southern blot

实验名称：Southern 印迹杂交

一、实验目的

核酸杂交是分子生物学的一个重要手段，它应用于克隆鉴定，同源性分析，以及癌症、遗传疾病和致病细菌、病毒和寄生虫的分子诊断。通过本实验了解和掌握Southern杂交的基本原理和操作。

二、实验原理

根据DNA变性和复性发展的一种实验技术，就是分子杂交（hybridization)。指两条来源不同但具有同源性的核酸单链在一定条件下，根据碱基互补的原则缔结成双链分子。

Southern杂交是指一种利用标记的探针与膜上靶DNA片段进行杂交的技术，检测靶DNA片段中是否存在与探针同源的序列。其主要步骤包括：

⑴基因组DNA的限制性酶切；

⑵DNA酶切片段的电泳分离和转移；

⑶杂交及检测。

基因组DNA采用实验五中制备的HL-60细胞基因组DNA，接着是将DNA进行限制性酶切；本实验检测的靶DNA为原癌基因c-myc，c-myc的致癌机理包括染色体异位和病毒基因组的插入突变而导致c-myc基因的过度表达。基因的变化可通过Southern杂交检测。c-myc基因的酶切位点有EcorI、ClaI、HindIII等，基因组DNA首先经限制内切酶酶切成较短的片段，经电泳分开，然后再经碱变性

使DNA成为单链，有利于结合于膜上和进行下一步杂交。转移是根据毛细管作

用原理进行的。单链DNA经高温烘烤定于膜上。杂交是根据靶DNA单链与探针之间的碱基互补的原则进行。本实验采用的探针为1.4kb的ClaI和EcorI酶切片段，对应于c-myc的第3个外显子的部分片段。探针用非放射性标记物地高辛（DIG）标记。杂交条带通过抗-DIG-碱性磷酸酶及其酶底物显色。

为了降低背景，减少标记探针的非特异性结合，一般先行预杂交，用牛血清白蛋白（BSA）、葡聚糖（Ficoll）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）及去污剂SDS和十二

烷基磺酸钠封闭膜上非特异结合位点，还在杂交液中加入小分子鲑精DNA作为

竞争性封闭剂。杂交一般在5或6xSSC和封闭剂的溶液中进行，水溶液中杂交温度为Tm-25°（65-70°）。杂交的温度的确定除了考虑探针的程度和G+C的含量外，还要考虑所用探针与被检DNA的同源性的高低。同样根据这些因素来选择

最佳洗膜条件。

三、实验器材和试剂（略）

四、实验步骤

1、基因组DNA的限制性酶切

取2个1.5ml离心管按下列量依次加入基因组DNA、10X酶缓冲液，酶，做好标记。

HL60基因组DNA 10 mg 16 ul HL60基因组DNA 10 mg 16 ul

10×Buffer E 2 ul 10×Buffer R 2 ul EcoR I（10 U/ml） 2 ul Hind III（10 U/ml） 2 ul

总体积20 ul 20 ul 37℃保温1.5小时

2、电泳分离

①保温期间，浇一块凝胶板：称0.4g琼脂糖加40ml1xTAE，微波炉低火加热1分钟，让琼脂糖完全溶解，稍微冷却后，加EB2 ul，浇在封好的并已插上梳子的凝

胶板上，移去气泡，室温放置40分钟以上。

②DNA酶切后加1/5体积6x加样缓冲液。

③取阳性对照1000pg和20pg，加ddH2O至12 ul，加1/5体积6x加样缓冲液。

④取基因组DNA10ug，加ddH2O至12 ul，加1/5体积6x加样缓冲液。

⑤将凝胶放入电泳槽中，加入1xTAE，直到液面高出凝胶1mm，将以上各样品小心加入样品槽中，两组共用一块凝胶，共7个样，从左至右依次为：1未酶切基因组，2 EcorI酶切，3 HindIII酶切，4阳性对照（4.8kb线性c-myc），5 EcorI酶切，6 HindIII 酶切，7未酶切基因组。

⑥插上电源，负极在样品槽一边，DNA将向阳极跑，80V电泳2小时左右，直到溴酚蓝染料跑到接近凝胶尾部，在电泳期间做好胶变性和转移准备。

⑦紫外灯下观察和拍照。

3、变性

①将凝胶浸在5倍体积的胶变性液中, 慢慢摇动20分钟。

②ddH2O洗2次。

③在胶中和液中慢慢摇动15分钟。

4、转移

①在搪瓷盘中加入300 ml 10×SSC，放上培养皿和小玻璃板。

②将3张长滤纸浸湿，逐张放在玻璃板上，用移液管的滚动，赶走气泡。

③切除多余凝胶，小心地将凝胶放在滤纸上（加样孔面向下），赶走滤纸与胶之间的气泡。

④再将与胶大小相同的尼龙膜（浸湿）放在胶上，同样不能有气泡，然后放上三张浸湿的滤纸，赶走气泡。

⑤紧贴凝胶四周各放一张X光片。

⑥小心蒙上一张比搪瓷盘大的保鲜膜。保鲜膜要紧贴滤纸，但不能让滤纸移动。

⑦用刀片在离滤纸周围约1-2 mm处，轻轻割断保鲜膜，但不能割破滤纸。取走滤纸上的保鲜膜。

⑧整齐地放上草纸，数张草纸一折为二，草纸堆要高出搪瓷盘边约5 cm。

⑨在草纸上放上玻璃板, 压上约500 g重的重物, 转移过夜。

5、固定

①将胶和尼龙膜一起翻过来,用铅笔深入加样槽在尼龙膜上画上槽的位置。

②正面朝上放在紫外交联仪中，交联固定。

6、杂交和洗膜

①将尼龙膜放入杂交管内, 加预杂交液, 68℃封闭6小时。

②倒出预杂交液, 加杂交液，68℃杂交过夜。

③回收杂交液（可重复使用），将膜放在洗膜溶液I（2xSSC,0.1%SDS）中, 室温洗2次, 每次摇动5分钟。

④再在洗膜溶液II（0.5xSSC, 0.1%SDS）中, 68℃洗2次, 每次摇动15分钟。

7、检测

①将膜在缓冲液1(马来酸缓冲液)中漂洗3分钟。

②在缓冲液2（封闭液）中室温摇动封闭30分钟。

③在抗体溶液中室温摇动，孵育30分钟。

④用洗膜溶液III（马来酸缓冲液，0.3%吐温）洗2次, 每次15分钟。

⑤在缓冲液3（检测缓冲液）中平衡3分钟。

⑥将膜与新鲜配制的显色溶液一起在黑暗中温育0.5-16小时。