaqueFormingUnitcccDNAClosedCircularCoiledDNA CPECytopathicEffect细胞病理效应感染后piPostInfection CsClCesiumChloride氯化铯RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒培养基DMEMDulbecco'sModifiedEagleMediumDMEM RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠乙二胺四/二硫苏糖醇DTTDithiothreitol TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸乙酸组织培养感染剂TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%溴化乙锭EtBrEthidiumBromide量FBSFetalBovineSerum胎牛血清TCPTotalCellularProtein细胞总蛋白小时HrHourITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复溶液TETris/EDTA TE 卡那霉素KanKanamycin wtWildType野生型溴千碱基对X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-kbKilobases半乳糖苷-3--4-氯吲哚-千道尔顿KDaKiloDaltons β-D-第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
腺相关病毒操作手册--汉恒生物
汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 1汉恒生物---腺相关病毒操作手册一、腺相关病毒（Adeno-Associated Viral Vector ，AAV ）简介腺相关病毒属微小病毒科( parvovirus)，为无包膜的单链线状 DNA 病毒。
AA V 的基因组约 4700bp ，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由 145 个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。
基因组中有 3 个启动子(P5、P19 和 P40) 和 2 个开放阅读读框(ORF)，rep 和 cap ，如图 1 所示。
rep 编码 4 个重叠的多功能蛋白，即 Rep78、Rep68、Rep52 和 Rep40，其中 Rep78 与 Rep68 参与 AA V 的复制与整合，Rep52 和 Rep40 具有解螺旋酶和 ATP 酶活性，与 Rep78、Rep68 共同参与单链基因组的复制；cap 编码的 VP1、VP2、VP3是装配成完整病毒所需要的衣壳蛋白，它们在 AA V 病毒整合、复制和装配中其重要作用。
图 1. AA V 基因组结构二、腺相关病毒的优点1. 安全性高：迄今从未发现野生型A A V 对人体致病，重组A A V 基因组序列上去除了大部分的野生型A A V 基因组元件，进一步保证了安全性；2. 免疫原性低：AA V2 的基因组仅 4681 个核苷酸，便于用常规的重组 DNA 技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小；3. 宿主范围广：能感染分裂细胞和非分裂细胞；4. 表达稳定：能介导基因的长期稳定表达；5. 物理性质稳定：在60℃不能被灭活，能抗氯仿；三、重组腺相关病毒载体系统简介汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 2AAV 是一种复制缺陷型微小病毒，其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。
AAV 无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System ）可以在无辅助病毒的条件下生产出重组腺相关病毒。
腺相关病毒（AAV）包装技巧
腺相关病毒（AAV）包装技巧上文已经介绍了腺相关病毒的基础知识，具有如此多优点、功能如此强大的腺相关病毒是如何生产的？本文将为大家揭开腺相关病毒生产的神秘面纱。
腺相关病毒生产流程大致可分为基因克隆、细胞转染、收毒、病毒纯化、滴度检测等步骤，具体步骤我们下文分解？怎么可能，下面就是腺相关病毒生产流程。
1）根据订单不同选择不同的载体，在此以人源基因克隆为例。
2）Vigenebio 公司的 AAV 载体与我们的人源 ORF （注：维真生物拥有18000人源cDNA ORF克隆，可以最快的时间克隆到载体）库中的穿梭质粒的多克隆位点相兼容，通过酶切，连接，转化的方式将基因亚克隆进入 pAV-FH AAV 载体，得到阳性克隆之后进行酶切跑胶验证及测序以确认插曲片段的正确性。
细胞冻存流程1) 按照培养细胞流程，将细胞吹下来加入 50ml 离心管中， 800g 离心5min。
2) 配制冻存液，90% 血清，10% DMSO，混匀。
3) 离心后去上清，将配制的冻存液加入，将细胞吹匀4) 取上述溶液 1ml 分至 1.5ml 细胞冻存管中，做好标记和日期。
5) 放入装有异丙醇的冻存盒中，放入-80度冰箱过夜。
（冻存盒要提前一天从冰箱中拿至室温，使异丙醇的温度达到室温，每次冻存前确保异丙醇的加入量在刻度线上）。
6) 第二天将冻存盒放入液氮或-150℃冰箱中。
1) 10cm 培养盘中加 10cm 新鲜 DMEM 培养基，放培养箱预热至 37℃。
2) 从液氮中取出冷冻管，迅速投入37 ℃～38℃水浴中，使其融化（1-2 分钟左右）。
3) 待细胞冻存管中溶液尚未完全融化时加入预热的培养盘中。
4) 摇晃均匀，放培养箱培养。
5) 4h后待细胞完全贴壁后更换新鲜培养基（除去冻存液中DMSO 对细胞的毒害作用。
也可在第 3步中 800g 离心 5min，除去培养基后再悬浮细胞添加至新鲜预热的 DMEM 细胞培养皿中）。
1) 生物安全柜紫外灭菌半小时。
知识分享：腺相关病毒（AAV）表达系统
知识分享：腺相关病毒（AAV）表达系统【维真⽣物】提供AAV现货和AAV包装服务，已助⼒多位客户在顶级期刊发表⽂章。
产品说明书【详见维真⽣物官⽹→（腺相关病毒包装+腺相关病毒制备+腺相关病毒案例分享+腺相关病毒技术⼿册），或联系官⽹在线客服索要相关内容的链接。
】本产品仅限⽤于研究，严禁⽤于疾病诊断。
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腺相关病毒安全操作规范1. 请在BL2⽣物安全⼆级⽣物安全柜中操作病毒。
2. 操作病毒和转染细胞时，请务必穿着实验服，佩戴⼝罩和⼿套。
3. 请⼩⼼操作，避免产⽣⽓雾或飞溅。
被病毒污染的超净⼯作台，请⽴即⽤70%⼄醇加1% SDS溶液擦拭⼲净。
接触病毒的枪头、离⼼管、培养板、培养液请使⽤新鲜配制的10％漂⽩粉进⾏消毒操作后丢弃。
4. ⽤显微镜观察细胞感染情况时，请先拧紧培养瓶或盖紧培养板，⽤70%⼄醇擦拭培养瓶外壁后，显微镜下观察拍照。
观察完毕，请⽤70%⼄醇再次擦拭显微镜实验台。
5. 离⼼病毒时，应使⽤密封性好的离⼼管，或⽤封⼝膜封⼝后进⾏离⼼，请尽量使⽤组织培养室内的离⼼机。
6. 实验完毕脱掉⼿套后，请⽴即⽤肥皂和⽔清洗双⼿。
个⼈保护措施1. 使⽤⼀次性⼿套。
2. 在注射病毒或是其后的解剖时，使⽤⼀次性⼿术服或是相当的⾐物，如果是感染细胞时，可以穿着实验服。
3. 佩戴护⽬镜或是⾯罩。
4. 所有的操作应当是在 Class II ⽣物安全柜中进⾏。
如果实验条件不能满⾜，则应当在空⽓稳定的空间中操作，减少操作时间和病毒与外界接触的时间。
不慎接触病毒时的急救1. 病毒飞溅或是⽓溶胶与⼈体接触–眼，⽪肤或是粘膜⽤⼤量清⽔冲洗眼睛或是其他接触的部位⾄少15 分钟。
ips操作指南-腺病毒版本
IPS操作指南第四版IPS操作指南--腺病毒版本IPS简介：iPS细胞是通过基因转染技术（gene transfection）将某些转录因子导入动物或入的体细胞使，体细胞直接重构成为胚胎干细胞（embryonic stemcell,ESC）细胞样的多潜能细胞。
现在大多是通过病毒携带特定的转录因子进入体细胞内，来获得多能性干细胞。
2006年日本京都大学Shinya Yamanaka在世界著名学术杂志《细胞》上率先报道了诱导多能干细胞的研究。
他们把Oct3/4,Sox2、c-Myc和Klf4这四种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。
用Retrovirus、Lentivirus诱导IPS成功的例子已经非常多，但是由于retrovirus和lentivirus的基因组整合性，往往伴随基因组的破坏与癌化。
用Lentivirus和retrovirus 建立的IPS子宫移植繁衍而成的克隆鼠往往都伴随着肿瘤的高发生率。
Adenovirus（腺病毒）是一类滴度极高，不整合基因组，可以简单实现高效感染的病毒载体，近年来以Adenovirus介导的IPS诱导已被证实成功且安全。
一、实验材料腺病毒OSKM四因子：Ad-OCT4、Ad-SOX2、Ad-KLF4和Ad-c-MYC；病毒扩增细胞：293A细胞；ES Feeder细胞：MEF（C57）。
二、实验仪器和耗材（一）实验仪器二级安全柜、37度培养箱、4度冰箱、液氮储存器、倒置显微镜、低温离心机。
耗材PBS、无菌水、明胶粉、DMEM培养基、FBS、非必须氨基酸、β-巯基乙醇、胰酶、血清替代物（SR）、mTESR1、T75培养瓶、无菌水、15ml离心管、50ml离心管，巴氏管等。
三、ips诱导方法（一）Feeder细胞1、Feeder细胞的分离（MEF）取妊娠13.5-14.5d的孕鼠，在无菌情况下取出胎鼠，去除鼠头，尾，四肢及内脏，然后用PBS进行冲洗。
腺病毒载体操作手册1407
腺病毒载体操作手册一、实验流程制备腺病毒穿梭质粒，分别高纯度无内毒素抽提腺病毒穿梭质粒和骨架质粒，共转染293A细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养十几天，在中间四五天左右更换一次新鲜培养基，然后收集细胞和1ml培液置于15ml离心管后，液氮/37度冻融三次（冻-融要彻底），2000rpm离心5分钟，取上清即为病毒液初代原液。
连续三代反复扩增收集病毒后，行病毒的大量扩增，然后通过CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。
二、实验材料（一）腺病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒（包括pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBAd-U6-GFP, pHBAd-U6-RFP）和骨架质粒pBHGlox（delta）E1,3Cre。
其中穿梭质粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和pHBAd-U6-GFP能表达绿色荧光蛋白（GFP）。
pHBAd-CMV-IRES-RFP和pHBAd-U6-RFP能表达红色荧光蛋白（RFP）。
1、载体信息1) 腺病毒克隆载体图谱如下：各载体用途如下表：2）骨架质粒信息如下：2、细胞株293A，腺病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞,生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。
三、包装细胞293A细胞的培养（一）293A细胞的冻存293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。
该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。
若细胞密度持续在70%以下，QBI-293A细胞则能连续培养3~4个月维持原有细胞特性。
若以购买得到的293A作为第一代，则30代内能得到最佳结果。
随着传代的次数增加，293A细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
腺病毒中文操作手册
腺病毒中⽂操作⼿册腺病毒载体操作⼿册中⽂版腺病毒重组系统AdEasyTM操作⼿册⽬录第⼀章简介13.2AdEasyTM系统中产⽣重组腺病毒的时程3第四章主要流程2 4第⼆章应⽤重组腺病毒的优点4.1技术3 将基因克隆⼊AdEasyTM转移载体4 第三章AdEasyTM4.1.13 3.1技术概况缩写英⽂全称中⽂全称AdAdenovirus腺病毒LBLuria-Bertani(broth)LB培养基MCSMultipleCloningSite5Ad5Adenovirusserotype5⾎清型腺病毒多克隆位点分钟腺病毒载体MinMinuteAdV AdenoviralVector AmpAmpicillin氨苄青霉素感染复数MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell) -半乳糖苷酶β-Galβ-GalactosidaseβRNA mRNAMessengerRNA信使MWCOMOIecularWeightCut-offbpBasePair碱基对PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresisBSABovineSerumAlbumin⼩⽜⾎清⽩蛋⽩聚丙烯凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液互补cDNAComplementaryDNADNADNA 闭环螺旋空斑形成单位PFUPlaqueFormingUnitcccDNAClosedCircularCoiledDNA CPECytopathicEffect细胞病理效应感染后piPostInfection CsClCesiumChloride氯化铯RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒培养基DMEMDulbecco'sModifiedEagleMediumDMEM RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复DMSODimethylSulfoxide⼆甲基亚砜SDSSodiumDodecylSulfate⼗⼆烷基硫酸钠⼄⼆胺四/⼆硫苏糖醇DTTDithiothreitol TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid⼄⼆胺四⼄酸⼄酸组织培养感染剂TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%溴化⼄锭EtBrEthidiumBromide量FBSFetalBovineSerum胎⽜⾎清TCPTotalCellularProtein细胞总蛋⽩⼩时HrHourITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复溶液TETris/EDTA TE 卡那霉素KanKanamycin wtWildType野⽣型溴千碱基对X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-kbKilobases半乳糖苷-3--4-氯吲哚-千道尔顿KDaKiloDaltons β-D-第⼀章简介当今基因输送技术的发展⽇趋复杂，⼀些治疗药物（⽣长激素、⼲扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋⽩（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更⾼效的基因输送⼯具。
腺病毒感染细胞具体步骤及方法
腺病毒感染细胞具体步骤及方法操作工具•慢病毒•腺病毒•腺相关病毒•悬浮细胞专用病毒•质粒基因调控•CRISPR/Cas9•RNA干扰•过表达•非编码基因•组织特异性启动子•Cre-loxp疾病研究•心血管领域•肝脏•眼•肺•脂肪、骨、肾脏神经领域•神经系统•光遗传•化学遗传•钙离子成像腺病毒腺病毒（Adenovirus）是一种线性双链DNA无包膜病毒，对分裂期细胞和非分裂期细胞均具有感染能力，且具有嗜上皮细胞性。
重组腺病毒载体是以腺病毒为基础发展起来的工具病毒载体，它可通过受体介导的内吞作用进入细胞内，但腺病毒基因组不整合进入宿主细胞基因组中。
腺病毒作为一种常用的基因操作工具，在心血管领域、肝脏、肌肉、肺、肿瘤及其他领域广泛应用。
优势腺病毒与其他病毒工具比较，具有以下优势：a. 是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统：腺病毒感染细胞后，1-2 天即可表达，是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统;b. 滴度高：腺病毒系统在转有E1 基因的HEK293 细胞中可进行自我复制，可产生滴度为1010到1011 PFU/mL 的病毒;c. 载体容量大：可容纳不超过5kb 的片段;d. 不整合到染色体中，无插入致突变性：腺病毒除卵细胞以外，几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中，因此避免了因整合而引发的潜在的基因突变和随机效应。
包装服务质量检测载体选择粒成提供完善的腺病毒产品体系，用于操作编码基因和非编码基因，如lncRNA、microRNA、circRNA。
应用案例1. 细胞感染。
第七章腺相关病毒载体
腺相关病毒载体，AA V)是一类单链线状DNA缺陷腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus型病毒。
其基因组DNA小于5 kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。
AA V 不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。
腺相关病毒载体是利用天然存在的腺相关病毒某些特性经过基因工程改造后，AA V）产生的一种可供人工转基因的载体。
腺相关病毒（adeno-associated virus是简单的非致病性单链DNA病毒，需要辅助病毒参与生活周期，辅助病毒通常为腺病毒（Ad）或者单纯疱疹病毒（HSV）。
基因组两端为末端反向重复序列（ITR），中间基因组编码两个蛋白：Cap和Rep。
ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。
Cap蛋白为病毒衣壳蛋白，Rep蛋白参与病毒的复制和整合。
AA V 能感染多种细胞。
Rep蛋白存在时，病毒基因组很容易整合到人类第19号染色体的特异位点：AA VS1位点。
这是已知的唯一能够定点整合的哺乳动物DNA病毒。
重组腺相关病毒载体（rAA V）源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广（分裂和非分裂细胞）、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。
优点：以潜伏感染为主； AA V可以高效定点整合至人染色体中：可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因可以持续稳定表达。
缺点：AA V载体容量小，目前最多只能容纳5 kb外源DNA片段；感染效率比逆转录病毒载体低。
在40%-80%的成人中存在过感染，可能会引起免疫排斥。
AA V选择的条件1. 治疗基因的长度不能过大。
AA V的总容量4.7kb，还要包括AA V自身的ITR，启动区和RNA加尾信号；2. 基因需要持续表达，蛋白可以是分泌型，也可以是非分泌型；3. 长期表达目的基因，没毒副作用；4. 不需要目的基因立刻表达；5. 不需要基因高水平表达；6. AA V载体对靶细胞具有较高的转导效率。
腺相关病毒操作技巧——轻松入门
腺相关病毒操作技巧——轻松⼊门--您⾝边的病毒载体专家腺相关病毒操作⼿册AAV相关实验请在⽣物安全柜（BL-2级别）内操作。
01操作病毒时请穿实验服，佩戴⼝罩和⼿套，尽量不要裸露双⼿及⼿臂的⽪肤。
02操作病毒时特别⼩⼼病毒溅出。
如果操作时超净⼯作台有病毒污染，请⽴即⽤ 70%⼄醇加 1%的SDS溶液擦拭⼲净。
03接触过病毒的枪头、离⼼管、培养板、培养液请⽤84消毒液浸泡后统⼀处理。
04如需要离⼼，应使⽤密封性好的离⼼管，如有必要请⽤封⼝膜封⼝后离⼼。
05病毒相关的废弃物需要特殊收集，统⼀经⾼温灭菌处理。
06实验完毕后请⽤洗⼿液清洗双⼿。
07⼀、AAV安全使⽤注意事项AAV的储存＋收到病毒液后若在短期内使⽤，可将病毒放置于4℃保存（⼀周内使⽤完最佳）；如需长期保存请分装后放置于-80℃。
注：a．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融病毒滴度会降低10%-50%），因此在病毒使⽤过程中应尽量避免反复冻融。
汉恒⽣物已对病毒进⾏了分装（200 µl/tube），收到后请直接放置-80℃保存即可。
b．若病毒储存时间超过6个⽉，汉恒⽣物建议在使⽤前重新测定病毒滴度。
⼆、AAV储存与稀释的注意事项02三、AAV介绍四、汉恒⽣物AAV产品服务及载体信息与现货列表01⼀、AAV安全注意事项⼆、AAV储存和稀释注意事项08⼗、AAV滴度测定14⼗三、AAV病毒的使⽤15附录1参考⽂献06五、AAV整体实验流程六、实验材料09⼗⼀、AAV感染细胞测试⼗⼆、AAV⽤于动物实验（重磅⼲货，五星推荐）07七、AAV载体构建⼋、AAV包装九、AAV收集和纯化⽬录01腺相关病毒操作⼿册AAV的稀释＋需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使⽤培养⽬的细胞⽤⽆菌PBS或⽣理盐⽔混匀分装后置于4℃保存（⼀周内使⽤完最佳）。
●安全-AAV不参与任何疾病的发⽣，已经⽤于临床疾病的治疗；●⾼效-病毒滴度⾼达1013以上，组织感染能⼒超强；●表达周期久-AAV免疫原性超低，基因持续表达半年以上；●最全⾎清型-拥有全部⾎清型和⼀系列突变体亚型，⼏乎可以感染所有的组织和脏器；●组织特异性-拥有DIO元件载体系统和最全的组织特异性启动⼦⼯具箱，如⼼脏、肝脏、肌⾁以及各种神经元特异的启动⼦等；●病毒产品全部经过⽆菌、⽆⽀原体、⽆内毒素检测，让实验安全放⼼。
腺病毒的感染与防治PPT课件
咽结合膜热
以发热、咽炎、结膜炎为特征 ，常伴有颈部淋巴结肿大。
急性出血性膀胱炎
主要表现为尿频、尿急、尿痛 等膀胱刺激症状，以及镜下血
尿或肉眼血尿。
其他类型
包括胃肠炎、心肌炎、脑炎等 ，临床表现多种多样。
重症患者特征及预后
重症患者特征
多见于5岁以下儿童，尤其是2岁以下婴 幼儿；持续高热超过3天，精神萎靡或烦 躁不安；频繁咳嗽，气促明显，甚至出 现呼吸困难和发绀；心率增快，出现心 音低钝或奔马律；肝脏进行性肿大，伴 有压痛；外周血白细胞计数明显升高或 降低，C反应蛋白等炎症指标明显升高。
腺病毒分类
根据血清型和基因组的不同，腺 病毒可分为多个种类，包括A-F组 ，每组又包含多个血清型。
腺病毒传播途径
空气传播
水传播
腺病毒可通过飞沫、气溶胶等空气传 播方式传播，感染者在咳嗽、打喷嚏 或说话时产生的飞沫可携带病毒。
腺病毒还可能在游泳池、浴室等潮湿 环境中通过水传播，感染者在水中排 泄后，病毒可在水中存活一段时间。
勤洗手
经常用肥皂和清水洗手， 特别是在接触公共场所或 动物后。
戴口罩
在公共场所、医院等环境 中，应佩戴口罩，防止病 毒通过飞沫传播。
避免接触
避免与生病的人密切接触 ，减少感染风险。
公共场所卫生管理要求
定期清洁消毒
对公共场所如学校、幼儿园、医 院、商场等，要定期进行清洁和
消毒。
保持通风
确保公共场所通风良好，有助于降 低病毒在空气中的浓度。
可通过病毒学检测进行鉴别。
支原体肺炎
支原体肺炎与腺病毒肺炎在影像 学上表现相似，但支原体肺炎起 病较缓、病程较长，可通过血清
学检测和PCR技术进行鉴别。
病毒转基因技术原理 腺相关病毒
ITR
ITR中的前125个核苷酸具有回文结 构，其中还存在两个小的内部回文结 构，可自身折叠后经碱基配对、形成T 字形的发夹结构；剩余的20个核苷酸， 保持非配对状态，称为D序列（D sequence）。 ITR中还具有Rep结合元件（Rep binding elements， RBEs) RBE和 RBEˊ ， 以及一个末端解离位点TRS （terminal resolution site）等重要序 列。 ITR是在AAV生物学中重要的顺式 （cis）作用活性元件，在病毒复制中 具有重要作用：在非容许条件下，ITR 在病毒复制的负调控中起关键作用； 在容许条件下，作为病毒基因组复制 的起点和引物。 ITR对病毒基因组的包装、转录、以 及位点特异性的整合，均是必需的。
溶原性阶段（lysogenic stage）
染色体q13.4的AAVS1位点中最少 33bp的序列，包含由8个核苷酸分开的 RBE样和 TRS样序列，对AAV的靶向整合是必须而且充分的条件。位点特 异性的整合过程即使是在Rep78和 Rep68蛋白理想表达的条件下，未必是 完全是位点特异的，大约40-70%的整合发生在AAVS1位点
第二节 腺相关病毒载体 转基因技术原理
蛋白表达型腺相关病毒载体
―三成分包装系统
―自我互补型AAV 载体（self-complementary AAV vector， scAAV）
―反式剪接型AAV 载体（trans-splicing AAV vector, tsAAV） ―衣壳蛋白修饰型AAV载体
右端的ORF（Cap基因）
由P40启动子指导转录，产生两个转录物，可编码三个病毒衣壳蛋白， 即VP1，VP2和VP3。 这些衣壳蛋白利用共同的ORF ，但转录起始位置不一致。 一般而言，VP1、VP2和VP3的分子比是1：1：8/10。 构成这些病毒体的衣壳蛋白的比例的差异，最有可能会影响病毒的感染 性，尤其是VP1含量低的情况下。缺乏VP1的病毒体没有感染性。
腺相关病毒常见问题解答
腺相关病毒常见问题解答Q1：AAV的注射方式，有尾静脉注射也有局部原位注射，该怎么选？AAV的体内注射（给药）方式分为系统性给药和局部给药，系统性给药主要有尾静脉、颈静脉、眼眶静脉和腹腔静脉给药；局部给药方式常见的包括脑立体定位、肌肉定点注射、心肌原位注射、玻璃体腔内注射、关节腔注射等；系统性给药是特点是病毒注射的体积较大，一般需要100~1000μl不等，病毒在体内扩散的范围广，一般系统性给药的方式操作较为简单，给药比较方便；局部给药则病毒注射量要求较少，一般100μl以内，但对滴度要求较高；由于是直接将AAV递送到目标组织，局部给药会有更好的靶向性，如果是临床基因治疗，局部给药注射的病毒量少，因此病理毒性会更小。
Q2：AAV注射小鼠，多少病毒量才够呢？影响AAV注射总量的因素很多，比较重要的有血清型、目标组织类型、注射方式（局部or全身）、动物模型（如大鼠or小鼠）等，对于有文献报道的，可参考文献的注射方法，最好设置几个不同的梯度。
例如AAV9感染小鼠心脏组织（心肌细胞），可采用尾静脉注射也可采用心肌多点注射的方式，尾静脉注射推荐1011 vg/mL，100μL；原点注射则推荐1010 vg/mL，20 μL/点。
想了解更多不同组织的AAV注射病毒量的推荐可以联系我们。
Q3：AAV注射后多久起效？有办法缩短其表达时间吗？在我们的上期有提到，AAV进入细胞后需经历一个从单链DNA变成双链DNA的过程，因此，目的基因开始表达所需的时间较长，一般在1周左右或以上可以检测到，这个也跟目的基因相关，不同基因的表达高峰时间是不同的。
另外，可采用自互补AAV（Self-complementary Recombinant Adeno-Associated Virus ，scAAV）加快表达速度，scAAV是通过改造其中的一个ITR使得AAV可形成二聚体，其进入细胞可直接进行表达，在多种组织中表达更迅速且表达水平更高。
小鼠尾静脉病毒、腺病毒、慢病毒注射操作步骤
小鼠尾静脉病毒(腺病毒、慢病毒)注射操作步骤小鼠尾静脉病毒(腺病毒、慢病毒)注射操作步骤1、固定建议自制了一个小圆筒，筒的直径正好容下一直小鼠，筒的一端是盲端，筒身上开了N个通气空，有一个后盖，后盖上留有一圆孔，正好容下尾巴。
由于小鼠有钻洞的习性，把它往筒口一放，自己就钻进去了，然后把尾巴从盖孔中穿过，盖上后盖即可。
找一张桌子，把尾巴压在桌边沿上，由于边沿是个直角，把尾巴的下1/3处压在直角上能使尾部暴露很好。
2、扩张血管小鼠尾静脉用热水泡一下或是用75％的酒精擦拭小鼠尾静脉，以使注射前使尾静脉充分充血扩张；或是在上方悬挂一灯泡，在适当距离烤尾静脉也可以使尾静脉充血扩张。
3、注射小鼠尾静脉共三根，一根背侧，另两根分置于两侧，腹侧是动脉。
每只小鼠病毒注射量：以下为建议，具体的注射量需要实验摸索纯化过腺病毒：1-5×109毒量注射(1)，比如纯化腺病毒滴度为1×1011PFU，则每只小鼠注射体积约为10-50ul。
浓缩慢病毒：1-5×107毒量注射，如慢病毒滴度为1×108PFU/ml，则小鼠理论上注射100-500ul，实际上每次注射体积有严格要求（见下方），所以如果量不够，需要分多次注射，每次注射至少间隔1-2天。
每只小鼠病毒注射体积：注射体积不要超过200ul，最好控制在100ul以下，注射剂量过多，也会发生充血性心衰。
关于注射针：一般小鼠尾静脉注射可采用1ml注射器，并更换为4号针头。
（不要用1ml注射器配套的针头，太大了！）建议选用胰岛素注射针（有大小容量，见下图，有很多厂家，图为BD的胰岛素针），可按需选择。
尾静大鼠四号针头300ul小鼠四号针头100ul注意：1.一开始最好从小鼠尾静脉的末端开始注射，如果在中前端注射一旦失败这样可以防止注射的数次失败后液体漏出。
2.注射时手上的感觉很重要，如果针头进入尾静脉，手上会有一种透空感，另外针头如果进入后，液体的推射会很顺利；如果，感觉液体推不进去，很费力，说明针头没有进入尾静脉，而是进入了周围的软组织。
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CAG，广谱 CAG，广谱 CAG，广谱 CAG，广谱 EF1a，广谱
4、汉恒生物AAV-retro神经逆行示踪工具现货列表（表4）
载体类型
载体名称
启动子及其特点
神经逆行标记 神经逆行标记 神经逆行标记 神经逆行标记 神经逆行标记
AAV2/retro-EGFP AAV2/retro-CAG-cre AAV2/retro-DIO-EGFP AAV2/retro-DIO-tdtomato AAV2/retro-EF1a-DIO-Flp
1.5 kb
CAG，广谱，强
mcherry
否
pHBAAV-CAG-DIO-MCS-T2A-ZsGreen
1.2 kb
CAG，广谱，强
ZsGreen
是
过表达 干扰
pHBAAV-CAG-DIO-MCS-T2A-mCherry pHBAAV-hsyn-MCS-T2A-ZsGreen pHBAAV-hsyn-MCS-T2A-mCherry pHBAAV-CamkII-MCS-T2A-ZsGreen pHBAAV-CamkII-MCS-T2A-mCherry pHBAAV-GFAP-T2A-EGFP pHBAAV-U6-MCS-CMV-ZsGreen pHBAAV-U6-CMV-mCherry
04
是否Cre依赖
是 是 是 是 是 是 是 是 是 是 是 是 否 否 否 否 否 否 否 否 否 否 否 否 否 否 否 否 否 否
腺相关病毒操作手册
3、汉恒生物AAV化学遗传学工具现货列表（表3）
载体类型
白喉毒素介导的 细胞毒性
Gq-DREADD Gi- DREADD Gq-DREADD Gi- DREADD Gq-DREADD Gi- DREADD Gq-DREADD Gi- DREADD
hSyn（人源成熟神经元特异启动子）， 中强度
hSyn（人源成熟神经元特异启动子）， 中强度
hSyn（人源成熟神经元特异启动子）， 中强度
CaMKII（兴奋性经元神经特异启动子）， 强
CaMKII（兴奋性经元神经特异启动子）， 强
GFP GFP GFP mCherry mCherry mCherry mCherry mCherry mCherry mCherry mCherry
02
腺相关病毒操作手册
＋ 汉恒AAV产品特点
● 安全-AAV不参与任何疾病的发生，已经用于临床疾病的治疗； ● 高效-病毒滴度高达1013以上，组织感染能力超强； ● 表达周期久-AAV免疫原性超低，基因持续表达半年以上； ● 最全血清型-拥有全部血清型和一系列突变体亚型，几乎可以感染所有的组织和脏器； ● 组织特异性-拥有DIO元件载体系统和最全的组织特异性启动子工具箱，如心脏、肝脏、
CAG（CMV和鸡beta-actin嵌合型启动子）， 广谱，强
hSyn（人源成熟神经元特异启动子）， 中强度
CaMKII（兴奋性经元神经特异启动子）， 强
CAG（CMV和鸡beta-actin嵌合型启动子）， 广谱，强
CAG（CMV和鸡beta-actin嵌合型启动子）， 广谱，强
hSyn（人源成熟神经元特异启动子）， 中强度
1.2 kb 1.6 kb 1.6 kb 1.6 kb 1.6 kb 1.6 kb shRNA shRNA
CAG，广谱，强
mcherry
是
hSyn，成熟神经元，
中强度
ZsGreen
否
hSyn，成熟神经元，
中强度
mcherry
否
CamkII，兴奋性经元
ZsGreen
否
神经特异启动子，强
CamkII，兴奋性经元
--您身边的病毒载体专家
腺相关病毒操作手册
目录
01
一、AAV安全注意事项 二、AAV储存和稀释注意事项
02
三、AAV介绍 四、汉恒生物AAV产品服务及载体信息与现货列表
06
五、AAV整体实验流程 六、实验材料
07
七、AAV载体构建 八、AAV包装
九、AAV收集和纯化
08 十、AAV滴度测定
09
十一、AAV感染细胞测试 十二、AAV用于动物实验（重磅干货，五星推荐）
CAG（人巨细胞病毒启动 子CMV和鸡beta-actin嵌 合型启动子），广谱，强
CMV（人巨细胞病毒启动 子），广谱，强
hSyn（人源成熟神经元特 异启动子），中强度
GFAP（星形胶质细胞特异 启动子），中强度
CaMKII（兴奋性经元神经 特异启动子），强
标记基因
EYFP mcherry
EYFP mcherry
注：a．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融病毒滴度会降低10%-50%），因此在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融。汉恒生物 已对病毒进行了分装（200 μl/tube），收到后请直接放置-80℃保存即可。
b．若病毒储存时间超过6个月，汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度。
01
＋ AAV的稀释
需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用无菌PBS或生理盐水 混匀分装后置于4℃保存（一周内使用完最佳）。
04
接触过病毒的枪头、离心管、培养板、培养液请用84消毒液浸的离心管，如有必要请用封口膜封口
后离心。
06 病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。
07 实验完毕后请用洗手液清洗双手。
二、AAV储存与稀释的注意事项
＋ AAV的储存
收到病毒液后若在短期内使用，可将病毒放置于4℃保存（一周内使用完最佳）；如需长期 保存请分装后放置于-80℃。
三、AAV介绍
腺相关病毒（AAV）属微小病毒科（parvovirus），为无包膜的单链线状DNA病毒。只有在 腺病毒或者疱疹病毒等辅助病毒协助下，宿主才能产生具有感染性的AAV，所以AAV被称作腺相 关病毒。典型的AAV2基因组约 4800 bp，包括2个反向末端重复序列（ITR，145 bp）和两个读 码框（ORF）-Rep和Cap（图1）。ITR对合成互补DNA链是必需的；Rep和Cap可以翻译成多种 不同蛋白，如AAV生活周期必需的Rep78、Rep68、Rep52和Rep40以及包膜蛋白VP1、VP2及 VP3等。AAV病毒系统就是用目的基因替换掉Rep和Cap，然后与表达Rep和Cap基因的质粒共转 ，从而产生包含目的基因的AAV。目前AAV有12种血清型、100多种变体。不同的血清型对组织 或器官有着不同的亲和性。由于安全性高、免疫原性小、表达周期久等优点，AAV被称为目前最 适合在体研究（in vivo）基因功能的利器。
mcherry
否
神经特异启动子，强
GFAP，星形胶质细胞，
EGFP
否
中强度
U6
ZsGreen
否
U6
mcherry
否
circRNA过表达 pHBAAV-CMV-crRNA-EF1-ZsGreen
1.2 kb
CMV，广谱，强
ZsGreen
否
在体敲除 pHBAAV-gRNA-saCas9
gRNA
U6
无
否
03
肌肉以及各种神经元特异的启动子等； ● 病毒产品全部经过无菌、无支原体、无内毒素检测，让实验安全放心。
＋ 汉恒生物AAV主要载体及现货列表
1、汉恒生物AAV主要载体列表（表1）
（部分组织特异性启动子如心脏、肝脏、肌肉等没有在表中列出，欢迎咨询定制。）
载体类型
载体名称
可插入片段大小 启动子及其特点 标记基因 是否Cre依赖
pHBAAV-CMV-MCS-T2A-ZsGreen
1.6 kb
CMV，广谱，强
ZsGreen
否
pHBAAV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen
1.2 kb
CMV，广谱，强
ZsGreen
否
pHBAAV-CAG-MCS-T2A-ZsGreen
1.5 kb
CAG，广谱，强
ZsGreen
否
pHBAAV-CAG-MCS-T2A-mcherry
EYFP EYFP EYFP mcherry EYFP mcherry EYFP EYFP EYFP mcherry EYFP mcherry EYFP EYFP EYFP mcherry EYFP mcherry EYFP EYFP EYFP mcherry EYFP mcherry EYFP EYFP
4.8 kb
rep
cap
ITR
Replication
Capsid
ITR
AAV2基因组示意图
四、汉恒生物AAV产品服务及载体信息与现货列表
＋ 汉恒AAV产品分类
● 常规基因的过表达和干扰定制（载体列表见“七、载体构建”部分）； ● 组织特异性启动子过表达定制（载体列表见“七、载体构建”部分）； ● 常规启动子和组织特异性启动子驱动的AAV-Cas9定制； ● AAV介导的光遗传、化学遗传载体现货及改造服务等（见表3）； ● 双标、单标LC3自噬流监测工具（见表5）； ● 组织特异性AAV-DIO载体的定制（原理见附件1）。
载体名称
启动子及其特点
标记基因
pHBAAV-CAG-DIO-DTR-2A-GFP pHBAAV-hSyn-DTR-2A-GFP pHBAAV-CaMKII-DTR-2A-GFP pHBAAV-CAG-DIO-hM3D(Gq)-mCherry pHBAAV-CAG-DIO-hM4D(Gi)-mCherry pHBAAV-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherry pHBAAV-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherry pHBAAV-hSyn-hM3D(Gq)-mCherry pHBAAV-hSyn-hM4D(Gi)-mCherry pHBAAV-CaMKII-hM3D(Gq)-mCherry pHBAAV-CaMKII-hM4D(Gi)-mCherry