脯氨酸的提取及定量

脯氨酸（Pro）含量的提取和测定脯氨酸在植物体内起到很重要的渗透调节作用。当植物体处在逆境的环境（如干旱、冷害、高温、盐渍、病害等）中时，植物体内游离的脯氨酸的含量会出现

明显的升高。植物体内的脯氨酸的作用主要有两种，一种是调节植物体内的渗透压，使植物体不易失水；另一种则是与细胞内的蛋白质相互作用，共同维持细胞膜蛋白的稳定性。在逆境条件下，植物体内的脯氨酸的含量越高，植物体维持体内渗透压和膜蛋白稳定的能力就越强，也就是说植物体的抗性就越强。植物体内的脯氨酸比较容易溶于磺酸水杨酸的水溶液中，实验室一般选用3%的磺酸水杨酸溶液提取植物体内的脯氨酸。在弱酸性条件下，脯氨酸可以与茚三酮发生反应生成黄色物质，但是在强酸性条件下，则会生成红色物质，这种红色物质可以用甲苯萃取，并且在520nm处有最大的吸光值。

（1）绘制脯氨酸的标准曲线

配制浓度10mg/ml的脯氨酸溶液，然后稀释成10-9～1m g/ml的十个浓度梯度的标准液。各取2ml加入已经编号的试管中，然后每只试管分别加入加入2ml3%的磺酸水杨酸溶液、2ml冰醋酸和4ml 2.5%的酸性茚三酮溶液（现配现用），混匀，在沸水浴中显色60min。待试管冷却后每只试管中加入4ml的甲苯，充分摇匀后，红色物质存在于上层甲苯相中。取甲苯相测定520nm出的吸光值，并用甲苯做空白对照，根据脯氨酸的含量的对数和相应的光吸收值绘制出脯氨酸含量的标准曲线。

(2)取0.1g植物组织，剪碎放置于一个2mlEP管中，加入200ul 3%的磺酸水杨酸溶液，研磨10min至材料充分磨碎。

(3)再加入800ul的3%的磺酸水杨酸溶液，混匀。

(4)将材料放在沸水浴中浸提10分钟。

(5)等材料完全冷却后，3000rpm/min室温离心10分钟，上清液即为含有脯氨酸待

测液。

(6)在一个2ml的EP管中加入200ul的上清液，然后再加入200ul的水、200ul 的冰乙酸和400ul的2.5%的酸性茚三酮溶液[将1.25g茚三酮溶于30ml冰乙酸和20ml 6mol/L磷酸混合溶液中，搅拌加热（70℃）溶解，仅在24小时内稳定]，混匀，在沸水浴显色60分钟。待溶液冷却后，加入400ul甲苯，充分摇匀，红色物质存在于甲苯相中，取红色的甲苯相测其在520nm处的吸光值。并根据绘制的脯氨酸标准曲线计算脯氨酸的含量。