southern blot

实验名称：Southern 印迹杂交
一、实验目的
核酸杂交是分子生物学的一个重要手段，它应用于克隆鉴定，同源性分析，以及癌症、遗传疾病和致病细菌、病毒和寄生虫的分子诊断。

通过本实验了解和掌握Southern杂交的基本原理和操作。

二、实验原理
根据DNA变性和复性发展的一种实验技术，就是分子杂交（hybridization)。

指两条来源不同但具有同源性的核酸单链在一定条件下，根据碱基互补的原则缔结成双链分子。

Southern杂交是指一种利用标记的探针与膜上靶DNA片段进行杂交的技术，检测靶DNA片段中是否存在与探针同源的序列。

其主要步骤包括：
⑴基因组DNA的限制性酶切；
⑵DNA酶切片段的电泳分离和转移；
⑶杂交及检测。

基因组DNA采用实验五中制备的HL-60细胞基因组DNA，接着是将DNA进行限制性酶切；本实验检测的靶DNA为原癌基因c-myc，c-myc的致癌机理包括染色体异位和病毒基因组的插入突变而导致c-myc基因的过度表达。

基因的变化可通过Southern杂交检测。

c-myc基因的酶切位点有EcorI、ClaI、HindIII等，基因组DNA首先经限制内切酶酶切成较短的片段，经电泳分开，然后再经碱变性
使DNA成为单链，有利于结合于膜上和进行下一步杂交。

转移是根据毛细管作
用原理进行的。

单链DNA经高温烘烤定于膜上。

杂交是根据靶DNA单链与探针之间的碱基互补的原则进行。

本实验采用的探针为1.4kb的ClaI和EcorI酶切片段，对应于c-myc的第3个外显子的部分片段。

探针用非放射性标记物地高辛（DIG）标记。

杂交条带通过抗-DIG-碱性磷酸酶及其酶底物显色。

为了降低背景，减少标记探针的非特异性结合，一般先行预杂交，用牛血清白蛋白（BSA）、葡聚糖（Ficoll）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）及去污剂SDS和十二
烷基磺酸钠封闭膜上非特异结合位点，还在杂交液中加入小分子鲑精DNA作为
竞争性封闭剂。

杂交一般在5或6xSSC和封闭剂的溶液中进行，水溶液中杂交温度为Tm-25°（65-70°）。

杂交的温度的确定除了考虑探针的程度和G+C的含量外，还要考虑所用探针与被检DNA的同源性的高低。

同样根据这些因素来选择
最佳洗膜条件。

三、实验器材和试剂（略）
四、实验步骤
1、基因组DNA的限制性酶切
取2个1.5ml离心管按下列量依次加入基因组DNA、10X酶缓冲液，酶，做好标记。

HL60基因组DNA 10 mg 16 ul HL60基因组DNA 10 mg 16 ul
10×Buffer E 2 ul 10×Buffer R 2 ul EcoR I（10 U/ml） 2 ul Hind III（10 U/ml） 2 ul
总体积20 ul 20 ul 37℃保温1.5小时
2、电泳分离
①保温期间，浇一块凝胶板：称0.4g琼脂糖加40ml1xTAE，微波炉低火加热1分钟，让琼脂糖完全溶解，稍微冷却后，加EB2 ul，浇在封好的并已插上梳子的凝
胶板上，移去气泡，室温放置40分钟以上。

②DNA酶切后加1/5体积6x加样缓冲液。

③取阳性对照1000pg和20pg，加ddH2O至12 ul，加1/5体积6x加样缓冲液。

④取基因组DNA10ug，加ddH2O至12 ul，加1/5体积6x加样缓冲液。

⑤将凝胶放入电泳槽中，加入1xTAE，直到液面高出凝胶1mm，将以上各样品小心加入样品槽中，两组共用一块凝胶，共7个样，从左至右依次为：1未酶切基因组，2 EcorI酶切，3 HindIII酶切，4阳性对照（4.8kb线性c-myc），5 EcorI酶切，6 HindIII 酶切，7未酶切基因组。

⑥插上电源，负极在样品槽一边，DNA将向阳极跑，80V电泳2小时左右，直到溴酚蓝染料跑到接近凝胶尾部，在电泳期间做好胶变性和转移准备。

⑦紫外灯下观察和拍照。

3、变性
①将凝胶浸在5倍体积的胶变性液中, 慢慢摇动20分钟。

②ddH2O洗2次。

③在胶中和液中慢慢摇动15分钟。

4、转移
①在搪瓷盘中加入300 ml 10×SSC，放上培养皿和小玻璃板。

②将3张长滤纸浸湿，逐张放在玻璃板上，用移液管的滚动，赶走气泡。

③切除多余凝胶，小心地将凝胶放在滤纸上（加样孔面向下），赶走滤纸与胶之间的气泡。

④再将与胶大小相同的尼龙膜（浸湿）放在胶上，同样不能有气泡，然后放上三张浸湿的滤纸，赶走气泡。

⑤紧贴凝胶四周各放一张X光片。

⑥小心蒙上一张比搪瓷盘大的保鲜膜。

保鲜膜要紧贴滤纸，但不能让滤纸移动。

⑦用刀片在离滤纸周围约1-2 mm处，轻轻割断保鲜膜，但不能割破滤纸。

取走滤纸上的保鲜膜。

⑧整齐地放上草纸，数张草纸一折为二，草纸堆要高出搪瓷盘边约5 cm。

⑨在草纸上放上玻璃板, 压上约500 g重的重物, 转移过夜。

5、固定
①将胶和尼龙膜一起翻过来,用铅笔深入加样槽在尼龙膜上画上槽的位置。

②正面朝上放在紫外交联仪中，交联固定。

6、杂交和洗膜
①将尼龙膜放入杂交管内, 加预杂交液, 68℃封闭6小时。

②倒出预杂交液, 加杂交液，68℃杂交过夜。

③回收杂交液（可重复使用），将膜放在洗膜溶液I（2xSSC,0.1%SDS）中, 室温洗2次, 每次摇动5分钟。

④再在洗膜溶液II（0.5xSSC, 0.1%SDS）中, 68℃洗2次, 每次摇动15分钟。

7、检测
①将膜在缓冲液1(马来酸缓冲液)中漂洗3分钟。

②在缓冲液2（封闭液）中室温摇动封闭30分钟。

③在抗体溶液中室温摇动，孵育30分钟。

④用洗膜溶液III（马来酸缓冲液，0.3%吐温）洗2次, 每次15分钟。

⑤在缓冲液3（检测缓冲液）中平衡3分钟。

⑥将膜与新鲜配制的显色溶液一起在黑暗中温育0.5-16小时。

⑦当条带显色到合适的深度后, 或在膜背景变深前, 用TE洗去底物液，干燥保存。

五、实验结果
图1 电泳图2 转膜显色
7 6 5 4 3 2 1
1未酶切基因组， 2 EcorI酶切，
3 HindIII酶切，4阳性对照（4.8kb线性c-myc），
5 EcorI酶切，
6 HindIII酶切，
7未酶切基因组。

六、注意事项
1、DNA限制性酶的用量1-5U/ugDNA，时间为1-20小时。

中途可取少量（小于
十分之一）电泳检测是否酶切完全。

2、EDTA会抑制酶活性，在酶解反应液中的浓度小于0.25mmol/l为佳。

3、内切酶一般保存在甘油中，甘油会抑制酶活性，因此，所加入酶的体积应小于反应总体积的十分之一，否则应将反应体积加大。

4、若基因组DNA浓度低，可在酶切后用一冲成点浓缩DNA后跑胶。

5、标记探针在加入杂交液之前，一定要加热变性处理，并且要先在杂交液中混匀后加入，不要直接加在膜上。

6、杂交也可以在杂交袋中进行。

7、含有DIG标记探针的杂交液可以放在-20°C保存，反复多次使用，每次用前在68°C热变性。

8、为了获得最佳效果，第一次使用的探针，可做系列模拟杂交，即将小块尼龙膜在不同探针浓度的杂交液中杂交过夜，然后经显色检测，采用背景可以接受的最高的探针浓度进行真实杂交。

9、第一次杂交的DNA可用碱去除探针（限于尼龙膜），用第二个探针做预杂交
和杂交。

10、杂交的灵敏度取决于杂交液中探针的弄得和显色时间。

11、对于尼龙膜可采用碱溶液转移，更有利于DNA的结合。

12、若目的片段大小大于10kb可用0.25mol/lHCl先部分脱嘌呤，使片段变短，便于有效转移。

七、实验讨论（对实验过程、结果的讨论；自己的体会等）
影响杂交的因素：
1、待检核酸分子的浓度和长度，浓度越大，复性速度越快，敏感性越高；分子越大，转膜越困难，敏感性下降。

2、探针的性质（标记效率、浓度，核酸性质）：对于单链探针，浓度越高，杂交率增加；探针标记方法和检测方法的选择。

进行探针标记的标记物分两大类：放射性和非放射性。

放射性标记物的灵敏度极高，可检测到10-14—10-18g的物质，在最适条件下，可检测出样品中少于1000个分子的核酸含量，但是存在着放射性污染及放射核素发生衰变所产生的不稳定性两大缺点。

非放射性标记物（生物素、地高辛、荧光物质、酶类、金属Hg等）优点是无放射性污染，稳定性好，可以较长时间存放等。

本实验采用地高辛连接于dUTP上进行标记，地高辛标记的探针与靶核酸杂交后，用带有碱性磷酸酶的抗地高辛抗体进行免疫结合反应，通过酶底物的化学显色来显示。

与放射性标记相比，地高辛标记探针具有非放射性探针的优点，对人体无害，不受半衰期限制，探针可以长期保存。

与生物素标记探针相比，地高辛探针不受组织、细胞中内源性生物素的干扰，敏感性高。

3、杂交液体积、温度和杂交时间：体积越小，杂交动力学越高；DNA/DNA杂交适宜的复性温度为比Tm低20～25℃；温度↓非特异性↑；温度↑敏感性↓。

4、杂交液的离子强度：低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加（Na+的作用），高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进行序列不完全同源的杂交时，必须维持杂交液与洗膜液中较高的盐浓度。

5、非特异性杂交反应：预杂交的作用，杂交前封闭膜上非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异吸附。

常用的封闭物：①变性非特异DNA：鲑鱼精子DNA，小牛胸腺DNA，②高分子化合物：脱脂奶粉等。

6、杂交后的漂洗：盐浓度、温度、次数，体积；漂洗从低严谨度（低温高盐）→高严谨度（高温低盐）。

7、固相膜的选择：阳离子尼龙膜。

8、杂交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸杂交的Tm，含30%—50%甲酰胺的杂交溶液温度能降低到30—42°C。

使用甲酰胺的优点：低温下探针更稳定，能更好地保留非共价结合的核酸。

结果分析
本实验凝胶电泳后，紫外灯下观察1-5条带均有DNA片段显示（1未酶切基因组，2 EcorI酶切，3 HindIII酶切，4阳性对照：4.8kb线性c-myc，5 EcorI酶切，）；
6、7加样空所对应条带无DNA片段显示（6 HindIII酶切，7未酶切基因组）。

可能是因为6、7加样空加样时未加入加样空内，或配制溶液时DNA含量过少。

转膜结果中只有阳性对照组有杂交后显色，可能原因有：①本实验采用毛细管法向上转移，可能是由于转膜速度慢、效率低导致的转膜不完全，使DNA含量非常少，以至于无法抗-DIG-碱性磷酸酶及其酶底物显色；②DNA含量过少，非放射性标记探针法灵敏度不高，可以试用放射性探针标记法提高灵敏度；③预杂交液封闭非特异性结合位点时也结合了含量很低的待测DNA位点，可以尝试用不同浓度的预杂交液来封闭非特异性位点；④洗膜条件有：低严格度（低温、高盐）、高严格度（高温、低盐），随着盐浓度增加，杂交率增加（Na+的
作用），高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，所以洗膜时一定要按照低严格度→高严格度，可以减少DNA的流失。