腺病毒中文操作手册
GENMED小量腺病毒沉淀法纯化试剂盒 产品说明书(中文版)
GENMED SCIENTIFICS INC. U.S.A GMS60071.1 v.A GENMED小量腺病毒沉淀法纯化试剂盒产品说明书（中文版）主要用途GENMED小量腺病毒沉淀法纯化试剂是一种旨在通过非离子去垢剂裂解细胞，然后化学沉淀的技术处理，以获得不含宿主细胞裂液中任何成分包括残余蛋白和核酸的高纯度腺病毒的权威而经典的技术方法。
该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。
其适用于野生型腺病毒、腺病毒相关病毒（AA V）、各种亚型的腺病毒以及其它实验用病毒等的纯化。
可以直接用于扩增分析、西方杂交分析、基因疫苗和基因疗法等各种后续实验。
产品即到即用，性能稳定，严格无菌，无核酶污染，操作简便，产物纯度极高，重复性好，回收效率高达99％。
技术背景感染复数（multiplicity of infection；MOI），即平均每个细胞感染病毒的数量，决定病毒效价（滴度）。
通常人胚胎视网膜911细胞或人胚肾293细胞的MOI为5－10 PFU/细胞。
化学沉淀技术是理想的快速纯化小量或大量腺病毒的方法。
其腺病毒回收效率达99％，纯度达80％以上。
尤为重要的是其操作安全，无需超速离心、核酶使用、树脂处理，可以获得优于其它提取方法的高度纯化的腺病毒产物。
产品内容GENMED裂解液（Reagent A）毫升GENMED沉淀液（Reagent B）毫升GENMED保存液（Reagent C）毫升GENMED过滤柱套产品说明书1份保存方式保存GENMED保存液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月用户自备50毫升锥形离心管：用于样品操作的容器台式离心机：用于沉淀感染细胞涡旋震荡仪：用于混匀微型台式离心机：用于分离腺病毒实验步骤1．根据细胞的MOI，计算用于病毒感染所需的细胞数，要求总量达到VP2．准备适量的（5至10个）cm2细胞培养瓶的细胞铺板3．直至生长到％铺满率4．病毒感染5．感染后天，显微镜观察：细胞呈现圆形，％细胞脱落6．小心移取所有培养瓶的细胞培养液到毫升锥形离心管7．放进 ℃台式离心机离心分钟，速度为g8．小心抽掉上清液9．用细胞刮脱棒分别刮下所有细胞培养瓶的细胞10．全部合并到到个毫升锥形离心管11．放进 ℃台式离心机离心分钟，速度为g12．小心抽去上清液13．加入毫升GENMED裂解液（Reagent A）14．涡旋震荡秒15．室温下静置分钟16．加入微升GENMED沉淀液（Reagent B）到细胞悬液底部17．涡旋震荡秒18．移取微升细胞悬液到GENMED过滤柱19．放进 ℃微型台式离心机离心分钟，速度为g（或RPM；例如eppendorf 5415）20．小心取出GENMED过滤柱21．继续移取剩余微升上述细胞悬液到GENMED过滤柱22．放进 ℃微型台式离心机离心分钟，速度为g（或RPM；例如eppendorf 5415）23．扔掉GENMED过滤柱24．加入微升GENMED保存液（Reagent C），混匀25．放进℃冰箱里保存注意事项1．本产品为10次操作2．所有操作均须无菌状态下进行3．操作时，须戴手套4．严格遵守病毒操作安全规范5．操作时使用的枪头须使用带滤芯的枪头6．GENMED沉淀液（Reagent B）配比优化7．纯化病毒产物，避免反复冻融8．病毒效价（滴度）取决于感染量和感染复数9．本公司提供系列腺病毒试剂产品和外包服务质量标准1．本产品经鉴定性能稳定2．本产品经鉴定无核酶污染3．本产品经鉴定纯化程度高4．本产品经鉴定无宿主细胞污染杰美基因秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。
腺病毒中文操作手册
腺病毒中文操作手册腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 44.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生54.2.1 共转化的一般原则 54.2.2 共转化方法 54.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 64.4.1 细胞铺板 64.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常见技术85.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞95.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定105.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增125.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定145.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答226.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组246.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表示26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定 27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNA cccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNA CPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNA MWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
上海杰美基因医药 GENMED 重组腺病毒转染试剂盒产品说明书(中文版)
上海杰美基因医药科技有限公司杰美品牌大师品质GMS60036 v.A GENMED重组腺病毒转染试剂盒产品说明书（中文版）主要用途GENMED重组腺病毒转染试剂是一种旨在通过强烈的阳离子脂质体介导载体，帮助腺病毒基因组质粒或腺病毒载体穿梭质粒DNA轻易通过病毒包装细胞的权威而经典的技术方法。
该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。
其适用于各种病毒质粒DNA（例如pJM17或pBHG10等）转入多种类型的贴壁型病毒包装培养细胞系（例如人胚胎视网膜911细胞或人胚肾293细胞等）。
可以被用于稳定转染或暂态转染。
产品严格无菌，即到即用，无核酶污染，配比优化，操作简捷，性能稳定，转染效率明显。
技术背景LipofusinX为带有精胺基团强负电性的脂质体介导载体，其基团具有超强的穿膜能力，血清干扰因素无损于携带外源性DNA高效进入细胞内。
产品内容GENMED清理液（Reagent A） 毫升GENMED转染液（Reagent B） 微升GENMED强化液（Reagent C） 微升GENMED保存液（Reagent D） 毫升产品说明书 1份保存方式保存在4℃冰箱里，有效保证6月用户自备质粒DNA：用于转染的目标DNA病毒包装细胞（例如911细胞或293细胞等）：用于目标DNA转染的宿主细胞1.5毫升离心管：用于转染液和DNA操作的容器胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于细胞脱离完全细胞培养液（GMS12052）：用于转染后的细胞培养实验步骤转染实验开始前，移取微升GENMED清理液（Reagent A）到无菌的毫升离心管，然后加入微升GENMED转染液（Reagent B），再加入微升GENMED强化液（Reagent C），用微升枪头轻轻上下抽吸混匀，成为转染工作液。
然后进行下列操作。
1．准备个cm2细胞培养瓶里的病毒包装细胞（例如911细胞或293细胞等）2．在转染前小时，用胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液脱离细胞一次3．细胞铺满率达％（细胞）4．移取微升GENMED清理液（Reagent A）到无菌的毫升离心管5．方法一：（双质粒共转染）分别加入微升用户需转染的腺病毒载体穿梭质粒DNA（微克）和微升腺病毒基因组质粒DNA（微克），用微升枪头轻轻上下抽吸混匀方法二：（单一线性质粒转染）加入微升用户需转染的重组腺病毒线性载体DNA（微克），用微升枪头轻轻上下抽吸混匀6．用微升枪头一滴一滴缓慢加入DNA混匀物到转染工作液里，再用枪头轻轻上下抽吸混匀7．混匀后，在室温下静置分钟，期间轻轻混匀数次8．同时小心抽掉细胞培养瓶里的培养液9．轻轻加入毫升℃预热的GENMED清理液（Reagent A）10．即刻小心抽掉GENMED清理液（Reagent A）11．重复实验步骤和一次12．轻轻加入毫升GENMED清理液（Reagent A）到培养瓶里13．轻轻混匀含有DNA的转染工作液，即刻轻轻缓慢加入微升到细胞培养瓶里14．轻轻摇动细胞培养瓶，使其混匀15．放进℃细胞培养箱，孵育小时（注意：参见注意事项9）16．小心抽掉含有DNA的转染工作液（注意：参见注意事项10和11）17．加入毫升用户自备的完全细胞培养液18．放进℃细胞培养箱，孵育过夜19．以后每隔天小心抽掉细胞培养瓶里的培养液20．小心加入至毫升用户自备的完全细胞培养液21．转染后天，刮下细胞培养瓶里的细胞22．移入到毫升锥形离心管23．放进台式离心机离心分钟，速度为g24．小心抽去上清液25．加入毫升GENMED保存液（Reagent D）26．放进℃冰箱里保存或即刻进行病毒上清制备以及后续感染注意事项1．本产品为10次操作量2．整个操作须无菌操作3．操作时，须戴手套4．注意病毒操作安全5．操作时使用的枪头须使用带滤芯的枪头6．建议使用高度纯化且无内毒素的载体DNA7．建议一次操作，同时进行5个以上25cm2细胞培养瓶的转染，确保足够获得重组腺病毒量8．根据用户实际情况，建议使用空载体对照或报告基因标记对照9．孵育时建议将培养瓶密封，以防或避免转染工作液蒸发10．更换液体时，须小心，以防细胞松动或脱落11．如果转染孵育后，出现较多细胞松动和脱落，直接加入5毫升用户自备的完全细胞培养液，继续孵育24小时后，进行更换12．通常转染后2周内，不会出现明显的空斑形成或细胞病理效应（CPE）13．本产品提供的成分配比优化14．如果转染不理想，可以适当调整转染液、强化液和DNA用量15．本公司提供系列腺病毒试剂产品和外包服务质量标准1．本产品经鉴定性能长期稳定2．本产品经鉴定转染效率高使用承诺杰美基因秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1第二章应用重组腺病毒的优点 2第三章AdEasyTM 技术 33.1 技术概况33。
2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3 第四章主要流程 44。
1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体44.1。
1 克隆的一般原则44。
1.2 构建重组AdEasyTM转移载体54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生54。
2.1 共转化的一般原则54。
2。
2 共转化方法54.2.3 预期结果54.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增64。
4 AdEasyTM重组子转染QBI—293A细胞6 4.4。
1 细胞铺板64。
4。
2 磷酸钙转化技术7第五章常用技术85。
1 QBI-293A细胞培养85.1。
1 QBI—293A细胞的初始培养85。
1.2 QBI—293A细胞的维持培养和增殖8 5。
1.3 QBI-293A细胞的冻存85.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2。
1 感染QBI—293A细胞95。
2.2 病毒空斑形成95.2。
3 琼脂糖覆盖被感染细胞95.3 MOI测定105.4 腺病毒感染力测定105。
4.1 X-Gal染色11 5。
5 重组腺病毒的筛选和纯化115。
5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送11 5.5。
2 病毒空斑挑选和小量扩增125.5。
3 Western杂交135.5.4 Southern杂交和点杂交135.5.5 病毒裂解产物PCR 145。
5。
6 免疫测定145。
5。
7 功能测定145.6 病毒颗粒在QBI—293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5。
7.1 不连续密度梯度离心175.7。
2 连续密度梯度离心175.7。
3 病毒溶液去盐和浓集175。
8 病毒滴度测定185。
8。
1 O。
D。
260 nm (VP/ml) 195。
8。
重组腺病毒构建的标准操作规程
重组腺病毒构建的标准操作规程（编号：048）1、目的及适用范围该SOP用于规范真核细胞表达重组蛋白的操作。
2、主要仪器及试剂电转仪、Adeasy-1系统（穿梭载体pshuttle-cmv,pAdtrack-CMV）、骨架病毒（pAdeasy-1）、重组菌（BJ5183感受态）、包装细胞（293A）、Taq酶。
限制性内切酶、碱裂解法提取质粒溶液I、II、III、酚、氯仿3、操作步骤3.1目的基因的克隆：引物设计时要GOI中有没有Pme I/EcoRI和PacI酶切位点。
3.1.1通过限制酶切分析/PCR/基因测序确认GOI克隆到穿梭载体，翻译方向跟启动子方向相同。
3.1.2如果采用pShuttle 或pAdTrack，必须提供启动子和多聚腺苷酸信号。
所有的穿梭载体必须包括一个Kozak 信号序列。
3.1.3因为在转化和转染前，用Pme I/EcoRI和PacI酶，所以要避免GOI中有这些酶的酶切位点。
如果有PacI酶酶切位点，建议通过点突变除去。
3.1.4如果表达多个基因，避免头对头的方向，采用头尾相接的方式。
3.1.5建议在穿梭载体中，通过瞬时转染检测GOI的表达。
3.2制备电转 BJ5183 感受态细胞：BJ5183为链霉素抗性，固体和液体LB加终浓度为30μg/mL 的链霉素培养。
划线培养、挑单菌落摇床培养，转接到200-300mL液体培养基中，37℃摇床培养至A550约0.8，转移到无菌离心管中冰浴10～30min，4℃3000rpm离心10min，用50mL灭菌的超纯水配制的10%甘油重悬,重复两次离心重悬，4℃3000rpm离心10min，用10mLWB重悬，4℃3000rpm离心10min最后用0.5mL重悬。
分装20μL/管，-80℃冻存。
3.3用卡那抗性培养基培养2mL含有GOI穿梭质粒的细菌培养过夜。
提取质粒DNA。
推荐使用碱裂解法提取质粒，保证穿梭质粒的完整性可以提高在BJ5183细菌中重组的效率。
吉玛重组腺病毒操作手册说明书
如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：************************** E-mail：************************吉玛重组腺病毒操作手册GenePharma Recombinant Adenovirus Operation Manual2017 年 6 月如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：**************************E-mail：************************目录一、产品简介 (4)二、腺病毒载体优势 (4)三、生物安全性 (5)3.1安全性 (5)3.2实验室安全措施 (5)四、流程描述 (6)五、材料与仪器 (7)5.1实验材料 (7)5.1.1细胞株 (7)5.1.2质粒 (7)5.1.3试剂 (8)5.2实验耗材及仪器 (8)5.2.1耗材 (8)5.2.2仪器 (9)六、具体步骤 (9)6.1细胞培养 (9)6.1.1活细胞计数 (9)6.1.2细胞株的冻存 (9)6.1.3细胞复苏 (10)6.1.4细胞传代 (10)6.2病毒包装 (10)6.3病毒收集 (11)6.4病毒扩增 (12)6.5病毒纯化 (12)6.6病毒重悬和保存 (13)6.7病毒滴度检测 (13)七、使用方法 (14)如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：************************** E-mail：************************重组腺病毒在细胞水平使用 (14)7.1病毒滴度复核（有限稀释法测定） (14)7.2靶细胞感染预实验 (16)7.3正式试验 (18)八、运输和储存 (18)九、常见问题及解决方案 (19)十、吉玛案例 (20)十一、附录 (21)如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：************************** E-mail：************************一、产品简介腺病毒(Adenovirus，Adv)是一种线性双链DNA 病毒。
腺病毒防治知识宣传手册
腺病毒防治知识宣传手册1. 什么是腺病毒？腺病毒是一种DNA病毒，在自然界中分布广泛。
易引起人体呼吸、消化和泌尿等多系统感染，以呼吸道感染较为常见。
目前已知的人腺病毒有A-G共7个组，60多个血清型。
55型腺病毒是由人11型和14型腺病毒重组产生的新型病毒，属于B组B2亚组，普通人群因缺乏免疫力，所以普遍易感。
2. 腺病毒有什么危害？腺病毒引起的急性呼吸道感染、急性角膜结膜炎等可导致人群暴发或流行。
病人多以轻症为主，表现出发热、咳嗽、咽痛、头痛和全身不适等症状，少数有恶心、腹泻。
大部分经过治疗后能够康复。
3. 什么季节易出现55型腺病毒感染暴发流行？冬春季节气温较低，人群多在室内活动，环境相对密闭，通风不畅，易于病毒传播。
因此，冬春季容易出现55型腺病毒感染暴发流行。
4. 腺病毒的传染源是什么？腺病毒感染者和隐性感染者是主要传染源。
潜伏期一般3～8天，潜伏期末至发病急性期传染性最强。
5. 人是如何感染腺病毒的？主要通过空气飞沫传播，如病人打喷嚏或咳嗽传染给健康人。
密切接触（手-鼻）传播也是重要传播途径，如用脏手揉眼睛、鼻子等也可感染。
6. 哪些人容易感染腺病毒？各个年龄人群均可感染腺病毒，但婴幼儿、老年人以及免疫功能低下者较容易感染。
集体生活的幼儿、学生或新兵由于生活环境封闭聚集也容易发生群体性感染。
7. 腺病毒有什么药物可以预防和治疗？疫苗预防：4型和7型腺病毒有口服疫苗，效果较好。
但近年流行的55型腺病毒是一种新型重组病毒，目前尚无针对性疫苗。
药物治疗：目前无特效治疗腺病毒的药物，可口服抗病毒类药物进行预防。
发病后主要采取对症治疗。
8. 55型腺病毒感染与普通感冒、流行性感冒有什么不同？55型腺病毒感染多引起肺部改变，普通感冒多伴有明显的鼻塞、流涕、打喷嚏等上呼吸道症状，胸片无异常，可区别于55型腺病毒感染。
流感多有发热、头痛、乏力，伴肌肉酸痛等全身症状，与55型腺病毒感染不易区分，需经实验室检测确诊。
ips操作指南-腺病毒版本
IPS操作指南第四版IPS操作指南--腺病毒版本IPS简介：iPS细胞是通过基因转染技术（gene transfection）将某些转录因子导入动物或入的体细胞使，体细胞直接重构成为胚胎干细胞（embryonic stemcell,ESC）细胞样的多潜能细胞。
现在大多是通过病毒携带特定的转录因子进入体细胞内，来获得多能性干细胞。
2006年日本京都大学Shinya Yamanaka在世界著名学术杂志《细胞》上率先报道了诱导多能干细胞的研究。
他们把Oct3/4,Sox2、c-Myc和Klf4这四种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。
用Retrovirus、Lentivirus诱导IPS成功的例子已经非常多，但是由于retrovirus和lentivirus的基因组整合性，往往伴随基因组的破坏与癌化。
用Lentivirus和retrovirus 建立的IPS子宫移植繁衍而成的克隆鼠往往都伴随着肿瘤的高发生率。
Adenovirus（腺病毒）是一类滴度极高，不整合基因组，可以简单实现高效感染的病毒载体，近年来以Adenovirus介导的IPS诱导已被证实成功且安全。
一、实验材料腺病毒OSKM四因子：Ad-OCT4、Ad-SOX2、Ad-KLF4和Ad-c-MYC；病毒扩增细胞：293A细胞；ES Feeder细胞：MEF（C57）。
二、实验仪器和耗材（一）实验仪器二级安全柜、37度培养箱、4度冰箱、液氮储存器、倒置显微镜、低温离心机。
耗材PBS、无菌水、明胶粉、DMEM培养基、FBS、非必须氨基酸、β-巯基乙醇、胰酶、血清替代物（SR）、mTESR1、T75培养瓶、无菌水、15ml离心管、50ml离心管，巴氏管等。
三、ips诱导方法（一）Feeder细胞1、Feeder细胞的分离（MEF）取妊娠13.5-14.5d的孕鼠，在无菌情况下取出胎鼠，去除鼠头，尾，四肢及内脏，然后用PBS进行冲洗。
miRNA腺病毒操作手册-推荐下载
miRNA腺病毒操作手册miRNA简介MicroRNAs（miRNAs）是一类长度为18-24个核苷酸的非编码RNA分子。
MiRNA通过与靶基因mRNA上的互补序列结合，降解mRNA或抑制mRNA的翻译。
MiRNAs在细胞分化、增殖、凋亡和癌细胞发生中发挥重要的调控作用。
MiRNAs 来源于具有60-80 个核苷酸茎环结构的microRNA 前体（premir）和序列更长一些的microRNA初级转录产物（primir）。
MiRNA在核内由RNA聚合酶II（polII）转录生成，最初产物primir具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴。
ViGene生物的mirAD-腺病毒microRNA前体表达系统包括三个相关产品：microRNA前体穿梭载体、microRNA前体腺病毒载体和预制microRNA前体腺病毒。
microRNA前体腺病毒简介重组腺病毒是进行基因转移和表达的工具，功能强大且易于操作。
腺病毒独特的生物学特征使它成为“载体的首选”，被科研工作者广泛应用。
首先，它能够感染包括分裂、非分裂细胞和干细胞在内的多种细胞。
第二，病毒滴度高。
第三，高滴度的病毒可获得高感染效率和高表达量。
第四，病毒进入细胞后，病毒基因组不整合到细胞染色体上，因此瞬时表达外源基因的重组腺病毒不会诱导宿主细胞中染色体的变化。
ViGene生物选用的是应用最广泛的复制缺陷型的人类血清5型腺病毒，该腺病毒载体缺失E1和E3基因。
E1 基因在组装感染性病毒颗粒时必不可少，可在HEK293T细胞病毒包装过程中得到补充，而E3基因可有可无。
由于E1和E3基因的缺失，腺病毒载体可插入高达7.5kb的外源基因。
pMir-microRNA precursor 是基于microRNA 前体表达系统的质粒。
microRNA前体天然的茎环结构被克隆到质粒的SgfI和MluI双酶切位点。
为了保持推测的发卡结构和诱导正确的内源性反应，miRNA茎环结构的两侧具有它的150-200bp的天然序列。
腺相关病毒操作手册
腺相关病毒操作手册一、腺相关病毒（Adeno-Associated Viral Vector，AAV）简介腺相关病毒属微小病毒科(parvovirus)，为无包膜的单链线状DNA病毒。
AA V的基因组约4700bp，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由145个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。
基因组中有3个启动子(P5、P19和P40)和2个开放阅读读框(ORF)，rep和cap，如图1所示。
rep编码4个重叠的多功能蛋白，即Rep78、Rep68、Rep52和Rep40，其中Rep78与Rep68参与AA V的复制与整合，Rep52和Rep40具有解螺旋酶和ATP酶活性，与Rep78、Rep68共同参与单链基因组的复制；cap编码的VP1、VP2、VP3是装配成完整病毒所需要的衣壳蛋白，它们在AA V病毒整合、复制和装配中其重要作用。
图1.AA V基因结构二、腺相关病毒的优点1.安全性高：迄今从未发现野生型AA V对人体致病，重组AA V基因组序列上去除了大部分的野生型AA V基因组元件，进一步保证了安全性；2.免疫原性低：AA V2的基因组仅4681个核苷酸，便于用常规的重组DNA技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小；3.宿主范围广：能感染分裂细胞和非分裂细胞；4.表达稳定：能介导基因的长期稳定表达；5.物理性质稳定：在60℃不能被灭活，能抗氯仿；（汉恒--AAV包装）三、重组腺相关病毒载体系统简介AAV是一种复制缺陷型微小病毒，其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。
AAV无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System）可以在无辅助病毒的条件下生产出重组腺相关病毒。
在AAV Helper-Free System中，生产具有感染性的AAV病毒颗粒所需的腺病毒基因产物（如：E2A，E4等基因）大部分由pHelper质粒提供，其余的腺病毒基因产物由稳定表达腺病毒E1基因的AAV-293宿主细胞提供。
腺病毒包装操作手册
汉恒重组腺病毒操作手册目录腺病毒安全使用和注意事项腺病毒储存与稀释的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、腺病毒包装和浓缩四、重组腺病毒滴度（PFU）的测定五、重组腺病毒感染目的细胞六、重组腺病毒用于动物实验附1：汉恒生物腺病毒载体附2：腺病毒感染细胞最佳MOI的摸索（表达荧光的病毒） 附3：汉恒生物常见三种病毒感染目的细胞比较腺病毒安全使用和注意事项➢腺病毒安全使用注意事项（*非常重要*）1) 腺病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。
2) 操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。
3) 操作病毒时需要特别小心病毒溅出。
如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加 1%的SDS溶液擦拭干净。
4) 接触过病毒的枪头、离心管、培养板及培养瓶请用84消毒液浸泡后统一处理。
5) 如实验过程中需要离心，应使用密封性好的离心管，必要时请用封口膜封口后离心。
6) 病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌后处理。
7) 实验完毕后请用香皂清洗双手。
➢腺病毒储存与稀释的注意事项1）腺病毒的储存收到病毒液后若在短期内使用，可将病毒放置于 4℃保存（一周内使用完最佳）；如需长期保存请分装后放置于 -80 ℃ 。
注：a.反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会使病毒滴度降低10%~50%），因此在病毒使用过程中尽量避免反复冻融。
汉恒生物对病毒已进行分装（200 μl/tube），收到后请直接放置-80℃冰箱保存即可。
b.若病毒储存时间超过6个月，汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度（参见附表2-慢病毒滴度测定方法）。
2）腺病毒的稀释需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用PBS或培养目的细胞用的无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于 4℃保存(一周内使用完最佳)。
重组腺病毒是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。
自噬双标腺病毒使用指南
自噬双标腺病毒（HBAD-mRFP-GFP-LC3）使用指南汉恒生物科技（上海）有限公司目录背景： (1).病毒实验操作注意事项 (2).收到病毒后的处理 (2)HBAD-mRFP-GFP-LC3 腺病毒的操作 (3).腺病毒感染细胞预实验（MOI的摸索） (3).感染目的细胞 (5)（一）细胞准备 (5)（二）病毒感染 (5)I、贴壁细胞 (5)II、特殊细胞 (6)（三）观察感染情况 (6)（四）结果分析与统计 (6).参考文献： (9)附录1 (10)附录2 实验室病毒操作应急预案 (11)背景：自噬是细胞内的一种“自食（Self-eating）”的现象，凋亡是“自杀（Self-killing）”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白，但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚。
自噬是指膜（目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或双层）包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新。
目前文献对自噬过程进行观察和检测常用的策略和手段有：通过western blot检测LC3的剪切；通过电镜观测自噬体的形成；在荧光显微镜下采用GFP/RFP-LC3等融合蛋白来示踪自噬体形成以及降解。
近几年对自噬流的研究日趋增多，针对于此我们汉恒生物科技（上海）有限公司自主研发了用于实时监测自噬(流)的mRFP-GFP-LC3腺病毒，mRFP 用于标记及追踪LC3，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP 荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。
这种串联的荧光蛋白表达载体系统直观清晰的指示了细胞自噬流的水平，是我们研究自噬尤其是自噬流发生的不可或缺的利器。
病毒实验操作注意事项1）病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。
通用腺病毒骨架载体pAdEasy-1产品说明书中文版主要用途
通用腺病毒骨架载体（pAdEasy-1）产品说明书（中文版）主要用途通用腺病毒骨架载体（pAdEasy-1）是一种与穿梭载体在特定细菌中同源重组构建产生重组腺病毒的改造型人腺病毒5型的主干基因分子。
适用于病毒感染性基因疗法的载体。
产品即到即用，性能稳定，重组保证。
技术背景pAdEasy-1腺病毒骨架载体含有人腺病毒5型的大部分基因组，去除E1和E3病毒基因，旨在提供外源性DNA 插入整合，同时避免病毒自我复制。
其中E1基因的剔除，使病毒在宿主细胞内失去DNA复制能力，而不能产生传染性病毒颗粒；E3基因的剔除，可以避开宿主的免疫反应。
pAdEasy-1为33.5kb，具有氨苄青霉素抗性，一旦与穿梭载体重组，其抗性消失。
同时具有内切酶Pac1和Cla1的位点。
产品内容载体液（Reagent A）（100纳克/微升）5微升产品说明书1份保存方式保存在－20℃冰箱里，有效保证6月用户自备BJ5183：用于载体转化重组的宿主细胞实验提示1．通常1次转化用量为100纳克2．使用BJ5183进行转化后重组3．建议和线性穿梭载体（1微克）共转染4．建议使用电转为优先5．转化后细菌培养不宜在BJ5183里超过20小时6．转化后的阳性细菌菌落通常比正常菌落小三分之一注意事项1．本产品为5微升（500纳克）规格2．操作时，须戴手套3．严格无菌操作4．载体转化后的菌落越小，转染阳性可能性越高；BJ5183的转化效率通常较之其它细菌要高5．转染的载体越大，转化效率越低，载体拷贝数越低，菌落后续培养越慢；大于40kb的载体，其琼脂平板上的菌落阳性率至多为20％6．不能使用常规质粒抽提方法提取载体；建议使用煮沸法质粒/柯斯质粒DNA快速抽提试剂盒－HL60004，既适合大型质粒提取，又避免质粒切口产生7．使用Pac1（50单位）进行酶切鉴定，其电泳条带为30kb和3kb（或4.5kb）8．pAdEasy-1腺病毒骨架载体基本信息如下：9．本公司提供系列腺病毒试剂产品质量标准1．本产品经鉴定性能稳定2．本产品经鉴定重组保证。
(整理)腺病毒载体操作手册1407-R2
腺病毒载体操作手册一、实验流程制备腺病毒穿梭质粒，分别高纯度无内毒素抽提腺病毒穿梭质粒和骨架质粒，共转染293A细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养十几天，在中间四五天左右更换一次新鲜培养基，然后收集细胞和1ml培液置于15ml离心管后，液氮/37度冻融三次（冻-融要彻底），2000rpm离心5分钟，取上清即为病毒液初代原液。
连续三代反复扩增收集病毒后，行病毒的大量扩增，然后通过CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。
二、实验材料（一）腺病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒（包括pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBAd-U6-GFP, pHBAd-U6-RFP）和骨架质粒pBHGlox（delta）E1,3Cre。
其中穿梭质粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和pHBAd-U6-GFP能表达绿色荧光蛋白（GFP）。
pHBAd-CMV-IRES-RFP和pHBAd-U6-RFP能表达红色荧光蛋白（RFP）。
1、载体信息1) 腺病毒克隆载体图谱如下：各载体用途如下表：2）骨架质粒信息如下：2、细胞株293A，腺病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞,生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。
三、包装细胞293A细胞的培养（一）293A细胞的冻存293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。
该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。
若细胞密度持续在70%以下，QBI-293A细胞则能连续培养3~4个月维持原有细胞特性。
若以购买得到的293A作为第一代，则30代内能得到最佳结果。
随着传代的次数增加，293A细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
小鼠尾静脉病毒、腺病毒、慢病毒注射操作步骤
小鼠尾静脉病毒(腺病毒、慢病毒)注射操作步骤小鼠尾静脉病毒(腺病毒、慢病毒)注射操作步骤1、固定建议自制了一个小圆筒，筒的直径正好容下一直小鼠，筒的一端是盲端，筒身上开了N个通气空，有一个后盖，后盖上留有一圆孔，正好容下尾巴。
由于小鼠有钻洞的习性，把它往筒口一放，自己就钻进去了，然后把尾巴从盖孔中穿过，盖上后盖即可。
找一张桌子，把尾巴压在桌边沿上，由于边沿是个直角，把尾巴的下1/3处压在直角上能使尾部暴露很好。
2、扩张血管小鼠尾静脉用热水泡一下或是用75％的酒精擦拭小鼠尾静脉，以使注射前使尾静脉充分充血扩张；或是在上方悬挂一灯泡，在适当距离烤尾静脉也可以使尾静脉充血扩张。
3、注射小鼠尾静脉共三根，一根背侧，另两根分置于两侧，腹侧是动脉。
每只小鼠病毒注射量：以下为建议，具体的注射量需要实验摸索纯化过腺病毒：1-5×109毒量注射(1)，比如纯化腺病毒滴度为1×1011PFU，则每只小鼠注射体积约为10-50ul。
浓缩慢病毒：1-5×107毒量注射，如慢病毒滴度为1×108PFU/ml，则小鼠理论上注射100-500ul，实际上每次注射体积有严格要求（见下方），所以如果量不够，需要分多次注射，每次注射至少间隔1-2天。
每只小鼠病毒注射体积：注射体积不要超过200ul，最好控制在100ul以下，注射剂量过多，也会发生充血性心衰。
关于注射针：一般小鼠尾静脉注射可采用1ml注射器，并更换为4号针头。
（不要用1ml注射器配套的针头，太大了！）建议选用胰岛素注射针（有大小容量，见下图，有很多厂家，图为BD的胰岛素针），可按需选择。
尾静大鼠四号针头300ul小鼠四号针头100ul注意：1.一开始最好从小鼠尾静脉的末端开始注射，如果在中前端注射一旦失败这样可以防止注射的数次失败后液体漏出。
2.注射时手上的感觉很重要，如果针头进入尾静脉，手上会有一种透空感，另外针头如果进入后，液体的推射会很顺利；如果，感觉液体推不进去，很费力，说明针头没有进入尾静脉，而是进入了周围的软组织。
腺相关病毒包装操作手册
hCHETA-EYFP pHBAAV-hSyneNpHR3.0-EYFP pHBAAV-hSynhChR2(H134R)-mcherry
启动子及其特点
CAG（人巨细胞病毒 启动子 CMV 和鸡 beta-actin 嵌合型启 动子），广谱，强
CMV（人巨细胞病毒启动 子），广谱，强
4) 汉恒生物 AAV-mRFP-GFP-LC3 自噬流监测工具（表 4）
载体 类型 双标 单标
载体名称
pHBAAV-mRFP-GFP-LC3 pHBAAV-GFP-LC3
启动子及其特点
CMV，广谱，强 CMV，广谱，强
标记基因
mRFP/GFP GFP
是否 Cre 依赖 否 否
五、整体实验流程（图 2）
图 1、 AAV2 基因组结构示意图。 四、汉恒生物 AAV 产品服务及载体信息与现货列表 1. 汉恒 AAV 产品分类：
常规基因的过表达和干扰定制（载体列表见“七、载体构建”部分）； 组织特异性启动子过表达定制（载体列表见“七、载体构建”部分）； 常规启动子和组织特异性启动子驱动的 AAV-Cas9 定制； AAV 介导的光遗传、化学遗传载体现货及改造服务等（见表 1）； 双标、单标 LC3 自噬流监测工具（见表 2）； 组织特异性 AAV-DIO 载体的定制（原理见附件 2）。 2. 汉恒 AAV 产品特点：
hChR2(H134R)-mcherry
mcherry
否
pHBAAV-GFAP-ArchT-
抑制
EYFP
否
EYFP
GFAP（星形胶质细胞特异
红光 激活
pHBAAV-GFAPC1V1 (t/t)-TS-mcherry
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1第二章应用重组腺病毒的优点 2第三章 AdEasyTM 技术 33.1 技术概况 33.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3第四章主要流程 44.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 44.1.1 克隆的一般原则 44.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 54.2.1 共转化的一般原则 54.2.2 共转化方法 54.2.3 预期结果 54.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞 64.4.1 细胞铺板 64.4.2 磷酸钙转化技术 7第五章常用技术 85.1 QBI-293A细胞培养 85.1.1 QBI-293A细胞的初始培养 85.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖85.1.3 QBI-293A细胞的冻存 85.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生95.2.1 感染QBI-293A细胞 95.2.2 病毒空斑形成 95.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 95.3 MOI测定 105.4 腺病毒感染力测定 105.4.1 X-Gal染色 11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化 115.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 115.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增 125.5.3 Western杂交 135.5.4 Southern杂交和点杂交 135.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定 145.5.7 功能测定 145.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 155.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 165.7.1 不连续密度梯度离心 175.7.2 连续密度梯度离心 175.7.3 病毒溶液去盐和浓集 175.8 病毒滴度测定 185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法 205.8.3 50%组织培养感染剂量法 20第六章疑难解答 226.1 QBI-293A细胞培养 226.2 感染力测定 226.3 转移载体克隆 236.4 在BJ5183细胞中共转化和重组 24 6.5 转染QBI-293A细胞 256.6 筛选和测定 256.7 在QBI-293A细胞中表达 266.8 重组腺病毒的扩增 266.9 纯化 266.10 病毒滴度测定 27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNA MWCO MOIecular Weight Cut-offPAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactop yranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1第二章应用重组腺病毒的优点 2第三章AdEasyTM 技术 33.1 技术概况33.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3 第四章主要流程 44.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体44.1.1 克隆的一般原则44.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生54.2.1 共转化的一般原则54.2.2 共转化方法54.2.3 预期结果54.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增64.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞6 4.4.1 细胞铺板64.4.2 磷酸钙转化技术7第五章常用技术85.1 QBI-293A细胞培养85.1.1 QBI-293A细胞的初始培养85.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存85.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞95.2.2 病毒空斑形成95.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞95.3 MOI测定105.4 腺病毒感染力测定105.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化115.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增125.5.3 Western杂交135.5.4 Southern杂交和点杂交135.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定145.5.7 功能测定145.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心175.7.2 连续密度梯度离心175.7.3 病毒溶液去盐和浓集175.8 病毒滴度测定185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法205.8.3 50%组织培养感染剂量法20第六章疑难解答226.1 QBI-293A细胞培养226.2 感染力测定226.3 转移载体克隆236.4 在BJ5183细胞中共转化和重组246.5 转染QBI-293A细胞256.6 筛选和测定256.7 在QBI-293A细胞中表达266.8 重组腺病毒的扩增266.9 纯化266.10 病毒滴度测定27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNA CPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNAMWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
腺病毒操作手册
Shanghai GeneChem Co. Ltd 重组腺病毒操作手册(Version 2.0)上海吉凯基因技术有限公司 二〇〇九年二月地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720 弄 1 号 408 室 电话：86-21-51320189 网址： 邮编：201203 传真：86-21-51320179 Email：service@Page 1 of 4 Shanghai GeneChem Co. Ltd 重组腺病毒实验系统腺病毒是一种的线型双链 DNA 无包膜病毒， 它的 DNA 和核心蛋白形成的内核， 蛋白外壳 是直径约 80nm 的正二十面体，由 240 个六 面体和 12 个位于正二十面体顶部的五面体 构成。
Genechem 重组腺病毒系统是将携带外源基 因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒基因组的 包装质粒共转染 HEK293 细胞， 通过 Cre/loxP 系统的作用实现重组，产生重组腺病毒。
重组腺病毒能够表达较大的外源基因片段， 感染分裂和非分裂细胞，具有广泛的宿主。
GFP-adenovirus 感染的代表细胞――腺病毒可以感染绝大多数细胞TCA8113SGC-7901NRKPC-3Huh-7GliaRabbit Mesenchymal Stem CellsHuman Mesenchymal Stem CellRat Cardiac Fibroblasts地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720 弄 1 号 408 室 电话：86-21-51320189 网址： 邮编：201203 传真：86-21-51320179 Email：service@Page 2 of 4 Shanghai GeneChem Co. Ltd 重组腺病毒操作过程一, 注意事项:1. 操作病毒时请尽量使用生物安全柜。
一步法检测鼻咽拭子呼吸道合胞病毒-腺病毒
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联系方式：010-58895646 020-32293178 传真：010-58895611 020-32293177 电子邮箱：info@ 网址： 仅供参考，请以原版英文说明书为准。
部质控
少 10 次，最好将样本彻底提取在溶液中。将棉签拭子
阴性
R
储存和稳定性
提出在试管壁上挤压，尽可能多的从棉签拭子中挤出液
体。之后丢弃棉签拭子。
试剂盒置于 2-30℃储存，检测卡可稳定至包装上所打印的
3. 加 3 滴试剂 B，用吸管混匀溶液至少 10 次。
有效日期。检测卡需在使用前一直保存在密封袋中。请勿冰 4. 只在使用前取出检测卡。
可形成不同的颜色线。不同抗原可根据这些不同颜色的线加 至室温。
以区别。混合物继续移动，通过固定在质控带区域的抗体， A、 鼻咽拭子标本的检测：
可显示一条绿色的色带。绿色线的存在显示：1）确认加入 1. 滴 10 滴试剂 A 并立即将棉签拭子放入试管内。
了足够量的样品，2）确认液体流向正确，3）作为试剂的内 2. 用力将棉签拭子在试管壁反复旋转挤压并混匀溶液至
表面上。 3. 用吸管混匀溶液至少 10 次，最好将样本彻底提取在溶
液中。 4. 从试管中准确加 5-6 滴或 200ul 液体到有明显箭头标记
的圆形窗口。 5. 10 分钟之内读取结果。
Card 质控区
加5滴
S
结果区
device (1)加 6 滴鼻 (2)滴加 3 (3)用吸管混匀溶
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腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1第二章应用重组腺病毒的优点 2第三章AdEasyTM 技术 33.1 技术概况33.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3 第四章主要流程 44.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体44.1.1 克隆的一般原则44.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生54.2.1 共转化的一般原则54.2.2 共转化方法54.2.3 预期结果54.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增64.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞6 4.4.1 细胞铺板64.4.2 磷酸钙转化技术7第五章常用技术85.1 QBI-293A细胞培养85.1.1 QBI-293A细胞的初始培养85.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存85.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞95.2.2 病毒空斑形成95.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞95.3 MOI测定105.4 腺病毒感染力测定105.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化115.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增125.5.3 Western杂交135.5.4 Southern杂交和点杂交135.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定145.5.7 功能测定145.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心175.7.2 连续密度梯度离心175.7.3 病毒溶液去盐和浓集175.8 病毒滴度测定185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法205.8.3 50%组织培养感染剂量法20第六章疑难解答226.1 QBI-293A细胞培养226.2 感染力测定226.3 转移载体克隆236.4 在BJ5183细胞中共转化和重组246.5 转染QBI-293A细胞256.6 筛选和测定256.7 在QBI-293A细胞中表达266.8 重组腺病毒的扩增266.9 纯化266.10 病毒滴度测定27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNA CPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNAMWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。
为解决这一问题，基因输送技术(通常使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒)通过基因工程不断发展，致力于生产基因表型药物。
重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。
1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。
迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒，它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields等，1996）。
1977年，Frank Graham博士建立了一种细胞株，可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒（Graham等，1977）。
此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广泛应用，尤其是在基因治疗相关领域。
迄今为止已有大量关于腺病毒及其应用的综述发表，我们给感兴趣的读者推荐以下文章：Hitt et al，1999和Wivelet al，1999。
腺病毒亦可被用来在人体细胞中过量表达蛋白（Massie et al，1998 A, B）。
但迄今为止还只有熟知腺病毒的研究人员才会采用腺病毒系统。
昆腾生物科技公司是第一个提供完备而且能广泛应用的重组腺病毒试剂盒Adeno-QuestTM系统及其相关产品和客户服务的公司，这个系统的基础是在293细胞中产生重组腺病毒。
现在介绍的AdEasyTM系统以细菌内重组取代哺乳动物细胞（He et al，1998），使获得重组腺病毒对任何有细胞培养设备的分子生物实验室都更方便。
重组腺病毒事实上可在任何细胞或组织中用来研究表达重组蛋白。
AdEasyTM转移载体可允许插入7.5kb的外源DNA，目前正研究腺病毒其它区的缺失以提高腺病毒在基因治疗中的应用。
这本手册提供了重组腺病毒技术中所有必须遵循的原则，并详细描述了产生一个重组腺病毒的所有实验步骤，包括重组腺病毒在QBI-293A细胞中扩增并纯化到1012VP的操作步骤。
AdEasyTM载体系统包含了生产5型重组腺病毒所需的全部试剂，所有成分购买后即可使用。
第二章应用重组腺病毒的优点1. 宿主范围广, 对人致病性低这套腺病毒载体系统可广泛用于人类及非人类蛋白的表达。
腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞，因此在大多哺乳动物细胞和组织中均可用来表达重组蛋白。
2. 在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因逆转录病毒只能感染增殖性细胞，因此DNA转染不能在非增殖细胞中进行，而必须使细胞处于持续培养状态。
腺病毒则能感染几乎所有的细胞类型，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞。
腺病毒是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统，它可以使转化细胞和原代细胞中得到的结果直接进行对比。
3. 能有效进行增殖，滴度高这套腺病毒系统可产生1010到1011VP/ml，浓缩后可达1013VP/ml，这一特点使它非常适用于基因治疗。
4. 无需辅助病毒，可容纳7.5 kb外源DNA：为提供克隆空间，此腺病毒缺失了E1和E3早期区。
此外，此腺病毒可包装比正常病毒DNA稍大的DNA分子（105%）。
这些特点允许插入腺病毒的基因或多基因表达盒可达7.5kb。
5. 与人类基因同源该腺病毒载体系统应用了人类病毒作为载体，以人类细胞作为宿主，因此为人类蛋白进行准确的翻译后加工和适当的折叠提供了一个理想的环境。
大多数人类蛋白都可达到高水平表达并且具有完全的功能。
6. 不整合到染色体中，无插入致突变性逆转录病毒可随机整合到宿主染色体，导致基因失活或激活癌基因。
而腺病毒则除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中，因此不会干扰其它的宿主基因。
在卵细胞中整合单拷贝病毒则是产生具有特定特征的转基因动物的一个较好的系统。
7. 能在悬浮培养液中扩增：293细胞可以适应悬浮培养，这一调整可使病毒大量扩增。
大量事实证明悬浮293细胞可在1~20L的生物反应器中表达重组蛋白。
8. 能同时表达多个基因这是第一个可以在同一细胞株或组织中用来设计表达多个基因的表达系统。
最简单的方法是将含有两个基因的双表达盒插入腺病毒转移载体中，或者用不同的重组病毒共转染目的细胞株来分别表达一个蛋白。
测定不同重组病毒的MOI比值可正确估计各重组蛋白的相对共表达情况。
第三章AdEasyTM技术3.1 技术概览AdEasyTM系统是由T.C.He等（1998）构建的用来代替传统腺病毒重组系统的一个快捷系统。
在这个系统中，只需二步即可产生重组腺病毒：先将表达盒装入转移载体，然后再通过同源重组插入腺病毒基因组。
将外源基因插入腺病毒的最有效途径是通过同源重组，原因是：1）腺病毒DNA是大型的线性分子，含有几乎所有的内切酶切位点；2）基因组过大（36kb），难于操作。
在AdEasyTM载体系统中，含有大部分腺病毒基因组的载体为超螺旋质粒，而不是线性DNA，同源重组则在大肠杆菌进行。
相对于传统系统而言，这二点改进使病毒DNA操作更容易，同时由于利用了大肠杆菌的高效率同源重组特性而使重组载体的筛选更为简单。
在本系统中，首先将基因cDNA插入一个转移载体，将得到的质粒用PmeI线性化，然后在大肠杆菌BJ5183中与病毒DNA质粒pAdEasy-1进行同源重组。