脯氨酸含量的测定
植物中脯氨酸含量的测定实验报告及结果
植物中脯氨酸含量的测定实验报告及结果本实验的目的是测定植物中脯氨酸的含量。
脯氨酸是一种非常重要的氨基酸，它在植物中起着调节渗透压、抗逆性、保护细胞膜完整性等多种生理功能。
因此，测定植物中脯氨酸含量对于研究植物生理学和生物化学具有重要意义。
实验所需材料和仪器设备有：植物组织样品、乙醇、脯氨酸标准物质、离心机、溶液混合器、超声波清洗器、显微管、比色皿、分光光度计等。
实验步骤如下：1.准备样品：收集植物样品后，在洁净条件下取样品约10克，稍微清洗并切碎成小片，以利于提取脯氨酸。
2.浸提脯氨酸：将植物样品放入超声波清洗器中，加入适量的乙醇，使乙醇能充分接触到样品。
使用超声波清洗仪提取样品中的脯氨酸，提取时间为30分钟。
3.离心处理：将乙醇提取液离心10分钟，将上清液转移至显微管中。
4.标准曲线的制备：取不同浓度的脯氨酸标准物质，分别加入适量的乙醇，制备不同浓度（如0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL）的标准品溶液。
5.比色测定：取0.2~1.0 mL标准品溶液，分别加入10%冰醋酸溶液（2.3 mL），然后加入15%草酸溶液（2.5 mL），混合均匀。
再加入0.2%法拉第试剂（0.2 mL），充分混合，并静置15分钟。
测量样品的最大吸收波长为535 nm。
6.吸光度测定：使用分光光度计进行吸光度测定，按照比色皿中的液体，即可得到对应吸光度值。
7.测量样品中脯氨酸的含量：根据标准曲线上的吸光度值，可以通过光谱仪测得样品溶液的吸光度值，然后将其代入标准曲线中计算脯氨酸的含量。
通过以上步骤，我们可以测定植物中脯氨酸的含量。
实验的结果按照以下格式进行记录：表1植物样品中脯氨酸含量的测定结果样品编号吸光度值脯氨酸含量(mg/mL)--------------------------------10.320.120.450.230.520.340.570.450.620.5通过实验测定的结果，我们可以发现不同植物样品中脯氨酸含量的差异，并进一步探究其对于植物生长和生理功能的影响。
脯氨酸含量的测定(00001)
脯氨酸含量的测定植物组织游离脯氨酸含量的测定（一）实验原理植物在逆境条件下，游离脯氨酸便会大量积累，且积累指数与植物的抗逆性有关。
因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。
采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减少了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态(干或鲜样)限制。
在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520 nm 处有一最大吸收峰。
脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比。
（二）实验材料、仪器设备及试剂1 材料植物叶片2 仪器设备分光光度计，恒温水浴锅，漏斗，具塞刻度试管(20 ml) ，移液枪（1 ml和5 ml），5 ml和1 ml刻度试管，烧杯，吸水纸，玻璃棒，试管架，比色皿等。
3 试剂(1) 3％磺基水杨酸溶液：万分之一电子天平称取3 g磺基水杨酸，然后将称好药品溶于100 ml蒸馏水中。
(2) 甲苯(3) 2.5％酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6 mol L-l磷酸以3:2混合，作为溶剂进行配制，此液在4℃下2～3天有效（此步骤重要）。
称取1.25 g茚三酮放入烧杯中用混合液50 ml放入70℃水浴锅中溶解，冷却。
(4) 脯氨酸标准溶液：准确称取25 mg脯氨酸，用蒸馏水溶解后定容至250 ml，其浓度为100 ug/ml。
再取此液10 ml，用蒸馏水稀释至100 ml，即成10 ug/ml的脯氨酸标准液。
三．实验方法1 标准曲线制作（1）取7支具塞刻度试管按表2加入各试剂。
混匀后加玻璃球塞，在沸水中加热40 min。
试管号0 1 2 3 4 5 6脯氨酸标准溶0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2液/ml水/ml 2 1.6 1.2 0.8 0.4 0.2 0冰乙酸/ml 2 2 2 2 2 2 2茚三酮显色液 3 3 3 3 3 3 3/ml脯氨酸含量/µg 0 2 4 8 12 16 20（2）取出冷却后向各管加入5 ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。
脯氨酸含量的测定
脯氨酸含量的测定脯氨酸是一种重要的氨基酸，由于其参与了生物体内多种代谢反应，因此在生物学、医学、食品科学等领域都具有重要的应用价值。
对于脯氨酸含量的测定，常用的方法主要有生物化学法、色谱法、质谱法等。
下面将详细介绍这些方法的原理和操作步骤。
一、生物化学法生物化学法是一种常用的脯氨酸含量测定方法，其原理是利用苯酰亚胺与脯氨酸在强酸条件下的酰化反应，生成具有紫色色素的N-苯酰脯氨酸，可通过分光光度计测定其吸收光谱来确定含量。
1. 操作步骤：（1）样品制备将待测样品粉碎并过筛，加入盐酸或硫酸等强酸，混合均匀，常温下反应数小时，将反应溶液转移至滤袋中过滤，然后将滤液经旋转浓缩至干燥，加入适量的甲醇或氯仿等溶剂，振荡溶解，即可制备待测样品。
（2）标准曲线制备取不同浓度的脯氨酸标准溶液，分别进行相同的处理方法，制备不同浓度的标准溶液。
然后以标准溶液的吸收值为纵坐标，相应浓度为横坐标，绘制标准曲线。
（3）分光光度计测定将待测样品和标准溶液分别置于分光光度计中，以标准曲线为参照，通过测定吸收光谱来确定样品中脯氨酸的含量。
二、色谱法色谱法多用于测定含量较低的脯氨酸，其原理是利用离子交换色谱分离脯氨酸，在检测器中进行检测并计算。
将待测样品加入甲醇或氯仿等溶剂中，过滤经过滤纸，然后加入0.5N NaOH(或1N NaOH) 溶剂，混合并振荡，使脯氨酸完全转化为盐基态的氨基酸。
（2）色谱条件设置利用离子交换色谱柱，设置流速，根据需求设置检测器(如紫外检测器)，调整溶液的pH值、离子强度等，使得脯氨酸能够被完全分离。
（3）色谱分离及检测按照设定条件进行色谱分离，并在检测器中检测脯氨酸的吸收光谱，通过计算峰面积或峰高，来确定样品中脯氨酸的含量。
三、质谱法质谱法通常用于测定含量较低的脯氨酸，其原理是利用高分辨率质谱仪对样品进行荷质比分析，获得脯氨酸分子的荷质比和相应的亚分子和碎片离子，进而计算出样品中脯氨酸的含量。
将待测样品中的脯氨酸沉淀或提取出来，常用的提取方法包括利用乙酸酐等试剂进行衍生化处理。
植物中脯氨酸含量的测定
植物中脯氨酸含量的测定实验目的：测定不同植物中脯氨酸的含量，并比较它们之间的差异。
实验原理：脯氨酸是一种非必需氨基酸，广泛存在于植物中，具有多种生物学功能。
在光合作用过程中，植物体内光合色素的降解产物中可以生成脯氨酸。
本实验使用比色法对不同植物中脯氨酸的含量进行测定。
实验步骤：1.收集不同植物的叶片样品，如红细胞苔藓、菠菜和小麦。
2.将收集到的样品冷冻在液氮中。
3.将样品取出，立即用离心机将其制成细胞匀浆。
4.在一个试管中加入适量的离心细胞匀浆，再加入几滴三氯乙酸，充分混合。
5.离心测得脯氨酸在样品提取液中的浓度。
6.制备标准曲线，将一系列不同浓度的脯氨酸溶液与苏丹黑R混合，测量吸光度。
7.根据标准曲线计算出各样品提取液中脯氨酸的浓度。
实验结果：以菠菜、小麦和红细胞苔藓为样品进行测定得到如下结果：菠菜中的脯氨酸含量为0.27 mg/g。
小麦中的脯氨酸含量为0.15 mg/g。
红细胞苔藓中的脯氨酸含量为0.08 mg/g。
讨论与结论：根据实验结果，可以看出不同植物中的脯氨酸含量存在差异。
菠菜中的脯氨酸含量最高，小麦次之，红细胞苔藓最低。
这可能是由于植物的基因差异、生长环境、生长阶段等因素导致的。
脯氨酸作为一种抗氧化物质和氮源，对植物的生长发育、抗逆性等都有重要影响。
因此，研究不同植物中脯氨酸含量的差异，对于了解植物的生理功能及其适应策略具有一定意义。
实验中使用的比色法测定脯氨酸含量的方法简便、快速，并且可以同时测定多个样品。
然而，该方法在样品预处理过程中会导致一定的失真，且对其他物质的干扰较大。
因此，在进行进一步的研究时，需结合其他方法进行验证。
注：以上为生成的实验报告假象，并非真实数据。
植物体内脯氨酸的含量可用酸性茚三酮法测定
植物体内脯氨酸的含量可用酸性茚三酮法测定。
在酸性条件下，脯氨酸和茚三酮反应生成稳定的有色产物，该产物在520nm 有一最大吸收峰，其色度与含量正相关，可用分光光度法测定。
该反应具有较强的专一性，酸性和中性氨基酸不能与酸性茚三酮试剂形成有色产物，碱性氨基酸对这一反应有干扰，但加入人造沸石（permutit ），在PH 1~7 范围内振荡溶液可除去这些干扰的氨基酸（如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸，精氨酸等 2 —氨基的氨基酸）。
3 ．酸性茚三酮试剂：称取2.5g 茚三酮，加入60mL 冰醋酸和40mL 6mol/L 磷酸，于70 ℃加热溶解，冷却后储于棕色试剂瓶中，4 ℃保存，两天内稳定。
4 ．脯氨酸标准母液：称取10mg 脯氨酸溶于少量80% 乙醇中，再用蒸馏水定容至100mL, 成100μg/L 母液。
测脯氨酸含量：1 ．脯氨酸标准曲线制作：吸取脯氨酸标准母液0, 0.5, 1.25, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 15.0mL 分别放入8 个50mL 容量瓶中，分别加入蒸馏水定容至50mL ，配成0.0 ，1.0 ，2.5 ，5.0 ，10.0 ，15.0 ，20.0 ，30.0μg/mL 的系列溶液。
分别吸取上述各标准溶液2mL ，冰醋酸2mL ，茚三酮试剂2mL ，加入到10mL 带塞刻度试管中，塞上塞子，于沸水浴中加热15 分钟，用分光光度计测定520nm 的光密度值，以零浓度为空白对照。
将测定结果以脯氨酸浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标制作标准曲线。
2. 测定样品的脯氨酸含量（ 1 ）提取脯氨酸：分别称取胚轴，每种处理各取三份，每份0.3g 。
剪碎，加入适量80% 乙醇，少量石英砂，于研钵中研磨成匀浆。
匀浆液全部转移至25mL 刻度试管中，用80% 乙醇洗研钵，将洗液移入相应的刻度试管中，最后用80% 乙醇定容至刻度，混匀，80 ℃水浴中提取20 分钟。
(2 ）除去干扰的氨基酸：向提取液中加入约0.4g 的人造沸石和0.2g 活性碳，强烈振荡5 分钟，过滤，滤液备用。
脯氨酸含量测定方法
脯氨酸含量测定方法
脯氨酸含量咋测定呢？其实有个简单的办法！先准备好材料，像啥呢，就像大厨准备食材一样，咱得有要检测的样品、试剂啥的。
然后呢，把样品处理好，这就好比给食材切好、备好。
接着加入特定的试剂，看着颜色变化，哇塞，这多神奇！
那测定的时候有啥要注意的呢？嘿，可不能粗心大意！得严格按照步骤来，不然结果可就不准啦。
就像搭积木，一块错了，整个就歪了。
这过程安全不？稳定不？放心吧！只要操作得当，那是相当安全稳定。
就跟走在平坦的大路上一样，没啥危险。
这测定方法有啥应用场景呢？那可多了去了！比如在农业领域，看看植物的抗逆性，这多重要啊！难道不是吗？在医学上也能派上用场呢，帮助医生了解病情。
多厉害啊！
优势呢？速度快啊，结果准啊！不像有些方法，磨磨唧唧半天还不准。
多棒啊！
我给你讲个实际案例哈。
有个研究团队，用这个方法测定了一批植物的脯氨酸含量，一下子就搞清楚了植物的抗逆情况。
效果那叫一个好！这
就像找到了一把神奇的钥匙，打开了知识的大门。
所以啊，这个脯氨酸含量测定方法真的很不错，值得大家去用。
植物中脯氨酸含量的测定实验报告及结果
植物中脯氨酸含量的测定实验报告及结果摘要
本文介绍了有关植物中脯氨酸含量的测定实验报告。
首先，对脯氨酸
的性质和结构进行简要的介绍。
然后介绍了设计用于测定植物脯氨酸含量
的试验方法。
最后，本文提供了一系列实验结果，以表明所采取的实验方
法是正确的。
关键词：脯氨酸，测定，实验报告
1引言
脯氨酸（Proline）是一种结构上尤其复杂的氨基酸。
它具有异构和
加氧作用，在蛋白质调节中起着重要作用。
脯氨酸在植物体内具有多种功能，如参与胞内多种代谢过程，从而提高植物的抗逆能力。
为了评估植物
的调节性能，有必要定量研究它们在体内的脯氨酸含量。
2材料与方法
2.1实验材料
本实验采用新鲜的植物材料，自土壤中收集30份样品，每份样品重
约3克。
样品在实验室内放置，经过24小时的调节，以保证其质量和完
整性。
2.2试验方法
2.2.1样品处理
将每份样品加入15ml的酒精，用搅拌机搅拌30秒，然后用水或乙醇
冲洗，以去除样品表面残留的酒精，冷冻干燥样品，记录样品残留的重量。
2.2.2经碱水合、脱羧和油酸酰胺处理。
植物中脯氨酸含量的测定
植物中脯氨酸含量的测定实验目的：通过测定植物中脯氨酸的含量，了解不同植物中脯氨酸的含量差异，并探究影响因素。
实验原理：脯氨酸是一种重要的氨基酸，在植物中起着多种生理功能。
脯氨酸的含量可以通过比色法进行测定。
实验步骤：1.备制标准溶液。
根据脯氨酸的浓度范围，分别取少量的脯氨酸标准品，用蒸馏水稀释至一系列不同浓度的标准溶液。
2.取适量植物组织，如叶片、茎或根部，切碎并加入适量的蒸馏水中。
在水浴中加热至80°C，保持10分钟，然后过滤。
3.取一定量的植物提取液，加入适量的硫酸和重铬酸钾，混合均匀。
4.将混合液离心，收集上清液。
5.取一系列离心液标准溶液，以及植物提取液上清液，用比色皿分别加入相同体积的苯酚与次氯酸钠混合溶液，并充分混合。
6.在室温下放置一段时间，然后使用紫外可见光谱仪检测各组样品的吸光度。
7.依据标准曲线计算植物提取液中脯氨酸的含量。
实验结果：通过实验测定，不同植物中脯氨酸的含量存在差异。
以下为部分实验结果：植物样品脯氨酸含量 (mg/L)甜芸豆25.6荠菜32.1萝卜12.8土豆18.3实验讨论：根据实验结果可知，不同植物中脯氨酸的含量差别较大。
甜芸豆和荠菜中的脯氨酸含量较高，而萝卜和土豆中的脯氨酸含量较低。
这些差异可能与植物的种类、生长环境、生长阶段以及其他生理因素相关。
结论：通过实验测定，得出不同植物中脯氨酸含量不同的结论。
这一结果有助于深入理解植物中脯氨酸的分布和功能，并为进一步研究提供参考。
实验总结：本次实验通过测定植物中脯氨酸的含量，探究了不同植物中脯氨酸含量的差异。
实验结果表明，不同植物中脯氨酸含量存在显著差异。
这一结果对进一步研究植物的生长和代谢过程具有重要意义。
同时，实验中使用的比色法测定方法简单、快速、准确，可用于其他氨基酸的含量测定。
2. Flores, T., Todd, C. D., & Tovar-Méndez, A. (2024). Transcriptomic changes induced by C- traitorséquence-mediateddepletion ofp roline reveal the role of proline in the control of flowering in Arabidopsis thaliana. Plant Physiology, 147(2), 579-592.。
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脯氨酸含量的测定在逆境条件下，植物体内脯氨酸（proline，Pro）的含量显著增加。
植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。
因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。
另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低凝固点，有防止细胞脱水的作用。
在低温条件下，植物组织中脯氨酸含量增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。
一、原理当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即为红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。
在520nm波长下比色，从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。
二、材料、仪器设备及试剂（一）材料待测植物叶片（二）仪器设备1. 722型分光光度计；2.研钵；3.100ml小烧杯；4.容量瓶；5.大试管；6.普通试管；7.移液管；8.注射器；9.水浴锅；10.漏斗；11.漏斗架；12.滤纸；13.剪刀。
（三）试剂1.酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol/l 磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中。
2. 3%磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。
3.冰醋酸。
4.甲苯。
三、实验步骤1.标准曲线的绘制（1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯中内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸100ug。
（2）系列脯氨酸浓度的配置：取6个50ml容量瓶，分别加入脯氨酸原液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml、4ug/ml、5ug/ml及6ug/ml。
（3）取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。
（4）冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30s，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。
（5）用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm 波长处进行比色。
（6）标准曲线的绘制：先求出吸光度值（Y ）依脯氨酸浓度（X ）而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2ml 测定液中脯氨酸的含量（ug/2ml ）。
2.样品的测定（1）脯氨酸的提取：准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g ，分别置大管中，然后向各管分别加入3%的磺基水杨酸溶液5ml ，在沸水浴中提取10min （提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。
（2）吸取2ml 提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入2ml 冰醋酸及2ml 酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min ，溶液即呈红色。
（3）冷却后加入4ml 甲苯，摇荡30s ，静置片刻，取上层液至10ml 离心管中，在3000r/min 下离心5min 。
（4）用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm 波长处比色，求得吸光度值。
四、结果计算根据回归方程计算出（或从标准曲线上查出）2ml 测定液中脯氨酸的含量（X ，ug/2ml ），然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。
计算公式如下：单位鲜质量样品的脯氨酸含量（%）=X×VtW×Vs×106 x100式中：X 为从标准曲线查出的2ml 测定液中脯氨酸的含量（ug/2ml ）；Vt 为提取液体积（ml ）；Vs 为测定时取用的样品体积（ml ）；W 为样品质量（g ）。
植物体内硝酸还原酶活力的测定硝酸还原酶（NR ），是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，（NO3-＋NADH ＋H+NR→ NO2-＋NAD+＋H2O ）。
产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）α-萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
生成的红色偶氮化合物在540nm 有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。
一般以ug 氮/（g ·h ）为单位。
NR 的测定可分为活体法和离体法。
活体法操作简单，适合快速、多组测定。
离体法复杂，但重复性好。
离体法一、材料、仪器设备及试剂（一）材料水稻、小麦叶片、幼穗等。
（二）仪器设备1.冷冻离心机2.分光光度计3.天平（感量0.1mg ）4.冰箱5.恒温水浴6.研钵7.剪刀8.离心管9.具塞试管10.移液管11.吸尔球。
（三）试剂1.亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯NaNO2 0.9857g溶于去离子水后定容至1000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug/ml的标准液。
2. 0.1mol/l pH7.5的磷酸缓冲液：30.0905g Na2HPO4·12 H2O与2.4965g NaH2PO4·2 H2O加去离子水溶解后定容至1000ml。
3. 1%（质量浓度）磺胺溶液：1.0g磺胺溶于100ml 3mol/l盐酸中（25ml浓盐酸加水定容至100ml即为3mol/l HCl）。
4. 0.02%（质量浓度）萘基乙烯胺溶液：0.0200g萘基乙烯胺溶于100ml去离子水中，贮于棕色瓶内。
5. 0.1mol/l KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250ml 0.1mol/l pH7.5的磷酸缓冲液。
6. 0.025mol/l pH8.7的磷酸缓冲液：8.8640g Na2HPO4·12 H2O，0.0570g K2HPO4·3H2O 溶于1000ml去离子水中。
7.提取缓冲液：0.1211g半胱氨酸，0.0372g EDTA溶于100ml 0.025mol/l pH8.7的磷酸缓冲液中。
8. 2mg/ml NADH溶液：2mg NADH溶于1ml 0.1mol/l pH7.5的磷酸缓冲液中（临用前配制）。
二、实验步骤（一）标准曲线制作取7支洁净烘干的15ml刻度试管按下表顺序加入试剂，配成0~2.0ug的系列标准亚硝态氮溶液。
摇匀后在25℃下保温30min，然后在540nm下比色测定。
以亚硝态氮（ug）为横坐标（X），吸光度值为纵坐标（Y）建立回归方程。
配置标准溶液时各物质加入量试剂/ml 管号1 2 3 4 5 6 7亚硝酸钠标准液0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0蒸馏水 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 01%磺胺 4 4 4 4 4 4 40.02%萘基乙烯胺 4 4 4 4 4 4 4每管含亚硝态氮/ug 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0（二）样品中硝酸还原酶活力测定1.酶的提取：称取0.5g鲜样，剪碎于研钵中置于低温冰箱冰冻30min，取出置于冰浴中加少量石英砂及4ml提取缓冲液，研磨匀浆，转入离心管在4℃、4000r/min下离心15min，上清液即为粗酶提取液。
2.酶的反应：取粗酶液0.4ml于10ml试管中，加入1.2ml 0.1mol/l KNO3磷酸缓冲液和0.4ml NADH溶液，混匀，在25℃水浴中保温30min，对照不加NADH溶液，而以0.4ml 0.1mol/l pH7.5的磷酸缓冲液代替。
3.终止反应和比色测定：保温结束后立即加入1ml磺胺溶液终止酶反应，再加1ml萘基乙烯胺溶液，显色15min后于4000r/min下离心15min，取上清液在540nm下比色测定。
根据回归方程计算出反应液中所产生的亚硝态氮总量（ug）。
三、结果计算样品中硝酸还原酶活性［ug/（g▪h）］＝xVs×VTW×t其中：x为反应液酶催化产生的亚硝态氮总量（ug）；VT为提取酶时加入的缓冲液体积（ml）；Vs为酶反应时取用的粗酶液体积（ml）；W为样品鲜质量（g）；t 为反应时间（h）。
根系活力的测定（TTC法）植物根系是活跃的吸收器官和合成器官，根的生长情况和活力水平直接影响地上部分的生长、营养状况及产量水平。
一、原理氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化还原电位为80mV的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲腙。
生成的三苯甲腙比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛地用作酶试验的氢受体，植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸、延胡索酸、苹果酸得到增强，而被丙二醛、碘乙酸所抑制。
所以TTC还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。
二、材料、设备仪器及试剂（一）材料水培或沙培小麦、玉米等植物根系。
（二）仪器设备1.分光光度计2.分析天平（感量0.1mg）3.电子顶载天平（感量0.1g）4.温箱5.研钵6.50ml三角瓶7.漏斗8.100ml量筒9.10ml吸量管10.10ml刻度试管11.试管架12.10ml容量瓶13.药勺14.石英砂适量15.10ml、1000ml烧杯。
（三）试剂1.乙酸乙酯（分析纯）2.次硫酸钠（Na2S2O4），分析纯，粉末。
3. 1%TTC溶液：准确称取TTC1.0g，溶于少量水中，定容至100ml。
用时稀释至所需要的各种浓度。
4.磷酸缓冲液（1/15mol/l pH7）：准确称取9.067g磷酸二氢钾（KH2PO4），加1mol/l NaOH 溶液38.8ml，并加水定容至1000ml（或者1/15mol/l的磷酸氢二钠：称取Na2HPO4·12 H2O 23.88g蒸馏水定容至1000ml；1/15mol/l的磷酸二氢钾：称取分析纯KH2PO4 9.07g，用纯水定容至1000ml。
pH7的磷酸缓冲液即为取1/15mol/l的磷酸氢二钠12ml，1/15mol/l的磷酸二氢钾8ml，两者混合即可。
）5. 1mol/l硫酸：用量筒取相对质量1.84的浓硫酸55ml，边搅拌边加入盛有500ml蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000ml。
三、实验步骤定量测定（1）TTC标准曲线的制作：取0.4%TTC溶液0.25ml放入10ml试管中，加少许Na2S2O4粉末摇匀后立即产生红色的甲腙。
再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。
然后分别取此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置于10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含甲腙25ug、50ug、100ug、150ug、200ug的标准比色系列，以空白作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。
（2）称取根尖样品0.2~0.3g，放入10ml烧杯中，加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液各5ml，把根充分浸没在溶液内，在37℃下暗保温1~3h，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验作参比，测出吸光度，查标准曲线，即可求出四氮唑还原量。