羟脯氨酸的测定方法

1羟脯氨酸含量测定

2羟脯氨酸标准曲线绘制

3试剂的配制【6-7】

[6] 李秋营,姚汝琳.细胞中羟脯氨酸的测定.山西医科大学学报.2001,32(6):558-559

[7] David J Etherington, Trevor J Sims. Detection and Estimation of Collagen[J]. J Sci Food Agric, 1981,32:539-546

柠檬酸缓冲液：柠檬酸钠120g、冰醋酸12mL、柠檬酸46g、氢氧化钠34g 溶解于蒸馏水中，调整pH 值至6.0，然后定容至1000mL。

0.05mol/L 氯胺T 溶液：称取氯胺T 7.05g，溶解于100mL 蒸馏水中，然后加入乙二醇独甲醚150mL，再加入250mL 柠檬酸缓冲液混合均匀。

对二甲基氨基苯甲醛: 试剂 A：取无水乙醇20mL，慢慢加入浓硫酸2.74mL；试剂B：取对二甲基氨基苯甲醛12.0g，慢慢加入无水乙醇40mL，水浴加热使其完全溶解并冷却至室温，然后将A 液慢慢加入B，混合均匀。

3.5mol/L 高氯酸溶液：取27mL 高氯酸，以蒸馏水定容到100mL。

羟脯氨酸标准曲线的绘制羟脯氨酸标准储存液：准确称取L-羟基脯氨酸标准品50mg，加入0.01mol/L 盐酸中溶解，稀释并定容到100mL，在冰箱中保存。

羟脯氨酸标准工作液：吸取羟脯氨酸标准储存液10mL到50mL 容量瓶中，用蒸馏水定容到50mL(临用前配)，浓度为100μg/mL。

4标准曲线绘制

分别吸取羟脯氨酸标准工作液1.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5mL，用蒸馏水定容到50mL容量瓶中。以蒸馏水为空白，分别吸取上述标准液1mL，加入1mL 柠檬酸缓冲液和1mL 0.05mol/L 氯胺T 溶液，室温(25 ℃) 氧化10min 后，加入高氯酸1mL(3.5mol/L)，放置10min，加入对二甲基氨基苯甲醛试剂1mL，在65℃水浴显色10min，冷却后在560nm处测吸光度。以羟脯氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，求出回归方程。

浓度μg/mL0.50 1.00 1.25 1,50 1,75 2.00 2.25

0.612

吸光度A560 0.134 0.284 0.347 0.409 0.477 0.55

6样品水解将样品反复绞碎，充分混合。称取5.000g样品放入250ml三角瓶中，加

入6M盐酸（SnCl2 0.75%）100ml，置于电热鼓风干燥箱中105℃下水解16h，分两天进行。

7样品转化和测定

将水解完的水解液过滤？ml容量瓶中，蒸馏水定容到刻度。混合均匀后，吸取5ml 滤液于烧杯中，用10M和1M的氢氧化钠调滤液的pH值为8.0±0.2。将调好的滤液用滤纸过滤于250ml容量瓶中，蒸馏水定容到刻度。准确吸取此溶液1ml于20ml的比色管中，以下操作同标准曲线绘制。按标准曲线和稀释倍数计算羟脯氨酸含量。