腺病毒中文操作手册
腺相关病毒细胞感染手册
腺相关病毒（AAV）感染目的细胞腺相关病毒（AAV）感染目的细胞一、腺相关病毒（Adeno-Associated Viral Vector，AAV）简介腺相关病毒属微小病毒科(parvovirus)，为无包膜的单链线状DNA病毒。
AA V的基因组约4700bp，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由145个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。
基因组中有3个启动子(P5、P19和P40)和2个开放阅读读框(ORF)，rep和cap，如图1所示。
rep编码4个重叠的多功能蛋白，即Rep78、Rep68、Rep52和Rep40，其中Rep78与Rep68参与AAV的复制与整合，Rep52和Rep40具有解螺旋酶和ATP酶活性，与Rep78、Rep68共同参与单链基因组的复制；cap编码的VP1、VP2、VP3是装配成完整病毒所需要的衣壳蛋白，它们在AA V病毒整合、复制和装配中其重要作用。
图1.AA V基因结构二、腺相关病毒的优点1.安全性高：迄今从未发现野生型AA V对人体致病，重组AA V基因组序列上去除了大部分的野生型AA V基因组元件，进一步保证了安全性；2.免疫原性低：AA V2的基因组仅4681个核苷酸，便于用常规的重组DNA技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小；3.宿主范围广：能感染分裂细胞和非分裂细胞；4.表达稳定：能介导基因的长期稳定表达；5.物理性质稳定：在60℃不能被灭活，能抗氯仿；三、重组腺相关病毒载体不同血清型研究发现AA V具有多种血清型，各种不同血清型的AA V载体的主要区别是衣壳蛋白不同，因此对不同的组织和细胞的转染效率存在差异。
目前汉恒生物在包装腺相关病毒时有9中不同的AAV血清型可供客户选择，建议客户针对不同组织器官选择相应血清型的AAV病毒，见表1。
四、AAV感染目的细胞不同的AAV血清型对不同的细胞有相对的亲和力，因此，对于AAV来说，不同类型的细胞的侵染实验，首先需要确定合适的AAV 血清型，在此基础上进行最适MOI的摸索。
腺病毒操作手册
Shanghai GeneChem Co. Ltd 重组腺病毒操作手册(Version 2.0)上海吉凯基因技术有限公司 二〇〇九年二月地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720 弄 1 号 408 室 电话：86-21-51320189 网址： 邮编：201203 传真：86-21-51320179 Email：service@Page 1 of 4 Shanghai GeneChem Co. Ltd 重组腺病毒实验系统腺病毒是一种的线型双链 DNA 无包膜病毒， 它的 DNA 和核心蛋白形成的内核， 蛋白外壳 是直径约 80nm 的正二十面体，由 240 个六 面体和 12 个位于正二十面体顶部的五面体 构成。
Genechem 重组腺病毒系统是将携带外源基 因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒基因组的 包装质粒共转染 HEK293 细胞， 通过 Cre/loxP 系统的作用实现重组，产生重组腺病毒。
重组腺病毒能够表达较大的外源基因片段， 感染分裂和非分裂细胞，具有广泛的宿主。
GFP-adenovirus 感染的代表细胞――腺病毒可以感染绝大多数细胞TCA8113SGC-7901NRKPC-3Huh-7GliaRabbit Mesenchymal Stem CellsHuman Mesenchymal Stem CellRat Cardiac Fibroblasts地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720 弄 1 号 408 室 电话：86-21-51320189 网址： 邮编：201203 传真：86-21-51320179 Email：service@Page 2 of 4 Shanghai GeneChem Co. Ltd 重组腺病毒操作过程一, 注意事项:1. 操作病毒时请尽量使用生物安全柜。
GENMED小量腺病毒沉淀法纯化试剂盒 产品说明书(中文版)
GENMED SCIENTIFICS INC. U.S.A GMS60071.1 v.A GENMED小量腺病毒沉淀法纯化试剂盒产品说明书（中文版）主要用途GENMED小量腺病毒沉淀法纯化试剂是一种旨在通过非离子去垢剂裂解细胞，然后化学沉淀的技术处理，以获得不含宿主细胞裂液中任何成分包括残余蛋白和核酸的高纯度腺病毒的权威而经典的技术方法。
该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。
其适用于野生型腺病毒、腺病毒相关病毒（AA V）、各种亚型的腺病毒以及其它实验用病毒等的纯化。
可以直接用于扩增分析、西方杂交分析、基因疫苗和基因疗法等各种后续实验。
产品即到即用，性能稳定，严格无菌，无核酶污染，操作简便，产物纯度极高，重复性好，回收效率高达99％。
技术背景感染复数（multiplicity of infection；MOI），即平均每个细胞感染病毒的数量，决定病毒效价（滴度）。
通常人胚胎视网膜911细胞或人胚肾293细胞的MOI为5－10 PFU/细胞。
化学沉淀技术是理想的快速纯化小量或大量腺病毒的方法。
其腺病毒回收效率达99％，纯度达80％以上。
尤为重要的是其操作安全，无需超速离心、核酶使用、树脂处理，可以获得优于其它提取方法的高度纯化的腺病毒产物。
产品内容GENMED裂解液（Reagent A）毫升GENMED沉淀液（Reagent B）毫升GENMED保存液（Reagent C）毫升GENMED过滤柱套产品说明书1份保存方式保存GENMED保存液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月用户自备50毫升锥形离心管：用于样品操作的容器台式离心机：用于沉淀感染细胞涡旋震荡仪：用于混匀微型台式离心机：用于分离腺病毒实验步骤1．根据细胞的MOI，计算用于病毒感染所需的细胞数，要求总量达到VP2．准备适量的（5至10个）cm2细胞培养瓶的细胞铺板3．直至生长到％铺满率4．病毒感染5．感染后天，显微镜观察：细胞呈现圆形，％细胞脱落6．小心移取所有培养瓶的细胞培养液到毫升锥形离心管7．放进 ℃台式离心机离心分钟，速度为g8．小心抽掉上清液9．用细胞刮脱棒分别刮下所有细胞培养瓶的细胞10．全部合并到到个毫升锥形离心管11．放进 ℃台式离心机离心分钟，速度为g12．小心抽去上清液13．加入毫升GENMED裂解液（Reagent A）14．涡旋震荡秒15．室温下静置分钟16．加入微升GENMED沉淀液（Reagent B）到细胞悬液底部17．涡旋震荡秒18．移取微升细胞悬液到GENMED过滤柱19．放进 ℃微型台式离心机离心分钟，速度为g（或RPM；例如eppendorf 5415）20．小心取出GENMED过滤柱21．继续移取剩余微升上述细胞悬液到GENMED过滤柱22．放进 ℃微型台式离心机离心分钟，速度为g（或RPM；例如eppendorf 5415）23．扔掉GENMED过滤柱24．加入微升GENMED保存液（Reagent C），混匀25．放进℃冰箱里保存注意事项1．本产品为10次操作2．所有操作均须无菌状态下进行3．操作时，须戴手套4．严格遵守病毒操作安全规范5．操作时使用的枪头须使用带滤芯的枪头6．GENMED沉淀液（Reagent B）配比优化7．纯化病毒产物，避免反复冻融8．病毒效价（滴度）取决于感染量和感染复数9．本公司提供系列腺病毒试剂产品和外包服务质量标准1．本产品经鉴定性能稳定2．本产品经鉴定无核酶污染3．本产品经鉴定纯化程度高4．本产品经鉴定无宿主细胞污染杰美基因秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。
腺病毒中文操作手册
腺病毒中文操作手册腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1第二章应用重组腺病毒的优点 2第三章 AdEasyTM 技术 33.1 技术概况 33.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3第四章主要流程 44.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体44.1.1 克隆的一般原则 44.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 54.2.1 共转化的一般原则 54.2.2 共转化方法 54.2.3 预期结果 54.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 64.4.1 细胞铺板 64.4.2 磷酸钙转化技术 7第五章常用技术 85.1 QBI-293A细胞培养 85.1.1 QBI-293A细胞的初始培养85.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖 85.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生 95.2.1 感染QBI-293A细胞 95.2.2 病毒空斑形成 95.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 9 5.3 MOI测定 105.4 腺病毒感染力测定 105.4.1 X-Gal染色 115.5 重组腺病毒的筛选和纯化 115.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 115.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增125.5.3 Western杂交 135.5.4 Southern杂交和点杂交 135.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定 145.5.7 功能测定 145.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 155.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 165.7.1 不连续密度梯度离心 175.7.2 连续密度梯度离心 175.7.3 病毒溶液去盐和浓集 17 5.8 病毒滴度测定 18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法 205.8.3 50%组织培养感染剂量法 20 第六章疑难解答 226.1 QBI-293A细胞培养 226.2 感染力测定 226.3 转移载体克隆 236.4 在BJ5183细胞中共转化和重组246.5 转染QBI-293A细胞 256.6 筛选和测定 256.7 在QBI-293A细胞中表达 266.8 重组腺病毒的扩增 266.9 纯化 266.10 病毒滴度测定 27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNA cccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNA MWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Gal actopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
上海杰美基因医药 GENMED 重组腺病毒转染试剂盒产品说明书(中文版)
上海杰美基因医药科技有限公司杰美品牌大师品质GMS60036 v.A GENMED重组腺病毒转染试剂盒产品说明书（中文版）主要用途GENMED重组腺病毒转染试剂是一种旨在通过强烈的阳离子脂质体介导载体，帮助腺病毒基因组质粒或腺病毒载体穿梭质粒DNA轻易通过病毒包装细胞的权威而经典的技术方法。
该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。
其适用于各种病毒质粒DNA（例如pJM17或pBHG10等）转入多种类型的贴壁型病毒包装培养细胞系（例如人胚胎视网膜911细胞或人胚肾293细胞等）。
可以被用于稳定转染或暂态转染。
产品严格无菌，即到即用，无核酶污染，配比优化，操作简捷，性能稳定，转染效率明显。
技术背景LipofusinX为带有精胺基团强负电性的脂质体介导载体，其基团具有超强的穿膜能力，血清干扰因素无损于携带外源性DNA高效进入细胞内。
产品内容GENMED清理液（Reagent A） 毫升GENMED转染液（Reagent B） 微升GENMED强化液（Reagent C） 微升GENMED保存液（Reagent D） 毫升产品说明书 1份保存方式保存在4℃冰箱里，有效保证6月用户自备质粒DNA：用于转染的目标DNA病毒包装细胞（例如911细胞或293细胞等）：用于目标DNA转染的宿主细胞1.5毫升离心管：用于转染液和DNA操作的容器胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于细胞脱离完全细胞培养液（GMS12052）：用于转染后的细胞培养实验步骤转染实验开始前，移取微升GENMED清理液（Reagent A）到无菌的毫升离心管，然后加入微升GENMED转染液（Reagent B），再加入微升GENMED强化液（Reagent C），用微升枪头轻轻上下抽吸混匀，成为转染工作液。
然后进行下列操作。
1．准备个cm2细胞培养瓶里的病毒包装细胞（例如911细胞或293细胞等）2．在转染前小时，用胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液脱离细胞一次3．细胞铺满率达％（细胞）4．移取微升GENMED清理液（Reagent A）到无菌的毫升离心管5．方法一：（双质粒共转染）分别加入微升用户需转染的腺病毒载体穿梭质粒DNA（微克）和微升腺病毒基因组质粒DNA（微克），用微升枪头轻轻上下抽吸混匀方法二：（单一线性质粒转染）加入微升用户需转染的重组腺病毒线性载体DNA（微克），用微升枪头轻轻上下抽吸混匀6．用微升枪头一滴一滴缓慢加入DNA混匀物到转染工作液里，再用枪头轻轻上下抽吸混匀7．混匀后，在室温下静置分钟，期间轻轻混匀数次8．同时小心抽掉细胞培养瓶里的培养液9．轻轻加入毫升℃预热的GENMED清理液（Reagent A）10．即刻小心抽掉GENMED清理液（Reagent A）11．重复实验步骤和一次12．轻轻加入毫升GENMED清理液（Reagent A）到培养瓶里13．轻轻混匀含有DNA的转染工作液，即刻轻轻缓慢加入微升到细胞培养瓶里14．轻轻摇动细胞培养瓶，使其混匀15．放进℃细胞培养箱，孵育小时（注意：参见注意事项9）16．小心抽掉含有DNA的转染工作液（注意：参见注意事项10和11）17．加入毫升用户自备的完全细胞培养液18．放进℃细胞培养箱，孵育过夜19．以后每隔天小心抽掉细胞培养瓶里的培养液20．小心加入至毫升用户自备的完全细胞培养液21．转染后天，刮下细胞培养瓶里的细胞22．移入到毫升锥形离心管23．放进台式离心机离心分钟，速度为g24．小心抽去上清液25．加入毫升GENMED保存液（Reagent D）26．放进℃冰箱里保存或即刻进行病毒上清制备以及后续感染注意事项1．本产品为10次操作量2．整个操作须无菌操作3．操作时，须戴手套4．注意病毒操作安全5．操作时使用的枪头须使用带滤芯的枪头6．建议使用高度纯化且无内毒素的载体DNA7．建议一次操作，同时进行5个以上25cm2细胞培养瓶的转染，确保足够获得重组腺病毒量8．根据用户实际情况，建议使用空载体对照或报告基因标记对照9．孵育时建议将培养瓶密封，以防或避免转染工作液蒸发10．更换液体时，须小心，以防细胞松动或脱落11．如果转染孵育后，出现较多细胞松动和脱落，直接加入5毫升用户自备的完全细胞培养液，继续孵育24小时后，进行更换12．通常转染后2周内，不会出现明显的空斑形成或细胞病理效应（CPE）13．本产品提供的成分配比优化14．如果转染不理想，可以适当调整转染液、强化液和DNA用量15．本公司提供系列腺病毒试剂产品和外包服务质量标准1．本产品经鉴定性能长期稳定2．本产品经鉴定转染效率高使用承诺杰美基因秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。
吉玛重组腺病毒操作手册说明书
如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：************************** E-mail：************************吉玛重组腺病毒操作手册GenePharma Recombinant Adenovirus Operation Manual2017 年 6 月如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：**************************E-mail：************************目录一、产品简介 (4)二、腺病毒载体优势 (4)三、生物安全性 (5)3.1安全性 (5)3.2实验室安全措施 (5)四、流程描述 (6)五、材料与仪器 (7)5.1实验材料 (7)5.1.1细胞株 (7)5.1.2质粒 (7)5.1.3试剂 (8)5.2实验耗材及仪器 (8)5.2.1耗材 (8)5.2.2仪器 (9)六、具体步骤 (9)6.1细胞培养 (9)6.1.1活细胞计数 (9)6.1.2细胞株的冻存 (9)6.1.3细胞复苏 (10)6.1.4细胞传代 (10)6.2病毒包装 (10)6.3病毒收集 (11)6.4病毒扩增 (12)6.5病毒纯化 (12)6.6病毒重悬和保存 (13)6.7病毒滴度检测 (13)七、使用方法 (14)如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：************************** E-mail：************************重组腺病毒在细胞水平使用 (14)7.1病毒滴度复核（有限稀释法测定） (14)7.2靶细胞感染预实验 (16)7.3正式试验 (18)八、运输和储存 (18)九、常见问题及解决方案 (19)十、吉玛案例 (20)十一、附录 (21)如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：************************** E-mail：************************一、产品简介腺病毒(Adenovirus，Adv)是一种线性双链DNA 病毒。
汉恒腺病毒载体操作手册
6
汉恒生物公司地址：上海市徐汇区斜土路
E-mail:service@
1175 号 15 楼
T实e验l：室02地1-址51：29上62海58市张江高科技园区蔡伦路 781 弄张江药谷 503
腺病毒载体操作手册
四、腺病毒包装、扩增和纯化
（一）腺病毒包装
5118bp
GFP
(NotI ) (NcoI ) (NcoI )
pUC ori
SV40 PolyA LoxP
HindIII
[ SacI SalI
Amp r pUC ori
SacII
XbaI(456)
ITR
ITR
1
(NdeI )
(NdeI )
NheI(1384)
pHB Ad-U6-RFP 4993bp
1
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腺病毒载体操作手册
蛋白（GFP）。pHBAd-CMV-IRES-RFP 和 pHBAd-U6-RFP 能表达 红色荧光蛋白（RFP）。
3、将细胞溶液转移到 15ml 离心管中，并在其中加上 1ml 新鲜 的完全培养基，混匀后离心，1000rpm，5min。
腺相关病毒操作手册--汉恒生物
汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 1汉恒生物---腺相关病毒操作手册一、腺相关病毒（Adeno-Associated Viral Vector ，AAV ）简介腺相关病毒属微小病毒科( parvovirus)，为无包膜的单链线状 DNA 病毒。
AA V 的基因组约 4700bp ，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由 145 个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。
基因组中有 3 个启动子(P5、P19 和 P40) 和 2 个开放阅读读框(ORF)，rep 和 cap ，如图 1 所示。
rep 编码 4 个重叠的多功能蛋白，即 Rep78、Rep68、Rep52 和 Rep40，其中 Rep78 与 Rep68 参与 AA V 的复制与整合，Rep52 和 Rep40 具有解螺旋酶和 ATP 酶活性，与 Rep78、Rep68 共同参与单链基因组的复制；cap 编码的 VP1、VP2、VP3是装配成完整病毒所需要的衣壳蛋白，它们在 AA V 病毒整合、复制和装配中其重要作用。
图 1. AA V 基因组结构二、腺相关病毒的优点1. 安全性高：迄今从未发现野生型A A V 对人体致病，重组A A V 基因组序列上去除了大部分的野生型A A V 基因组元件，进一步保证了安全性；2. 免疫原性低：AA V2 的基因组仅 4681 个核苷酸，便于用常规的重组 DNA 技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小；3. 宿主范围广：能感染分裂细胞和非分裂细胞；4. 表达稳定：能介导基因的长期稳定表达；5. 物理性质稳定：在60℃不能被灭活，能抗氯仿；三、重组腺相关病毒载体系统简介汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 2AAV 是一种复制缺陷型微小病毒，其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。
AAV 无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System ）可以在无辅助病毒的条件下生产出重组腺相关病毒。
miRNA腺病毒操作手册-推荐下载
miRNA腺病毒操作手册miRNA简介MicroRNAs（miRNAs）是一类长度为18-24个核苷酸的非编码RNA分子。
MiRNA通过与靶基因mRNA上的互补序列结合，降解mRNA或抑制mRNA的翻译。
MiRNAs在细胞分化、增殖、凋亡和癌细胞发生中发挥重要的调控作用。
MiRNAs 来源于具有60-80 个核苷酸茎环结构的microRNA 前体（premir）和序列更长一些的microRNA初级转录产物（primir）。
MiRNA在核内由RNA聚合酶II（polII）转录生成，最初产物primir具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴。
ViGene生物的mirAD-腺病毒microRNA前体表达系统包括三个相关产品：microRNA前体穿梭载体、microRNA前体腺病毒载体和预制microRNA前体腺病毒。
microRNA前体腺病毒简介重组腺病毒是进行基因转移和表达的工具，功能强大且易于操作。
腺病毒独特的生物学特征使它成为“载体的首选”，被科研工作者广泛应用。
首先，它能够感染包括分裂、非分裂细胞和干细胞在内的多种细胞。
第二，病毒滴度高。
第三，高滴度的病毒可获得高感染效率和高表达量。
第四，病毒进入细胞后，病毒基因组不整合到细胞染色体上，因此瞬时表达外源基因的重组腺病毒不会诱导宿主细胞中染色体的变化。
ViGene生物选用的是应用最广泛的复制缺陷型的人类血清5型腺病毒，该腺病毒载体缺失E1和E3基因。
E1 基因在组装感染性病毒颗粒时必不可少，可在HEK293T细胞病毒包装过程中得到补充，而E3基因可有可无。
由于E1和E3基因的缺失，腺病毒载体可插入高达7.5kb的外源基因。
pMir-microRNA precursor 是基于microRNA 前体表达系统的质粒。
microRNA前体天然的茎环结构被克隆到质粒的SgfI和MluI双酶切位点。
为了保持推测的发卡结构和诱导正确的内源性反应，miRNA茎环结构的两侧具有它的150-200bp的天然序列。
腺相关病毒操作手册
腺相关病毒操作手册一、腺相关病毒（Adeno-Associated Viral Vector，AAV）简介腺相关病毒属微小病毒科(parvovirus)，为无包膜的单链线状DNA病毒。
AA V的基因组约4700bp，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由145个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。
基因组中有3个启动子(P5、P19和P40)和2个开放阅读读框(ORF)，rep和cap，如图1所示。
rep编码4个重叠的多功能蛋白，即Rep78、Rep68、Rep52和Rep40，其中Rep78与Rep68参与AA V的复制与整合，Rep52和Rep40具有解螺旋酶和ATP酶活性，与Rep78、Rep68共同参与单链基因组的复制；cap编码的VP1、VP2、VP3是装配成完整病毒所需要的衣壳蛋白，它们在AA V病毒整合、复制和装配中其重要作用。
图1.AA V基因结构二、腺相关病毒的优点1.安全性高：迄今从未发现野生型AA V对人体致病，重组AA V基因组序列上去除了大部分的野生型AA V基因组元件，进一步保证了安全性；2.免疫原性低：AA V2的基因组仅4681个核苷酸，便于用常规的重组DNA技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小；3.宿主范围广：能感染分裂细胞和非分裂细胞；4.表达稳定：能介导基因的长期稳定表达；5.物理性质稳定：在60℃不能被灭活，能抗氯仿；（汉恒--AAV包装）三、重组腺相关病毒载体系统简介AAV是一种复制缺陷型微小病毒，其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。
AAV无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System）可以在无辅助病毒的条件下生产出重组腺相关病毒。
在AAV Helper-Free System中，生产具有感染性的AAV病毒颗粒所需的腺病毒基因产物（如：E2A，E4等基因）大部分由pHelper质粒提供，其余的腺病毒基因产物由稳定表达腺病毒E1基因的AAV-293宿主细胞提供。
腺病毒包装操作手册
汉恒重组腺病毒操作手册目录腺病毒安全使用和注意事项腺病毒储存与稀释的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、腺病毒包装和浓缩四、重组腺病毒滴度（PFU）的测定五、重组腺病毒感染目的细胞六、重组腺病毒用于动物实验附1：汉恒生物腺病毒载体附2：腺病毒感染细胞最佳MOI的摸索（表达荧光的病毒） 附3：汉恒生物常见三种病毒感染目的细胞比较腺病毒安全使用和注意事项➢腺病毒安全使用注意事项（*非常重要*）1) 腺病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。
2) 操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。
3) 操作病毒时需要特别小心病毒溅出。
如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加 1%的SDS溶液擦拭干净。
4) 接触过病毒的枪头、离心管、培养板及培养瓶请用84消毒液浸泡后统一处理。
5) 如实验过程中需要离心，应使用密封性好的离心管，必要时请用封口膜封口后离心。
6) 病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌后处理。
7) 实验完毕后请用香皂清洗双手。
➢腺病毒储存与稀释的注意事项1）腺病毒的储存收到病毒液后若在短期内使用，可将病毒放置于 4℃保存（一周内使用完最佳）；如需长期保存请分装后放置于 -80 ℃ 。
注：a.反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会使病毒滴度降低10%~50%），因此在病毒使用过程中尽量避免反复冻融。
汉恒生物对病毒已进行分装（200 μl/tube），收到后请直接放置-80℃冰箱保存即可。
b.若病毒储存时间超过6个月，汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度（参见附表2-慢病毒滴度测定方法）。
2）腺病毒的稀释需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用PBS或培养目的细胞用的无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于 4℃保存(一周内使用完最佳)。
重组腺病毒是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。
通用腺病毒骨架载体pAdEasy-1产品说明书中文版主要用途
通用腺病毒骨架载体（pAdEasy-1）产品说明书（中文版）主要用途通用腺病毒骨架载体（pAdEasy-1）是一种与穿梭载体在特定细菌中同源重组构建产生重组腺病毒的改造型人腺病毒5型的主干基因分子。
适用于病毒感染性基因疗法的载体。
产品即到即用，性能稳定，重组保证。
技术背景pAdEasy-1腺病毒骨架载体含有人腺病毒5型的大部分基因组，去除E1和E3病毒基因，旨在提供外源性DNA 插入整合，同时避免病毒自我复制。
其中E1基因的剔除，使病毒在宿主细胞内失去DNA复制能力，而不能产生传染性病毒颗粒；E3基因的剔除，可以避开宿主的免疫反应。
pAdEasy-1为33.5kb，具有氨苄青霉素抗性，一旦与穿梭载体重组，其抗性消失。
同时具有内切酶Pac1和Cla1的位点。
产品内容载体液（Reagent A）（100纳克/微升）5微升产品说明书1份保存方式保存在－20℃冰箱里，有效保证6月用户自备BJ5183：用于载体转化重组的宿主细胞实验提示1．通常1次转化用量为100纳克2．使用BJ5183进行转化后重组3．建议和线性穿梭载体（1微克）共转染4．建议使用电转为优先5．转化后细菌培养不宜在BJ5183里超过20小时6．转化后的阳性细菌菌落通常比正常菌落小三分之一注意事项1．本产品为5微升（500纳克）规格2．操作时，须戴手套3．严格无菌操作4．载体转化后的菌落越小，转染阳性可能性越高；BJ5183的转化效率通常较之其它细菌要高5．转染的载体越大，转化效率越低，载体拷贝数越低，菌落后续培养越慢；大于40kb的载体，其琼脂平板上的菌落阳性率至多为20％6．不能使用常规质粒抽提方法提取载体；建议使用煮沸法质粒/柯斯质粒DNA快速抽提试剂盒－HL60004，既适合大型质粒提取，又避免质粒切口产生7．使用Pac1（50单位）进行酶切鉴定，其电泳条带为30kb和3kb（或4.5kb）8．pAdEasy-1腺病毒骨架载体基本信息如下：9．本公司提供系列腺病毒试剂产品质量标准1．本产品经鉴定性能稳定2．本产品经鉴定重组保证。
腺病毒感染诊疗指南
腺病毒感染诊疗指南2013全军传染病专业委员会，新突发传染病中西医临床救治课题组1概述自2011年12月以来，我国不同地区先后发生多起经呼吸道传播的暴发传染病疫情，疫情波及面广，传染性强，经实验室病原检测鉴定分别为B组55型、7型和14型腺病毒。
腺病毒主要引起呼吸道疾病，但也可感染消化道、泌尿道、眼部、心肌等部位而引起疾病。
通常认为B1、C、E组腺病毒主要引起呼吸道疾病，而B2组主要引起泌尿系统感染。
全球多次报道由腺病毒引发的呼吸道疾病在新兵中暴发流行[1-8]。
2病原学腺病毒是一种无外壳的双链DNA病毒，属腺病毒科，基因组全长约34.7kb，衣壳呈规则的20面体结构，直径80~110nm。
核心由双股DNA及蛋白质组成，外有核壳，上有252个壳粒，由240个六邻体和12个五邻体组成。
外无类脂质包膜。
耐乙醚和氯仿等脂溶剂；耐酸，不耐热，56℃ 30min可灭活此病毒[9]。
能感染人的腺病毒有A－G共7个组，目前已知有55个不同的血清型，其中最常见的致病型为1－8型。
55型腺病毒是由人11型和14型腺病毒重组产生的新型病毒，属于B组B2亚组[10-11]。
一般情况下，病毒感染时，人体免疫系统能够激发体液免疫和细胞免疫反应并逐渐控制感染、清除病毒。
感染早期(病初1~3d)出现病毒血症时，从患者血清和鼻、咽分泌物中可以检测到病毒核酸。
腺病毒感染后可诱发较强的免疫反应，产生特异性抗体。
一般发病后1周，患者体内的IgM开始产生，7~10d IgG开始产生，随后逐渐升高[12]。
机体对同型腺病毒再感染可产生有效免疫。
3流行病学3.1传染源腺病毒感染患者和隐性感染者是最主要的传染源。
3.2传播途径主要通过空气飞沫传播。
多数型别的腺病毒可通过消化道途径传播。
密切接触也是很重要的传播方式，包括与患者共同生活或探视患者。
直接接触患者或感染者的排泄物、分泌物及其他被污染的物品，病毒由手经口、鼻、眼黏膜侵入机体实现传播。
(整理)腺病毒载体操作手册1407-R2
腺病毒载体操作手册一、实验流程制备腺病毒穿梭质粒，分别高纯度无内毒素抽提腺病毒穿梭质粒和骨架质粒，共转染293A细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养十几天，在中间四五天左右更换一次新鲜培养基，然后收集细胞和1ml培液置于15ml离心管后，液氮/37度冻融三次（冻-融要彻底），2000rpm离心5分钟，取上清即为病毒液初代原液。
连续三代反复扩增收集病毒后，行病毒的大量扩增，然后通过CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。
二、实验材料（一）腺病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒（包括pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBAd-U6-GFP, pHBAd-U6-RFP）和骨架质粒pBHGlox（delta）E1,3Cre。
其中穿梭质粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和pHBAd-U6-GFP能表达绿色荧光蛋白（GFP）。
pHBAd-CMV-IRES-RFP和pHBAd-U6-RFP能表达红色荧光蛋白（RFP）。
1、载体信息1) 腺病毒克隆载体图谱如下：各载体用途如下表：2）骨架质粒信息如下：2、细胞株293A，腺病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞,生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。
三、包装细胞293A细胞的培养（一）293A细胞的冻存293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。
该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。
若细胞密度持续在70%以下，QBI-293A细胞则能连续培养3~4个月维持原有细胞特性。
若以购买得到的293A作为第一代，则30代内能得到最佳结果。
随着传代的次数增加，293A细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
腺病毒中文操作手册
腺病毒中⽂操作⼿册腺病毒载体操作⼿册中⽂版腺病毒重组系统AdEasyTM操作⼿册⽬录第⼀章简介13.2AdEasyTM系统中产⽣重组腺病毒的时程3第四章主要流程2 4第⼆章应⽤重组腺病毒的优点4.1技术3 将基因克隆⼊AdEasyTM转移载体4 第三章AdEasyTM4.1.13 3.1技术概况缩写英⽂全称中⽂全称AdAdenovirus腺病毒LBLuria-Bertani(broth)LB培养基MCSMultipleCloningSite5Ad5Adenovirusserotype5⾎清型腺病毒多克隆位点分钟腺病毒载体MinMinuteAdV AdenoviralVector AmpAmpicillin氨苄青霉素感染复数MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell) -半乳糖苷酶β-Galβ-GalactosidaseβRNA mRNAMessengerRNA信使MWCOMOIecularWeightCut-offbpBasePair碱基对PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresisBSABovineSerumAlbumin⼩⽜⾎清⽩蛋⽩聚丙烯凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液互补cDNAComplementaryDNADNADNA 闭环螺旋空斑形成单位PFUPlaqueFormingUnitcccDNAClosedCircularCoiledDNA CPECytopathicEffect细胞病理效应感染后piPostInfection CsClCesiumChloride氯化铯RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒培养基DMEMDulbecco'sModifiedEagleMediumDMEM RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复DMSODimethylSulfoxide⼆甲基亚砜SDSSodiumDodecylSulfate⼗⼆烷基硫酸钠⼄⼆胺四/⼆硫苏糖醇DTTDithiothreitol TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid⼄⼆胺四⼄酸⼄酸组织培养感染剂TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%溴化⼄锭EtBrEthidiumBromide量FBSFetalBovineSerum胎⽜⾎清TCPTotalCellularProtein细胞总蛋⽩⼩时HrHourITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复溶液TETris/EDTA TE 卡那霉素KanKanamycin wtWildType野⽣型溴千碱基对X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-kbKilobases半乳糖苷-3--4-氯吲哚-千道尔顿KDaKiloDaltons β-D-第⼀章简介当今基因输送技术的发展⽇趋复杂，⼀些治疗药物（⽣长激素、⼲扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋⽩（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更⾼效的基因输送⼯具。
小鼠尾静脉病毒、腺病毒、慢病毒注射操作步骤
小鼠尾静脉病毒(腺病毒、慢病毒)注射操作步骤小鼠尾静脉病毒(腺病毒、慢病毒)注射操作步骤1、固定建议自制了一个小圆筒，筒的直径正好容下一直小鼠，筒的一端是盲端，筒身上开了N个通气空，有一个后盖，后盖上留有一圆孔，正好容下尾巴。
由于小鼠有钻洞的习性，把它往筒口一放，自己就钻进去了，然后把尾巴从盖孔中穿过，盖上后盖即可。
找一张桌子，把尾巴压在桌边沿上，由于边沿是个直角，把尾巴的下1/3处压在直角上能使尾部暴露很好。
2、扩张血管小鼠尾静脉用热水泡一下或是用75％的酒精擦拭小鼠尾静脉，以使注射前使尾静脉充分充血扩张；或是在上方悬挂一灯泡，在适当距离烤尾静脉也可以使尾静脉充血扩张。
3、注射小鼠尾静脉共三根，一根背侧，另两根分置于两侧，腹侧是动脉。
每只小鼠病毒注射量：以下为建议，具体的注射量需要实验摸索纯化过腺病毒：1-5×109毒量注射(1)，比如纯化腺病毒滴度为1×1011PFU，则每只小鼠注射体积约为10-50ul。
浓缩慢病毒：1-5×107毒量注射，如慢病毒滴度为1×108PFU/ml，则小鼠理论上注射100-500ul，实际上每次注射体积有严格要求（见下方），所以如果量不够，需要分多次注射，每次注射至少间隔1-2天。
每只小鼠病毒注射体积：注射体积不要超过200ul，最好控制在100ul以下，注射剂量过多，也会发生充血性心衰。
关于注射针：一般小鼠尾静脉注射可采用1ml注射器，并更换为4号针头。
（不要用1ml注射器配套的针头，太大了！）建议选用胰岛素注射针（有大小容量，见下图，有很多厂家，图为BD的胰岛素针），可按需选择。
尾静大鼠四号针头300ul小鼠四号针头100ul注意：1.一开始最好从小鼠尾静脉的末端开始注射，如果在中前端注射一旦失败这样可以防止注射的数次失败后液体漏出。
2.注射时手上的感觉很重要，如果针头进入尾静脉，手上会有一种透空感，另外针头如果进入后，液体的推射会很顺利；如果，感觉液体推不进去，很费力，说明针头没有进入尾静脉，而是进入了周围的软组织。
腺相关病毒操作技巧——轻松入门
腺相关病毒操作技巧——轻松⼊门--您⾝边的病毒载体专家腺相关病毒操作⼿册AAV相关实验请在⽣物安全柜（BL-2级别）内操作。
01操作病毒时请穿实验服，佩戴⼝罩和⼿套，尽量不要裸露双⼿及⼿臂的⽪肤。
02操作病毒时特别⼩⼼病毒溅出。
如果操作时超净⼯作台有病毒污染，请⽴即⽤ 70%⼄醇加 1%的SDS溶液擦拭⼲净。
03接触过病毒的枪头、离⼼管、培养板、培养液请⽤84消毒液浸泡后统⼀处理。
04如需要离⼼，应使⽤密封性好的离⼼管，如有必要请⽤封⼝膜封⼝后离⼼。
05病毒相关的废弃物需要特殊收集，统⼀经⾼温灭菌处理。
06实验完毕后请⽤洗⼿液清洗双⼿。
07⼀、AAV安全使⽤注意事项AAV的储存＋收到病毒液后若在短期内使⽤，可将病毒放置于4℃保存（⼀周内使⽤完最佳）；如需长期保存请分装后放置于-80℃。
注：a．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融病毒滴度会降低10%-50%），因此在病毒使⽤过程中应尽量避免反复冻融。
汉恒⽣物已对病毒进⾏了分装（200 µl/tube），收到后请直接放置-80℃保存即可。
b．若病毒储存时间超过6个⽉，汉恒⽣物建议在使⽤前重新测定病毒滴度。
⼆、AAV储存与稀释的注意事项02三、AAV介绍四、汉恒⽣物AAV产品服务及载体信息与现货列表01⼀、AAV安全注意事项⼆、AAV储存和稀释注意事项08⼗、AAV滴度测定14⼗三、AAV病毒的使⽤15附录1参考⽂献06五、AAV整体实验流程六、实验材料09⼗⼀、AAV感染细胞测试⼗⼆、AAV⽤于动物实验（重磅⼲货，五星推荐）07七、AAV载体构建⼋、AAV包装九、AAV收集和纯化⽬录01腺相关病毒操作⼿册AAV的稀释＋需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使⽤培养⽬的细胞⽤⽆菌PBS或⽣理盐⽔混匀分装后置于4℃保存（⼀周内使⽤完最佳）。
●安全-AAV不参与任何疾病的发⽣，已经⽤于临床疾病的治疗；●⾼效-病毒滴度⾼达1013以上，组织感染能⼒超强；●表达周期久-AAV免疫原性超低，基因持续表达半年以上；●最全⾎清型-拥有全部⾎清型和⼀系列突变体亚型，⼏乎可以感染所有的组织和脏器；●组织特异性-拥有DIO元件载体系统和最全的组织特异性启动⼦⼯具箱，如⼼脏、肝脏、肌⾁以及各种神经元特异的启动⼦等；●病毒产品全部经过⽆菌、⽆⽀原体、⽆内毒素检测，让实验安全放⼼。
siRNA 中文操作手册(lipo2000)
THE RNAi COMPANYRNAi 产品使用手册上海吉玛制药技术有限公司Shanghai GenePharma Co.,Ltd.Ⅰ. RNAi 简介 1A. RNAi 实验原理B. RNAi 实验流程C. RNAi 实验所需试剂D. 上海吉玛 RNAi 相关产品Ⅱ. siRNA设计7A. 哺乳动物siRNA设计B. 上海吉玛 siRNA 产品特性C. siRNA oligo 技术数据Ⅲ. siRNA 对照9A. 普通阴性对照B. 荧光标记的阴性对照C. siRNA阳性对照D. 转染试剂对照E. 避免off-target对照Ⅳ. siRNA 转染10A.siRNA 转染的方法B.Lipofectamin2000 转染试剂C.Lipofectamin2000适用的细胞类型D.转染前细胞培养E.Lipofectamin：siRNA/DNA比例F.贴壁细胞转染程序G.悬浮细胞siRNA转染程序H.DNA和siRNA共转染细胞程序I. 体内siRNA导入方法J. siRNA转染常见问题与建议Ⅴ. mRNA水平RNAi效果监测15A. siRNA细胞转染条件优化B. Real-Time PCR RNAi 效果检测C. Real-Time PCR 结果分析Ⅵ. 蛋白质水平RNAi效果监测20A. western-blot原理B.western-blot操作步骤wC.estern-blot上样液的制备D.western-blot常用试剂的配制Ⅶ. RNAi实验常见问题解答22Ⅰ. RNAi 简介A. RNAi实验原理RNA干扰（RNA interfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。
细胞中的核糖核酸酶III家族成员之一的，dsRNA特异性的核酸酶Dicer将dsRNA裂解成由21-25个核苷酸组成的小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)，随后siRNA作为介导子引起特异性地降解相同序列的mRNA，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。
腺病毒操作手册
Shanghai GeneChem Co. Ltd 重组腺病毒操作手册(Version 2.0)上海吉凯基因技术有限公司 二〇〇九年二月地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720 弄 1 号 408 室 电话：86-21-51320189 网址： 邮编：201203 传真：86-21-51320179 Email：service@Page 1 of 4 Shanghai GeneChem Co. Ltd 重组腺病毒实验系统腺病毒是一种的线型双链 DNA 无包膜病毒， 它的 DNA 和核心蛋白形成的内核， 蛋白外壳 是直径约 80nm 的正二十面体，由 240 个六 面体和 12 个位于正二十面体顶部的五面体 构成。
Genechem 重组腺病毒系统是将携带外源基 因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒基因组的 包装质粒共转染 HEK293 细胞， 通过 Cre/loxP 系统的作用实现重组，产生重组腺病毒。
重组腺病毒能够表达较大的外源基因片段， 感染分裂和非分裂细胞，具有广泛的宿主。
GFP-adenovirus 感染的代表细胞――腺病毒可以感染绝大多数细胞TCA8113SGC-7901NRKPC-3Huh-7GliaRabbit Mesenchymal Stem CellsHuman Mesenchymal Stem CellRat Cardiac Fibroblasts地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720 弄 1 号 408 室 电话：86-21-51320189 网址： 邮编：201203 传真：86-21-51320179 Email：service@Page 2 of 4 Shanghai GeneChem Co. Ltd 重组腺病毒操作过程一, 注意事项:1. 操作病毒时请尽量使用生物安全柜。
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腺病毒中文操作手
册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统
AdEasyTM操作手册
目录
第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 4
4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体5
4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生5
4.2.1 共转化的一般原则 5
4.2.2 共转化方法 5
4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6
4.4.1 细胞铺板 6
4.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常见技术8
5.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞9
5.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定10
5.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12
5.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14
5.5.6 免疫测定14
5.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定18
5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19
5.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答22
6.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24
6.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表示26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定 27
缩写英文全称中文全称
Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清
白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNA cccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNA CPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点
Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNA MWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位
pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose
50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷
第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。
为解决这一问题，基因输送技术(一般使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒)经过基因工程不断发展，致力于生产基因表型药物。
重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。
1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。
迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒，它们一般感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields等，1996）。
1977年，Frank Graham博士建立了一种细胞株，可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒（Graham等，1977）。
此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广泛应用，特别是在基因治疗相关领域。
迄今为止已有大量关于腺病毒及其应用的综述发表，我们给感兴趣的读者推荐以下文章：Hitt et al，1999和Wivelet al，1999。
腺病毒亦可被用来在人体细胞中过量表示蛋白（Massie et al，1998 A, B）。
但迄今为止还只有熟知腺病毒的研究人员才会采用腺病毒系统。
昆腾生物科技公司是第一个提供完备而且能广泛应用的重组腺病。