腺病毒中文操作手册

腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统

AdEasyTM操作手册

目录

第一章简介 1

第二章应用重组腺病毒的优点 2

第三章AdEasyTM 技术 3

3.1 技术概况3

3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3 第四章主要流程 4

4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体4

4.1.1 克隆的一般原则4

4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体5

4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生5

4.2.1 共转化的一般原则5

4.2.2 共转化方法5

4.2.3 预期结果5

4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增6

4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞6 4.4.1 细胞铺板6

4.4.2 磷酸钙转化技术7

第五章常用技术8

5.1 QBI-293A细胞培养8

5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8

5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8

5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞9

5.2.2 病毒空斑形成9

5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9

5.3 MOI测定10

5.4 腺病毒感染力测定10

5.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11

5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12

5.5.3 Western杂交13

5.5.4 Southern杂交和点杂交13

5.5.5 病毒裂解产物PCR 14

5.5.6 免疫测定14

5.5.7 功能测定14

5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17

5.7.2 连续密度梯度离心17

5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17

5.8 病毒滴度测定18

5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19

5.8.2 空斑测定法20

5.8.3 50%组织培养感染剂量法20

第六章疑难解答22

6.1 QBI-293A细胞培养22

6.2 感染力测定22

6.3 转移载体克隆23

6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24

6.5 转染QBI-293A细胞25

6.6 筛选和测定25

6.7 在QBI-293A细胞中表达26

6.8 重组腺病毒的扩增26

6.9 纯化26

6.10 病毒滴度测定27

缩写英文全称中文全称

Ad Adenovirus 腺病毒

Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体

Amp Ampicillin 氨苄青霉素

β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶

bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白

cDNA Complementary DNA 互补DNA

cccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNA CPE Cytopathic Effect 细胞病理效应

CsCl Cesium Chloride 氯化铯

DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基

DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜

DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭

FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清

Hr Hour 小时

ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复

Kan Kanamycin 卡那霉素

kb Kilobases 千碱基对

KDa KiloDaltons 千道尔顿

LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基

MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点

Min Minute 分钟

MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNA

MWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液

PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位

pi Post Infection 感染后

RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠

TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸

TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量

TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白

TE Tris/EDTA TE溶液

wt Wild Type 野生型

X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷

第一章简介

当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。为解决这一问题，基因输送技术(通常使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒)通过基因工程不断发展，致力于生产基因表型药物。重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。

1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒，它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields等，1996）。1977年，Frank Graham博士建立了一种细胞株，可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒（Graham等，1977）。此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广泛应用，尤其是在基因治疗相关领域。迄今为止已有大量关于腺病毒及其应用的综述发表，我们给感兴趣的读者推荐以下文章：Hitt et al，1999和Wivelet al，1999。腺病毒亦可被用来在人体细胞中过量表达蛋白（Massie et al，1998 A, B）。但迄今为止还只有熟知腺病毒的研究人员才会采用腺病毒系统。昆腾生物科技公司是第一个提供完备而且能广泛应用的重组腺病毒试剂盒Adeno-QuestTM系统及其相关产品和客户服务的公司，这个系统的基础是在293细胞中产生重组腺病毒。现在介绍的AdEasyTM系统以细菌内重组取代哺乳动物细胞（He et al，1998），使获得重组腺病毒对任何有细胞培养设备的分子生物实验室都更方便。重组腺病毒事实上可在任何细胞或组织中用来研究表达重组蛋白。AdEasyTM转移载体可允许插入7.5kb的外源DNA，目前正研究腺病毒其它区的缺失以提高腺病毒在基因治疗中的应用。

这本手册提供了重组腺病毒技术中所有必须遵循的原则，并详细描述了产生一个重组腺病毒的所有实验步骤，包括重组腺病毒在QBI-293A细胞中扩增并纯化到1012VP的操作步骤。AdEasyTM载体系统包含了生产5型重组腺病毒所需的全部试剂，所有成分购买后即可使用。

第二章应用重组腺病毒的优点

1. 宿主范围广, 对人致病性低

这套腺病毒载体系统可广泛用于人类及非人类蛋白的表达。腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞，因此在大多哺乳动物细胞和组织中均可用来表达重组蛋白。

2. 在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因

逆转录病毒只能感染增殖性细胞，因此DNA转染不能在非增殖细胞中进行，而必须使细胞处于持续培养状态。腺病毒则能感染几乎所有的细胞类型，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞。腺病毒是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统，它可以使转化细胞和原代细胞中得到的结果直接进行对比。

3. 能有效进行增殖，滴度高

这套腺病毒系统可产生1010到1011VP/ml，浓缩后可达1013VP/ml，这一特点使它非常适用于基因治疗。