腺相关病毒包装操作手册剖析

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病毒包装实验整体流程及原理(慢病毒、腺病毒)

病毒包装实验整体流程及原理(慢病毒、腺病毒)

广州英思特生物科技有限公司为您提供高效快速的病毒包装实验外包服务,病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞,常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞,从而得到表达满足实验需求。

1、病毒的种类病毒有很多种,常见的有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1.1.1原理慢病毒(Lentivirus)是逆转录病毒的一种。

构建的siRNA/miRNA慢病毒载体,与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA载体相比,一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用,另一方面,Lentivirus-siRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后,可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞,并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组,进行长时间的稳定表达。

1.1.2特点1)直接包装成为假病毒颗粒,对分裂和非分裂细胞均有感染作用,适合RNAi研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。

?2)可以通过简单方式,在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。

3)可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。

4)无需任何转染试剂,操作简便。

5)可以根据客户需要制备多种标记。

1.1.3慢病毒包装简要流程:1)含有目的基因的慢病毒RNAi干扰载体的构建和质粒纯化提取。

2)慢病毒载体,包装系统共转染病毒包装细胞293T等。

3)培养48hrs-72hrs左右,收集含有病毒的上清培养液。

4)病毒的纯化和浓缩。

5)分装、-80 ℃保存。

6)滴度测定目的基因检定,并出具检测报告。

1.2、腺病毒1.2.1原理腺病毒(Adenovirus,Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒,其复制不依赖于宿主细胞的分裂。

有近50个血清型,大多数Ad载体都是基于血清型2和5,通过转基因的方式取代E1和E3基因,降低病毒的复制能力。

这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制,因此是一种适用于治疗的高效控制系统。

腺相关病毒包装原理及步骤

腺相关病毒包装原理及步骤

腺相关病毒包装原理及步骤采用第2代重组腺相关病毒包装系统制备病毒颗粒。

该包装系统包含3个质粒和一株包装细胞株。

1)1个转移质粒:含有两侧有AAVITR序列的转基因表达盒子。

2)1个Rep-cap表达质粒:表达Rep和Cap两个基因。

3)1个辅助质粒:包含来自腺病毒的一些基因(E4、E2a和VA)。

这些腺病毒的基因可以促进AAV基因组的复制。

4)1株含有腺病毒E1基因的293细胞。

野生型腺相关病毒基因组是一条长约4.7 kb的线性单链DNA (ssDNA)分子。

基因组两末端各有一个145 nt长的Inverted Terminal Repeat (ITR),ITR序列是对称的,自己能形成发夹结构。

病毒感染细胞后,释放出单链病毒基因组,末端发夹结构促使腺相关病毒以单链基因组为模板复制互补链,形成双链DNA。

野生型病毒只表达2个基因:rep (replication) 和cap (capsid),Rep编码非结构蛋白,Cap编码结构蛋白。

腺相关病毒基因组不编码polymerase,基因组DNA的复制需要用到宿主细胞表达的polymerase。

将基因组上的Rep和Cap基因删除,克隆到质粒上,然后将目的基因克隆在两个ITR 之间,这个质粒就成为转移质粒。

而Rep和Cap基因被克隆到另外一个质粒上,成为Rep-cap表达质粒。

除了Rep-cap表达质粒,还需要一个辅助质粒。

这个辅助质粒表达腺病毒的一些基因(E4、E2a和VA),这些腺病毒基因可以促进AAV基因组的复制。

除了3个质粒外,腺相关病毒包装系统还需要一株表达腺病毒E1基因的293细胞。

每次包装重组腺相关病毒,辅助质粒均固定不变,只要血清型不变,Rep-cap质粒也是相对固定,变化的是编码目的基因的转移质粒。

病毒包装实验整体规程及原理(慢病毒、腺病毒)

病毒包装实验整体规程及原理(慢病毒、腺病毒)

广州英思特生物科技有限公司为您提供高效快速的病毒包装实验外包服务,病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞,常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞,从而得到表达满足实验需求。

1、病毒的种类1.11.1.1体,一方面1.1.21)研。

? 2)可以通过简单方式,在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。

3)可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。

4)无需任何转染试剂,操作简便。

5)可以根据客户需要制备多种标记。

1.1.3慢病毒包装简要流程:1)含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。

2)慢病毒载体,包装系统共转染病毒包装细胞293T等。

3)培养 48hrs - 72hrs 左右,收集含有病毒的上清培养液。

4)病毒的纯化和浓缩。

5)分装、- 80 ℃保存。

6)滴度测定目的基因检定,并出具检测报告。

1.21.2.1达E11.2.21)2)3)4)5)1.2.3腺病毒包装简要流程1)构建表达 siRNA/miRNA 的腺病毒载体2)采用 PacI 消化纯化的质粒。

3)消化好的腺病毒表达载体转染 293A 细胞,收获细胞以制备病毒粗提液。

4)将病毒粗提液感染 293A 细胞以扩增病毒。

5)分装,-80℃保存。

1.3、慢病毒和腺病毒的比较2、构建目的基因到载体2.1构建手段一般是根据原始质粒信息确定克隆方案,有以下两种手段。

1)如果原始质粒与载体有匹配酶切位点,采用相应的内切酶切下相应片段,回收并连接到载体,酶切,并测序鉴定DNA分子。

质粒在宿主细胞体内外都可复制。

通过个些特性,人们可以把一些目的DNA片断构建在质粒中,通过转化入大肠杆菌中,利用选择培养基来筛选从而不断的复制,来得到目的产物。

3、质粒DNA在大肠杆菌里转化连接上目的基因的质粒转化大肠杆菌是为了让目的基因在大肠杆菌里扩增,然后提取质粒,以下是质粒DNA在大肠杆菌里转化的三步骤。

3.1大肠杆菌感受态细胞的制备30min2)离心管放到42℃保温90s3)冰浴2min4)每管加800ulLB液体培养基,37℃培养1h(150r/min)5)取适当体积(100ul)的复苏细胞,涂布在选择性培养基上,正置6)倒置平皿37℃,12~16h,出现菌落3.3质粒提取步骤1)取1~4ml在LB培养基中培养过夜的菌液,12000转离心1min,弃上清一次。

腺相关病毒(AAV)包装技巧

腺相关病毒(AAV)包装技巧

腺相关病毒(AAV)包装技巧上⽂已经介绍了腺相关病毒的基础知识,具有如此多优点、功能如此强⼤的腺相关病毒是如何⽣产的?本⽂将为⼤家揭开腺相关病毒⽣产的神秘⾯纱。

腺相关病毒⽣产流程⼤致可分为基因克隆、细胞转染、收毒、病毒纯化、滴度检测等步骤,具体步骤我们下⽂分解?怎么可能,下⾯就是腺相关病毒⽣产流程。

腺相关病毒重组克隆载体构建1)根据订单不同选择不同的载体,在此以⼈源基因克隆为例。

2)Vigenebio 公司的 AAV 载体与我们的⼈源 ORF (注:维真⽣物拥有18000⼈源cDNA ORF克隆,可以最快的时间克隆到载体)库中的穿梭质粒的多克隆位点相兼容,通过酶切,连接,转化的⽅式将基因亚克隆进⼊ pAV-FH AAV 载体,得到阳性克隆之后进⾏酶切跑胶验证及测序以确认插曲⽚段的正确性。

细胞冻存流程1) 按照培养细胞流程,将细胞吹下来加⼊ 50ml 离⼼管中, 800g 离⼼5min。

2) 配制冻存液,90% ⾎清,10% DMSO,混匀。

3) 离⼼后去上清,将配制的冻存液加⼊,将细胞吹匀4) 取上述溶液 1ml 分⾄ 1.5ml 细胞冻存管中,做好标记和⽇期。

5) 放⼊装有异丙醇的冻存盒中,放⼊-80度冰箱过夜。

(冻存盒要提前⼀天从冰箱中拿⾄室温,使异丙醇的温度达到室温,每次冻存前确保异丙醇的加⼊量在刻度线上)。

6) 第⼆天将冻存盒放⼊液氮或-150℃冰箱中。

细胞复苏流程1) 10cm 培养盘中加 10cm 新鲜 DMEM 培养基,放培养箱预热⾄ 37℃。

2) 从液氮中取出冷冻管,迅速投⼊37 ℃~38℃⽔浴中,使其融化(1-2 分钟左右)。

3) 待细胞冻存管中溶液尚未完全融化时加⼊预热的培养盘中。

4) 摇晃均匀,放培养箱培养。

5) 4h后待细胞完全贴壁后更换新鲜培养基(除去冻存液中 DMSO 对细胞的毒害作⽤。

也可在第 3步中 800g 离⼼5min,除去培养基后再悬浮细胞添加⾄新鲜预热的 DMEM 细胞培养⽫中)。

腺相关病毒操作手册--汉恒生物

腺相关病毒操作手册--汉恒生物

汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 1汉恒生物---腺相关病毒操作手册一、腺相关病毒(Adeno-Associated Viral Vector ,AAV )简介腺相关病毒属微小病毒科( parvovirus),为无包膜的单链线状 DNA 病毒。

AA V 的基因组约 4700bp ,包括上下游两个开放读码框架(ORF),位于分别由 145 个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。

基因组中有 3 个启动子(P5、P19 和 P40) 和 2 个开放阅读读框(ORF),rep 和 cap ,如图 1 所示。

rep 编码 4 个重叠的多功能蛋白,即 Rep78、Rep68、Rep52 和 Rep40,其中 Rep78 与 Rep68 参与 AA V 的复制与整合,Rep52 和 Rep40 具有解螺旋酶和 ATP 酶活性,与 Rep78、Rep68 共同参与单链基因组的复制;cap 编码的 VP1、VP2、VP3是装配成完整病毒所需要的衣壳蛋白,它们在 AA V 病毒整合、复制和装配中其重要作用。

图 1. AA V 基因组结构二、腺相关病毒的优点1. 安全性高:迄今从未发现野生型A A V 对人体致病,重组A A V 基因组序列上去除了大部分的野生型A A V 基因组元件,进一步保证了安全性;2. 免疫原性低:AA V2 的基因组仅 4681 个核苷酸,便于用常规的重组 DNA 技术进行操作,而且进行动物实验时造成的免疫反应小;3. 宿主范围广:能感染分裂细胞和非分裂细胞;4. 表达稳定:能介导基因的长期稳定表达;5. 物理性质稳定:在60℃不能被灭活,能抗氯仿;三、重组腺相关病毒载体系统简介汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 2AAV 是一种复制缺陷型微小病毒,其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。

AAV 无辅助病毒系统(AAV Helper-Free System )可以在无辅助病毒的条件下生产出重组腺相关病毒。

腺相关病毒操作手册

腺相关病毒操作手册

腺相关病毒操作手册一、腺相关病毒(Adeno-Associated Viral Vector,AAV)简介腺相关病毒属微小病毒科(parvovirus),为无包膜的单链线状DNA病毒。

AA V的基因组约4700bp,包括上下游两个开放读码框架(ORF),位于分别由145个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。

基因组中有3个启动子(P5、P19和P40)和2个开放阅读读框(ORF),rep和cap,如图1所示。

rep编码4个重叠的多功能蛋白,即Rep78、Rep68、Rep52和Rep40,其中Rep78与Rep68参与AA V的复制与整合,Rep52和Rep40具有解螺旋酶和ATP酶活性,与Rep78、Rep68共同参与单链基因组的复制;cap编码的VP1、VP2、VP3是装配成完整病毒所需要的衣壳蛋白,它们在AA V病毒整合、复制和装配中其重要作用。

图1.AA V基因结构二、腺相关病毒的优点1.安全性高:迄今从未发现野生型AA V对人体致病,重组AA V基因组序列上去除了大部分的野生型AA V基因组元件,进一步保证了安全性;2.免疫原性低:AA V2的基因组仅4681个核苷酸,便于用常规的重组DNA技术进行操作,而且进行动物实验时造成的免疫反应小;3.宿主范围广:能感染分裂细胞和非分裂细胞;4.表达稳定:能介导基因的长期稳定表达;5.物理性质稳定:在60℃不能被灭活,能抗氯仿;(汉恒--AAV包装)三、重组腺相关病毒载体系统简介AAV是一种复制缺陷型微小病毒,其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。

AAV无辅助病毒系统(AAV Helper-Free System)可以在无辅助病毒的条件下生产出重组腺相关病毒。

在AAV Helper-Free System中,生产具有感染性的AAV病毒颗粒所需的腺病毒基因产物(如:E2A,E4等基因)大部分由pHelper质粒提供,其余的腺病毒基因产物由稳定表达腺病毒E1基因的AAV-293宿主细胞提供。

腺病毒包装操作手册

腺病毒包装操作手册

汉恒重组腺病毒操作手册目录腺病毒安全使用和注意事项腺病毒储存与稀释的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、腺病毒包装和浓缩四、重组腺病毒滴度(PFU)的测定五、重组腺病毒感染目的细胞六、重组腺病毒用于动物实验附1:汉恒生物腺病毒载体附2:腺病毒感染细胞最佳MOI的摸索(表达荧光的病毒) 附3:汉恒生物常见三种病毒感染目的细胞比较腺病毒安全使用和注意事项➢腺病毒安全使用注意事项(*非常重要*)1) 腺病毒相关实验请在生物安全柜(BL-2级别)内操作。

2) 操作病毒时请穿实验服,佩戴口罩和手套,尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。

3) 操作病毒时需要特别小心病毒溅出。

如果操作时超净工作台有病毒污染,请立即用70%乙醇加 1%的SDS溶液擦拭干净。

4) 接触过病毒的枪头、离心管、培养板及培养瓶请用84消毒液浸泡后统一处理。

5) 如实验过程中需要离心,应使用密封性好的离心管,必要时请用封口膜封口后离心。

6) 病毒相关的废弃物需要特殊收集,统一经高温灭菌后处理。

7) 实验完毕后请用香皂清洗双手。

➢腺病毒储存与稀释的注意事项1)腺病毒的储存收到病毒液后若在短期内使用,可将病毒放置于 4℃保存(一周内使用完最佳);如需长期保存请分装后放置于 -80 ℃ 。

注:a.反复冻融会降低病毒滴度(每次冻融会使病毒滴度降低10%~50%),因此在病毒使用过程中尽量避免反复冻融。

汉恒生物对病毒已进行分装(200 μl/tube),收到后请直接放置-80℃冰箱保存即可。

b.若病毒储存时间超过6个月,汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度(参见附表2-慢病毒滴度测定方法)。

2)腺病毒的稀释需要稀释病毒时,请将病毒取出置于冰浴融解后,使用PBS或培养目的细胞用的无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于 4℃保存(一周内使用完最佳)。

重组腺病毒是一种复制缺陷的腺病毒载体系统,在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。

腺相关病毒包装操作手册剖析

腺相关病毒包装操作手册剖析
附录 1 附录 2
一、AAV 安全使用注意事项(*非常重要!!!*)
1) AAV 相关实验请在生物安全柜(BL-2 级别)内操作。 2) 操作病毒时请穿实验服,佩戴口罩和手套,尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。 3) 操作病毒时特别小心病毒溅出。如果操作时超净工作台有病毒污染,请立即用 70%乙醇
加 1%的 SDS 溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头、离心管、培养板、培养液请用 84 消毒 液浸泡后统一处理。 4) 如需要离心,应使用密封性好的离心管,如有必要请用封口膜封口后离心。 5) 动物注射操作请在生物安全柜内(BL-2 级别)完成。 6) 病毒相关的废弃物需要特殊收集,统一经高温灭菌处理。 7) 实验完毕用洗手液清洗双手。 二、AAV 储存和稀释注意事项 1. AAV 的储存 收到病毒液后若在短期内使用,可将病毒放置于 4℃保存(一周内使用完最佳);如需长 期保存请分装后放置于-80℃。 注:a.反复冻融会降低病毒滴度(每次冻融病毒滴度会降低 10%-50%),因此在病毒使用过程中 应尽量避免反复冻融。汉恒生物已对病毒进行了分装(200 l/tube),收到后请直接放置-80℃保存即 可。
Arch3.0-EYFP pHBAAV-CMV-DIO-
hCHETA-EYFP pHBAAV-hSyneNpHR3.0-EYFP pHBAAV-hSynhChR2(H134R)-mcherry
启动子及其特点
CAG(人巨细胞病毒 启动子 CMV 和鸡 beta-actin 嵌合型启 动子),广谱,强
CMV(人巨细胞病毒启动 子),广谱,强
特异启动子),强
标记基因 GFP GFP GFP
是否 Cre 依赖 是
否 否
CAG(CMV 和鸡 beta-
Gq-

腺相关病毒包装(AAV)介绍

腺相关病毒包装(AAV)介绍

腺相关病毒包装(AAV)介绍
腺相关病毒(AAV)是最初发现的作为腺病毒载体污染物的⼩型病毒。

利⽤AAV进⾏研究的⼀个主要优势是它的复制能⼒有限,并且通常不会导致⼈类疾病。

由于这些原因,AAV通常被包含在较低的⽣物安全⽔平,并引发相对较低的免疫效应在活⽣物体内。

虽然AAV可以在BSL-1处理,但表达癌基因或毒素的AAV应该在BSL-2处理。

AAV能够以低免疫应答和低毒性转导分裂和⾮分裂细胞。

尽管重组AAV不能整合到宿主基因组中,转基因的表达可以是长期的。

AAV的效⽤⽬前受到其⼩包装容量的限制(包括ITRs在内为4.5 kb),尽管⼈们对扩⼤这⼀容量有很⼤的兴趣和努⼒。

传统上,AAV要求存在另⼀种“辅助”病毒,如腺病毒或疱疹病毒,以便繁殖。

这是由于AAV依赖于某些介导AAV复制的外源基因产物。

这⼀要求已经被“⽆辅助病毒系统”所回避,该系统能够在不使⽤辅助病毒的情况下产⽣传染性AAV粒⼦。

相反,在AAV⽣产期间,特定的基因产物可以由辅助质粒(例如,pHelper)和特定的包装细胞系(例如,HEK293细胞)提供。

AAV质粒系统概述。

腺病毒载体操作手册簿中文版解析汇报

腺病毒载体操作手册簿中文版解析汇报

word腺病毒载体操作手册中文版AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1第二章应用重组腺病毒的优点 2第三章 AdEasyTM 技术 33.1 技术概况 33.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3第四章主要流程 44.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 克隆的一般原如此 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 5 4.2.1 共转化的一般原如此5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果54.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 64.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术 7第五章常用技术 85.1 QBI-293A细胞培养 8 5.1.1QBI-293A细胞的初始培养 8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖 8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存 85.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞 9 5.2.2 病毒空斑形成 9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 95.3 MOI测定 105.4 腺病毒感染力测定 10 5.4.1 X-Gal染色 115.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最优重组腺病毒:表达和基因输送 11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交 13 5.5.4 Southern 杂交和点杂交 13 5.5.5 病毒裂解产物PCR14 5.5.6 免疫测定 14 5.5.7 功能测定145.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增155.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心 17 5.7.2 连续密度梯度离心 17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集 175.8 病毒滴度测定 18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法 20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法 20第六章疑难解答 226.1 QBI-293A细胞培养 226.2 感染力测定 226.3 转移载体克隆 236.4 在BJ5183细胞中共转化和重组246.5 转染QBI-293A细胞 256.6 筛选和测定256.7 在QBI-293A细胞中表达 266.8 重组腺病毒的扩增 266.9 纯化 266.10 病毒滴度测定 27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA plementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNAMWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication petent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的开展日趋复杂,一些治疗药物〔生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物〕和诊断性蛋白〔单克隆抗体〕的设计、开展与合成需要更高效的基因输送工具。

腺病毒包装纯化及感染实验操作步骤

腺病毒包装纯化及感染实验操作步骤

腺病毒包装纯化及感染实验操作步骤技术背景Adeasy 系统利用了腺病毒具有的高感染能力,可高度浓缩等优点,并破坏了腺病毒基因组中的早期基因E1,使之成为较为安全、高效的病毒载体。

利用带有E1 基因的293 细胞作为包装细胞,通过倍比扩增,富集病毒颗粒,并通过CsCl 梯度离心,透析进行分离纯化。

对绝大多数的细胞株可以达到近乎100%的感染效率。

但需要指出的是Adeasy 同样具有所有病毒载体或转染试剂都不可避免的细胞毒性问题。

所需试剂1.293 细胞;2. 重组好的腺病毒质粒;3. Pac I 限制性内切酶;4. 质粒回收相关试剂;5. 细胞培养、转染相关试剂;6. TBS:10mM Tris, 0.9% NaCl,pH8.1;7. 40% CsCl:28.45 g CsCl 溶于42.7 ml 的TBS 中,4 度保存;8. 15% CsCl:9.085 g CsCl 溶于47.69 ml 的TBS 中,4 度保存;9. Beckman 离心管:14*89 mm,SW41 转头;10. Polybrene (sigma),10 mg/ml;11. 透析袋:Spectrum Co. (成卷供应,带少量甘油,硫化物与重金属),MW=8000~14400;12. 灭菌甘油。

操作流程1.293 细胞(E1-transformed human embryonic kidney cells 在转染前24 小时接种于1 或2 个60 mm 培养盘中,使之在转染时细胞汇合率为50-70%;2. 在转染前,用Pac I 处理目的质粒(一般一个60 mm 细胞盘需要6μg DNA)。

处理后质粒用乙醇沉淀并重悬于20 μl 无菌水中;3. 用PEI 或其他转染试剂将6 μg Pac I 处理过的质粒转染细胞;4. 8 个小时后移去混合液,加入4 ml DMEM 完全培养液(10% CBS,1%Pen/Strep);5. 在转染后7 到10 天用细胞刮(而不是胰酶)将细胞从瓶中刮下并移入50ml锥形管。

(整理)腺病毒载体操作手册1407-R2

(整理)腺病毒载体操作手册1407-R2

腺病毒载体操作手册一、实验流程制备腺病毒穿梭质粒,分别高纯度无内毒素抽提腺病毒穿梭质粒和骨架质粒,共转染293A细胞,转染后6h更换为完全培养基,培养十几天,在中间四五天左右更换一次新鲜培养基,然后收集细胞和1ml培液置于15ml离心管后,液氮/37度冻融三次(冻-融要彻底),2000rpm离心5分钟,取上清即为病毒液初代原液。

连续三代反复扩增收集病毒后,行病毒的大量扩增,然后通过CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。

二、实验材料(一)腺病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为两质粒系统,组成为穿梭质粒(包括pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBAd-U6-GFP, pHBAd-U6-RFP)和骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre。

其中穿梭质粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和pHBAd-U6-GFP能表达绿色荧光蛋白(GFP)。

pHBAd-CMV-IRES-RFP和pHBAd-U6-RFP能表达红色荧光蛋白(RFP)。

1、载体信息1) 腺病毒克隆载体图谱如下:各载体用途如下表:2)骨架质粒信息如下:2、细胞株293A,腺病毒的包装细胞,为贴壁依赖型成上皮样细胞,经培养生长增殖形成单层细胞,生长培养基为DMEM(含10% FBS)。

3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。

用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。

三、包装细胞293A细胞的培养(一)293A细胞的冻存293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆,具有易使用和易转染的特性。

该细胞株对于高细胞密度很敏感,当细胞超过70%汇合时,一些细胞可能会丢失它们的表型。

若细胞密度持续在70%以下,QBI-293A细胞则能连续培养3~4个月维持原有细胞特性。

若以购买得到的293A作为第一代,则30代内能得到最佳结果。

随着传代的次数增加,293A细胞会出现生长状态下降、突变等。

为了防止此类现象的出现,我们需要在开始就对细胞进行大量冻存,以保证实验的稳定性和持续性。

高效包装腺相关病毒的原理及流程

高效包装腺相关病毒的原理及流程

高效转染病毒
源井生物可以提供不同质量标准的慢病毒,腺病毒,腺相关病毒。

在基因编辑方面,源井生物可以提供体外细胞感染用的浓缩病毒,也可以提供动物体内使用的超纯化病毒,满足客户的不同科研需求。

三种病毒的比对:
腺相关病毒包装原理
腺相关病毒( adeno-associated virus,AAV) 是一类细小病毒,基因组为单链DNA,对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

通常需要腺病毒或疱疹病毒帮助其在体内复制扩增。

重组腺相关病毒(recombinant AAV, rAAV)是利用
AAV2 型基因组与不同血清型的衣壳蛋白基因组结合产生的混合体病毒载体,可将目的基因的CDS 区序列或者RNAi 干扰序列插入rAAV 表达质粒中,包装病毒后感染细胞完成对目的基因的操作。

腺相关病毒具有感染温和,免疫原性小,长效稳定表达的特点,主要应用于动物体内注射。

源井生物提供的腺相关病毒颗粒经过超速离心纯化,并通过qPCR对病毒基因拷贝进行滴定。

腺相关病毒的滴度在10^12~10^13GC/ml,可以满足各类整体实验的使用要求。

不同血清型的AAV组织感染嗜亲性各不相同,表现出一定的器官靶向特异性。

下表列举了不同的AAV血清型及对应的组织亲和性:
产品规格:
服务流程及质量控制:
基因敲除腺相关病毒
源井生物构建基因敲除腺相关病毒载体并包装为腺相关病毒,经过超速离心纯化后,可用于动物定位注射和整体注射实验。

细胞感染腺相关病毒后,可稳定表达gRNA和Cas9蛋白,达到敲除靶基因的目的。

基因敲除腺相关病毒载体选择:
注明| 文章是源井生物原创,转载请注明。

腺病毒包装原理 流程全解析

腺病毒包装原理 流程全解析

腺病毒包装原理
腺病毒(Adenovirus)是一种线性双链DNA无包膜病毒,对分裂期细胞和非分裂期细胞均具有感染能力,且具有嗜上皮细胞性。

重组腺病毒载体是以腺病毒为基础发展起来的工具病毒载体,具有宿主范围广,免疫原性强,基因容量大,不与基因组整合,瞬时表达等特点。

重组腺病毒(AdV)是人血清5型腺病毒(Ad5),一种复制缺陷的腺病毒载体系统,在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。

腺病毒缺失了早期表达基因序列E1和E3区。

E1是腺病毒复制所必须的,E1的缺失使其不能自身复制,只能依靠包装细胞如293A细胞提供的反式互补进行复制扩增,以此保证腺病毒的安全性。

源井生物所提供的腺病毒颗粒经过超速梯度离心和过滤,并通过壳蛋白免疫法进行滴度测定。

腺病毒的滴度在10^10~10^12pfu/ml,完全可以满足各类实验的使用要求。

产品规格
服务流程及质量控制:
基因表达腺病毒
源井生物通过构建腺病毒表达载体并包装成腺病毒。

使用过表达腺病毒感染细胞后可以实现目的基因瞬时高表达。

腺病毒包装容量大,重组片段可达4.5kb。

基因敲除腺相关病毒载体选择:
基因干扰腺病毒
源井生物通过构建腺病毒干扰载体并包装成腺病毒。

使用干扰腺病毒感染细胞后可以实现干扰RNA瞬时高表达。

基因干扰腺病毒载体选择:
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病毒包装实验整体流程及原理(慢病毒、腺病毒)

病毒包装实验整体流程及原理(慢病毒、腺病毒)

广州英思特生物科技有限公司为您提供高效快速的病毒包装实验外包服务,病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞,常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞,从而得到表达满足实验需求。

1、病毒的种类病毒有很多种,常见的有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1.1.1原理慢病毒(Lentivirus)是逆转录病毒的一种。

构建的siRNA/miRNA慢病毒载体,与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA载体相比,一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用,另一方面,Lentivirus-siRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后,可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞,并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组,进行长时间的稳定表达。

1.1.2特点1)直接包装成为假病毒颗粒,对分裂和非分裂细胞均有感染作用,适合RNAi研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。

?2)可以通过简单方式,在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。

3)可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。

4)无需任何转染试剂,操作简便。

5)可以根据客户需要制备多种标记。

1.1.3慢病毒包装简要流程:1)含有目的基因的慢病毒RNAi干扰载体的构建和质粒纯化提取。

2)慢病毒载体,包装系统共转染病毒包装细胞293T等。

3)培养48hrs-72hrs左右,收集含有病毒的上清培养液。

4)病毒的纯化和浓缩。

5)分装、-80 ℃保存。

6)滴度测定目的基因检定,并出具检测报告。

1.2、腺病毒1.2.1原理腺病毒(Adenovirus,Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒,其复制不依赖于宿主细胞的分裂。

有近50个血清型,大多数Ad载体都是基于血清型2和5,通过转基因的方式取代E1和E3基因,降低病毒的复制能力。

这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制,因此是一种适用于治疗的高效控制系统。

腺病毒包装重组的技术详解

腺病毒包装重组的技术详解

腺病毒包装重组的技术详解⼀、什么是⼀、什么是腺病毒包装系统腺病毒包装系统1. 腺病毒包装系统包括:1)1个腺病毒载体:含有缺失了E1和E3基因的腺病毒基因组序列的质粒。

2)l 株包装细胞株:表达El 基因的293细胞。

野⽣型腺病毒基因组是⼀条约36 kb 的线性双链DNA (dsDNA)分⼦。

基因组的两个末端被称为Inverted Terminal Repeat (ITR),末端之间含有腺病毒DNA 复制所需基因。

在病毒DNA 复制周期早期表达的基因,称为早期基因,主要有4个,按表达先后顺序依次是E1、E2、E3、E4。

在病毒DNA 复制周期晚期表达的基因,称为晚期基因,主要有5个,按表达先后顺序依次为Ll 、L2、L3、L4、L5。

为了制备出⾃我失活的重组腺病毒,E1基因会被删除,使重组腺病毒成为⼀种安全的基因运输⼯具。

为了增加包装能⼒,E3基因也同时被删除,因为E3基因产物会提⾼宿主的免疫反应,⽽且对病毒⽣产不重要。

缺失了E1和E3基因的腺病毒基因组序列被克隆到质粒上构建成腺病毒载体。

El 基因⽚段被整合到293细胞基因组中,包装病毒颗粒时,Pacl 消化的腺病毒载体转梁到表达E1基因的293细胞。

El 基因激活了其他早期基因和晚期基因的表达,这些基因表达产物和Pacl 消化的质粒DNA 组装成病毒颗粒。

⼆、什么是⼆、什么是腺病毒过程腺病毒过程⽣产携带⽬的基因的重组腺病毒颗粒,过程如下图:将环形腺病毒载体通过Pacl位点酶切后获得两末端是ITR序列的线性双链DNA,再转染线性化DNA到包装细胞。

线性化双链DNA分饰两个⾓⾊,既是病毒基因组,⼜是病毒蛋⽩表达所参照的基因模板序列。

基因组与病毒蛋⽩组装成病毒颗粒,病毒颗粒在细胞内成熟后,使得细胞破裂,从⽽使病毒颗粒释放到培养液中。

然后收集细胞和培养液,反复冻融细胞和培养液的混合物,离⼼收集上清,获得粗病毒。

此时的粗病毒量通常不会很⾼,⼀般会将粗病毒感染更多的包装细胞,以扩增病毒量。

腺病毒包装注意事项.

腺病毒包装注意事项.

在293细胞中大量扩增腺病毒一旦重组病毒已被纯化和鉴定,即可在293 细胞中进行大量扩增。

本手册提供了递增培养规模和腺病毒感染周期的基本方法,按这一方法最终得到的病毒量约为3×1011~3×1012。

由于一个细胞中所含的病毒颗粒为1000~10000,因此1L 培养细胞可得到约5×1012病毒颗粒。

如果要把病毒用氯化铯梯度离心纯化,则必须至少3×108的细胞,这样才能正确分辨出病毒带。

对于蛋白表达,则根据需要可在任何一步扩增步骤中停止,离心沉淀细胞后按照适当的操作方法进行蛋白抽提(根据蛋白类型的不同抽提上清或细胞沉淀)。

为优化时间进程,每个感染周期必须与下一次细胞扩增培养同步。

如果由于各种原因不能同步,则必须将病毒冻存,直至下一次细胞培养开始后再融化病毒。

注意每次扩增都将会剩下一些病毒,这些病毒先不必丢弃,以便下一步扩增失败时备用。

每次扩增最好都用最低代的病毒颗粒,这样产生突变型病毒的可能性会大大降低。

操作步骤:1 在100mm 培养皿或75cm2培养瓶中加入10ml DMEM5%培养5×106293 细胞。

2 取0.5ul 首次扩增的病毒保存液,加入DMEM5%至1ml,混匀,这样稀释得到的MOI 值约为5。

3 移去培养液,小心加入病毒混合液,切勿破坏细胞单层,十字形慢慢晃动3 次,37℃CO2 孵箱中培养90 分钟。

4 加入9ml DMEM5%。

5 再培养72 小时,这时在10ml 溶液中大约有5×109~5×1010个病毒颗粒,进行MOI 测定以估计病毒颗粒。

注:如果此时得到的病毒量已足够,可立即进行病毒滴度测定。

收集细胞,600×g 离心 5 分钟沉淀细胞,去上清后加入最小体积(一般为原始体积的1/10 即1ml)病毒保存溶液重悬细胞。

-200C /370C 冻融3 次,台式离心机上以最大速率离心去除细胞碎片,收集上清,然后进行病毒滴定。

AAV的包装纯化浓缩方法总结

AAV的包装纯化浓缩方法总结

AAV的包装纯化浓缩方法总结腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV),也称腺伴随病毒,属于微小病毒科依赖病毒属,是目前发现的一类结构简单的单链DNA缺陷型病毒,需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。

它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因。

ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。

cap基因编码病毒衣壳蛋白, rep基因参与病毒的复制和整合。

AAV能感染多种细胞。

rep基因产物存在时,病毒DNA很容易整合到人类第19号染色体。

重组腺相关病毒载体(rAAV) 源于非致病的野生型腺相关病毒,由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低,在体内表达外源基因时间长等特点,被视为有前途的基因转移载体之一,在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。

经过10余年的研究,重组腺相关病毒的生物学特性己被深入了解,尤其是其在各种细胞、组织和体内实验中的应用效果方面已经积累了许多资料。

在医学研究中,rAAV被用于多种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验);同时作为一种有特点的基因转移载体,还广泛用于基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。

实验步骤1、准备HEK 293T细胞:提前一天分HEK 293T细胞,包装时细胞密度85%-90%且细胞分布均匀,状态良好(即:显微镜下观察,培养基中无杂质,无细胞悬浮或有少量细胞悬浮,细胞饱满,在培养皿中贴壁均匀)。

2、包装病毒1)提前一到两个小时给细胞换液,换成无血清的DMEM培养基(1%HEPES和1%P/S)。

换液时移液管要靠近培养皿内壁但不要贴住培养皿内壁缓慢加入DMEM,防止将已经贴壁的细胞吹起,同时换液时应注意避免移液管污染换液用培养基及细胞。

2)转染:以5个15cm培养皿的量为例:向15ml离心管中依次加入DMEM:9ml,Helper:124μg,RC:76μg,目的质粒:65.1μg,PEI:1ml,振荡混匀后室温静置30min。

人腺相关病毒(AAV)elisa试剂盒使用说明书

人腺相关病毒(AAV)elisa试剂盒使用说明书

人腺相关病毒(AAV)elisa试剂盒使用说明书Elisa kit规格:48孔配置/96孔配置标准品稀释液:1.5ml×1瓶酶标试剂:3 ml×1瓶(48)/6 ml×1瓶(96)【人腺相关病毒(AAV) elisa试剂盒】本试剂仅供研究使用计算:以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。

试剂盒组成:封板膜:2片(48)/2片(96)说明书:1份密封袋:1个标准品:2700ng/L 0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存酶标包被板: 1×48 1×96 2-8℃保存样品稀释液: 3ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液: 3ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液: 3ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存终止液: 3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液:(20ml×20倍)×1瓶(20ml×30倍)×1瓶2-8℃保存实验原理:本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人腺相关病毒(AA V) 水平。

用纯化的人腺相关病毒(AA V) 抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入腺相关病毒(AA V) ,再与HRP标记的腺相关病毒(AA V) 抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的腺相关病毒(AA V) 呈正相关。

用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中人腺相关病毒(AA V) 浓度。

腺病毒包装 SOP

腺病毒包装 SOP

腺病毒包装标准操作细则1. 目的:规范腺病毒包装标准操作程序2. 范围:适用于腺病毒包装操作工序3. 操作程序3.1器材准备无菌10ml玻璃吸管、电动移液枪、,移液枪(量程1000μL)、10cm培养皿、各种枪头,1.5mL EP管、15ml离心管,试管架,酒精灯、荧光显微镜、CO2培养箱、超净工作台3.2溶液准备DMEM培养基,Opti-MEM,Lipo转染试剂,HEK293细胞,重组腺病毒穿梭质粒,重组腺病毒骨架质粒,FBS(Gemini)3.3操作步骤3.3.1转染前24 小时,用0.25%胰蛋白酶消化对数生长期的HEK293细胞,以含10% FBS的DMEM培养基调整细胞密度约6*105/ml(70%汇合率的细胞),接种于6孔培养板,37 ℃、5% CO2培养箱内培养24 h 左右,待细胞密度达到70%时即可用于转染。

细胞状态对于病毒包装至关重要,因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。

3.3.2 转染前2 h内将细胞培养基更换为1.5ml Opti-MEM。

3.3.3将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀,取10 l Lipo转染试剂加入到无菌的1.5ml EP管中与240 μl OMEM混合,在室温下温育5分钟。

3.3.4向另一无菌1.5ml EP管中加入3ug重组腺病毒质粒骨架质粒和1.5ug穿梭质粒与OMEM混合均匀,调整总体积为250 μl。

3.3.5把稀释后的DNA与稀释后的Lipo转染试剂进行混合,用移液器轻轻反复吹吸地混匀,不要振荡。

3.3.6混合后,在室温下温育20分钟,以便形成DNA与Lipo的转染复合物,将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至HEK293细胞的培养液中,混匀,细胞于37 ℃, 5% CO2细胞培养箱中孵育6h~8 h。

3.3.7 培养6h-8h后,弃去含有转染混和物的培养基,然后每瓶细胞中加入含10% 血清的细胞培养基2ml,37℃、5%CO2培养箱内继续培养。

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Arch3.0-EYFP pHBAAV- CAG -DIO-
hCHETA-EYFP pHBAAV-CMV-DIO-
eNpHR3.0-EYFP pHBAAV-CMV-DIOhChR2(H134R)-mcherry pHBAAV-CMV-DIO-
ArchT-EYFP pHBAAV-CMV-DIOC1V1 (t/t)-TS-mcherry pHBAAV-CMV-DIO-
EYFP

红光 激活
pHBAAV-hSyn-C1V1(t/t)-TS-mcherry
mcherry

pHBAAV-hSyn-Arch3.0抑制
EYFP
EYFP

激活
pHBAAV-hSyn-DIOhCHETA-EYFP
EYFP

抑制
pHBAAV-GFAPeNpHR3.0-EYFP
EYFP

pHBAAV-GFAP激活

circRNA 过
pHBAAV-CMV-
1.2 kb
CMV,广谱,强
ZsGreen

表达
crRNA-EF1-ZsGreen
pHBAAV-gRNA-
在体敲除
gRNA
U6
saCas9


2) 汉恒生物 AAV 光遗传学工具现货列表(表 2)
载体 类型 抑制
激活
抑制 红光 激活 抑制
激活
抑制
激活
抑制 红光 激活 抑制
特异启动子,强
标记基因 GFP GFP GFP
是否 Cre 依赖 是
否 否
CAG(CMV 和鸡 beta-
Gq-
pHBAAV-CAG-DIO-
actin 嵌合型启动子),广 mCherry

DREADD hM3D(Gq)-mCherry
谱,强
CAG(CMV 和鸡 beta-
Gi-
pHBAAV-CAG-DIO-
腺相关病毒(AAV)操作手册
目录
一、 AAV 安全注意事项 二、 AAV 储存和稀释注意事项 三、 AAV 介绍 四、 汉恒生物 AAV 产品服务及载体信息与现货列表 五、 AAV 整体实验流程 六、 实验材料 七、 AAV 载体构建 八、 AAV 包装 九、 AAV 收集和纯化 十、 AAV 滴度测定 十一、 AAV 感染细胞测试 十二、 AAV 用于动物实验(重磅干货,五星推荐) 十三、 案例分享
4) 汉恒生物 AAV-mRFP-GFP-LC3 自噬流监测工具(表 4)
载体 类型 双标 单标
载体名称
pHBAAV-mRFP-GFP-LC3 pHBAAV-GFP-LC3
启动子及其特点
CMV,广谱,强 CMV,广谱,强
标记基因
mRFP/GFP GFP
是否 Cre 依赖 否 否
五、整体实验流程(图 2)
hSyn(人源成熟神经元特 异启动子),中强度
标记基因 EYFP
mcherry EYFP
mcherry EYFP EYFP EYFP
mcherry EYFP
mcherry EYFP EYFP EYFP
mcherry
是否 Cre 依赖 是 是 是 是 是 是 是 是 是 是 是 是 否 否
抑制
pHBAAV-hSyn-ArchTEYFP
pHBAAV-CMV-MCSEF1-ZsGreen
pHBAAV-CAG-MCST2A-ZsGreen
pHBAAV-CAG-MCST2A-mcherry
pHBAAV-CAG-DIOMCS-T2A-ZsGreen pHBAAV-CAG-DIOMCS-T2A-mCherry pHBAAV-hsyn-MCS-
是否 Cre 依赖 否 否 否 否 是 是 否 否 否 否
pHBAAV-GFAP-T2A-
GFAP,星形胶质细
1.6 kb
EGFP

EGFP
胞,中强度
干扰
pHBAAV-U6-MCSCMV-ZsGreen
pHBAAV-U6-CMVmCherry
shRNA shRNA
U6
ZsGreen

U6
mcherry

激活
pHBAAV-GFAPhCHETA-EYFP
EYFP

抑制
pHBAAV-CaMKIIeNpHR3.0-EYFP
EYFP

pHBAAV-CaMKII激活
hChR2(H134R)-mcherry
mcherry

pHBAAV-CaMKII-
抑制
EYFP

ArchT-EYFP
CaMKII(兴奋性经元神经
启动子及其特点
CMV,广谱,强
CMV,广谱,强
CAG,广谱,强
CAG,广谱,强
CAG,广谱,强
CAG,广谱,强 hSyn,成熟神经
元,中强度 hSyn,成熟神经
元,中强度 CamkII,兴奋性经元 神经特异启动子,强 CamkII,兴奋性经元 神经特异启动子,强
标记基因 ZsGreen ZsGreen ZsGreen mcherry ZsGreen mcherry ZsGreen mcherry ZsGreen mcherry
激活
抑制
激活
载体名称
pHBAAV-CAG-DIOeNpHR3.0-EYFP
pHBAAV- CAG -DIOhChR2(H134R)-mcherry
pHBAAV- CAG -DIOArchT-EYFP
pHBAAV- CAG -DIOC1V1 (t/t)-TS-mcherry pHBAAV- CAG -DIO-
附录 1 附录 2
一、AAV 安全使用注意事项(*非常重要!!!*)
1) AAV 相关实验请在生物安全柜(BL-2 级别)内操作。 2) 操作病毒时请穿实验服,佩戴口罩和手套,尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。 3) 操作病毒时特别小心病毒溅出。如果操作时超净工作台有病毒污染,请立即用 70%乙醇
加 1%的 SDS 溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头、离心管、培养板、培养液请用 84 消毒 液浸泡后统一处理。 4) 如需要离心,应使用密封性好的离心管,如有必要请用封口膜封口后离心。 5) 动物注射操作请在生物安全柜内(BL-2 级别)完成。 6) 病毒相关的废弃物需要特殊收集,统一经高温灭菌处理。 7) 实验完毕用洗手液清洗双手。 二、AAV 储存和稀释注意事项 1. AAV 的储存 收到病毒液后若在短期内使用,可将病毒放置于 4℃保存(一周内使用完最佳);如需长 期保存请分装后放置于-80℃。 注:a.反复冻融会降低病毒滴度(每次冻融病毒滴度会降低 10%-50%),因此在病毒使用过程中 应尽量避免反复冻融。汉恒生物已对病毒进行了分装(200 l/tube),收到后请直接放置-80℃保存即 可。
图 1、 AAV2 基因组结构示意图。 四、汉恒生物 AAV 产品服务及载体信息与现货列表 1. 汉恒 AAV 产品分类:
常规基因的过表达和干扰定制(载体列表见“七、载体构建”部分); 组织特异性启动子过表达定制(载体列表见“七、载体构建”部分); 常规启动子和组织特异性启动子驱动的 AAV-Cas9 定制; AAV 介导的光遗传、化学遗传载体现货及改造服务等(见表 1); 双标、单标 LC3 自噬流监测工具(见表 2); 组织特异性 AAV-DIO 载体的定制(原理见附件 2)。 2. 汉恒 AAV 产品特点:
hChR2(H134R)-mcherry
mcherry

pHBAAV-GFAP-ArchT-
抑制
EYFP

EYFP
GFAP(星形胶质细胞特异
红光 激活
pHBAAV-GFAPC1V1 (t/t)-TS-mcherry
启动子),中强度
mcherry

抑制
pHBAAV-GFAPArch3.0-EYFP
EYFP
T2A-ZsGreen pHBAAV-hsyn-MCS-
T2A-mCherry pHBAAV-CamkII-MCS-
T2A-ZsGreen pHBAAV-CamkII-MCS-
T2A-mCherry
可插入片段 大小
1.6 kb 1.2 kb 1.5 kb 1.5 kb 1.2 kb 1.2 kb 1.6 kb 1.6 kb 1.6 kb 1.6 kb
actin 嵌合型启动子),广 mCherry

DREADD hM4D(Gi)-mCherry
谱,强
Gq-
pHBAAV-hSyn-DIO- hSyn(人源成熟神经元特
mCherry

DREADD hM3D(Gq)-mCherry
异启动子),中强度
Gi-
pHBAAV-hSyn-DIO- hSyn(人源成熟神经元特
红光 激活
pHBAAV-CaMKIIC1V1 (t/t)-TS-mcherry
特异启动子),强
mcherry

抑制
pHBAAV-CaMKIIArch3.0-EYFP
EYFP

激活
pHBAAV-CaMKIIhCHETA-EYFP
EYFP

3) 汉恒生物 AAV 化学遗传学工具现货列表(表 3)
载体类型
安全-AAV 不参与任何疾病的发生,已经用于临床疾病的治疗;
高效-病毒滴度高达 1013 以上,组织感染能力超强;
表达周期久-AAV 免疫原性超低,基因持续表达半年以上;
最全血清型-拥有全部 12 种血清型和一系列突变体亚型,几乎可以感染所有的组织
和脏器;
组织特异性-拥有 DIO 元件载体系统和最全的组织特异性启动子工具箱,如心脏、
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