新基因功能研究的策略与方法
功能基因组学及其研究方法
第22页，幻灯Βιβλιοθήκη 共51页（三）实验性研究基因功能
基因克隆 基因敲除（knock-out） 转座子插入突变 基因的超表达 反义RNA技术 RNAi
第23页，幻灯片共51时代
第15页，幻灯片共51页
（一）鉴定DNA序列中的基因 计算机对基因组序列(DNA序列)进行分析，
包括鉴定和描述推测的基因、非基因序列及 其功能。
第16页，幻灯片共51页
根据序列分析搜寻基因
☺ 查找开放阅读框（open reading frame, ORF）
☺ 开放阅读框都有一个起始密码子，ATG，还 要有终止密码子。
研究内容两大类：DNA 数据分析； 蛋白质数据分析。
第20页，幻灯片共51页
DNA序列分析
基因结构域分析，包括启动子、转录因子 结合序列、内含子、外显子、重复序列、 开放读码框架等。
同源分析和检索，包括DNA数据库、EST 数据库、STS数据库、Unigene数据库、 Swissprot数据库等。
A dot indicates the promoter for each gene or operon. Arrows and color indicate the direction of transcribtion: dark blue genes are transcribed left to right, light blue are transcribed right to left.Overlapping gene are shown in green.
• 结构基因组学(structural genomics)是通过人类基因组计 划(Human Genome Project, HGP) 的实施来完成的。
基因功能研究的整体解决方案
BamHI
Sal I
Bgl II
XhoI
Sal I
2
BamHI
Bgl II
XhoI
Sal I BamHI
1
2
Bgl II XhoI
A）miRNA的串联
B ）miRNA串联试验结果
13
|
Life Technologies Proprietary & Confidential
|
miRNA载体特点-组织特异性表达miRNA
9
|
Life Technologies Proprietary & Confidential
|
BLOCK-iT™ miR RNAi Select
1. BLOCK-iT™ miR RNAi Select ：在Invitrogen网站的数据库里边 有已经设计好了的针对不同基因的oligo DNA（4对/一套）； Oligo DNA可以用来插入到BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi Expression载体里边，进行RNAi研究。
|
RNAi Vector + RNA合成
standard siRNA
(21-mer overhangs)
Stealth™ RNAi
(25-mer blunt)
shRNA expression
miRNA expression
5
|
Life Technologies Proprietary & Confidential
|
体外合成RNAi vs. RNAi载体
体外合成RNAi 长效稳定沉默 RNAi载体
可调控的沉默
导入到难转染的细胞 沉默效果快速而强力 最高特异性 容易操作
植物基因功能研究策略
克隆并分析目标基因启动子序列，鉴定转录因子结合位点和顺式作用 元件，揭示基因表达的调控机制。
蛋白质组学与代谢组学研究
蛋白质组学技术
利用质谱技术对植物蛋白质进行鉴定和定量，分析蛋白质 表达谱和互作网络，揭示蛋白质在植物生长发育和胁迫响 应中的作用。
代谢组学技术
通过高通量代谢物检测技术分析植物体内代谢物组成和含 量变化，研究代谢途径和代谢调控机制，解析基因功能与 代谢表型的关联。
功能冗余与分化分析
比较同一基因家族内不同成员在表达模式、蛋白结构等方 面的差异，分析它们之间的功能冗余与分化情况。
基因家族与表型多样性关联研究
结合自然群体或人工创制的遗传材料，分析基因家族多态 性与表型多样性之间的关联，揭示其在植物适应性进化中 的作用。
CHAPTER 05
植物基因功能研究挑战与展 望
化学诱变
利用化学诱变剂如EMS等处理植物材料，诱导基因突变，结合表型筛选和遗传分析，鉴定 基因功能。
基因表达与调控研究
实时荧光定量PCR
通过特异性引物扩增目标基因，结合荧光信号实时监测PCR产物积 累，用于研究基因在不同组织、发育阶段或胁迫条件下的表达模式 。
转录组测序
对特定生理状态下的植物组织或细胞进行高通量测序，分析转录本 丰度和差异表达基因，揭示基因调控网络和代谢途选目标基 因突变体，分析表型变化以研究基因功能。
基因互补与基因功能恢复验证
01
野生型基因互补
将野生型目标基因转入功能缺失突变体中，观察是否能恢复突变体表型
，从而验证基因功能。
02
等位基因互补
利用等位基因之间的互补性，将等位基因转入突变体中，观察是否能恢
复突变体表型，从而研究等位基因间的功能差异。
基因功能分析的基本策略课件(共 71张PPT)
RNAi 是真核生物中广泛存在的现象
植物：干扰因素自叶脉向外扩散，绿色荧光蛋白 线虫：左侧为 转基因线虫；右侧线虫则经 (GFP) GFP dsRNA 基因 Hela 细胞：经GFP ORC6 siRNA 作用后，细胞出现多核现象。 果蝇：右侧果蝇为野生型，左侧为 shRNA 造成的色素缺乏的 被抑制，显露出红色。 处理。部分细胞 RNAi 相关蛋白表达较低，仍有绿色荧光。 绿色为 tubulin， 缺陷型。 红色为 DNA。ORC6 细胞分裂调控蛋白。
检测的提示重组体存在的基因。GFP、 LacZ、AP、 LUC。
融合基因 (fusion gene): 将特定的目的基因与报告
基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼接成完 整的转录单位。
动物转基因常用的载体
腺病毒载体 逆转录病毒载体 非病毒类载体：如质粒等。
2. 中游—基因转移、胚胎移植与建系
基本原理
转基因动物
基本过程
上游—基因改造和载体构建
中游—基因转移、胚胎移植与建系 下游—基因整合、表达的检测与细胞筛选
1. 上游—基因改造和载体构建
外源基因: 完整的转录单位, 由顺式作用元件、结构
基因和转录终止信号组成。
报告基因 (reporter gene) : 在表达载体中引入易于
第十二章
基因功能分析的基本策略
转基因模型是研究基因功能的主要手段
转基因生物： 外源基因导入生物体表达。 基因打靶： 外源基因替换内源基因。 基因敲除。 基因敲入。 基因沉默： 导入特定基因，抑制内源性基因表达。
第一节 转基因技术
转基因技术(transgenic technology)：将外源 基因导入细胞，随机整合到受体基因组内， 并随细胞分裂而遗传给后代。 细胞模型。 转基因动物。 转基因植物。
研究基因功能的实验方案
基因功能研究一般先用生物信息学分析对基因的结构和功能做预测，然后就要对我们的推测进行验证，如何验证一个基因的功能，目前最常用的基因功能研究策略为功能获得与功能失活。
1、功能获得策略是指将基因直接导入某一细胞或个体中，通过该基因在机体内的表达，观察细胞生物学行为或个体表型遗传性状的变化，从而鉴定基因的功能。
常用的功能获得的具体方法有基因过表达技术以及CRISPR-SAM技术等。
2、基因的过表达技术：基因过表达技术是指将目的基因构建到组成型启动子或组织特异性启动子的下游，通过载体转入某一特定细胞中，实现基因的表达量增加的目的，可以使用的载体类型有慢病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体等多种类型。
当基因表达产物超过正常水平时，观察该细胞的生物学行为变化，从而了解该基因的功能。
基因过表达技术可用于在体外研究目的基因在DNA、RNA和蛋白质水平上的变化以及对细胞增殖、细胞凋亡等生物学过程的影响。
可使用产品：过表达慢病毒、cDNA克隆（可用作ORF克隆）CRISPR-SAM技术：CRISPR-SAM系统由三部分组成：第一个部分是dCas9与VP64融合蛋白；第二个部分是含2个MS2 RNA adapter的sgRNA；第三个是MS2-P65-HSF1激活辅助蛋白。
CRISPR-SAM系统借助dCas9-sgRNA的识别能力，通过MS2与MS2 adapter的结合作用，将P65/HSF1/VP64等转录激活因子拉拢到目的基因的启动子区域，成为一种强效的选择性基因活化剂，从而达到增强基因表达的作用。
可使用产品：全基因Cas9 SAM-慢病毒文库2、功能获得两种方法的比较：基因的过表达技术与CRISPR-SAM技术都能达到基因表达的上调，但是由于基因的过表达技术使用的载体容量的限制，导致基因的过表达技术只能用于研究一定长度内的基因。
而CRISPR-SAM技术是通过增强目的基因启动子的转录而实现基因的过表达，可以不受基因大小的限制。
植物基因定位和基因功能分析的方法研究
植物基因定位和基因功能分析的方法研究随着现代生物学和遗传学的发展，人们对植物基因定位和基因功能分析的方法进行了深入研究，这不仅可以帮助人们更好地理解植物发育和生长的机理，还能为植物育种和生产提供有用的信息和工具。
本文将重点介绍当前主要的植物基因定位和基因功能分析方法。
一、植物基因定位方法1.遗传连锁图谱遗传连锁图谱是一种利用遗传标记来分析不同基因之间遗传联系的方法。
通过对多个遗传标记在植物基因组中的位置进行测定和分析，可以建立起一张遗传图谱，用于揭示不同基因之间的距离和相对位置。
这种方法通常使用分子标记进行，如限制性片段长度多态性（RFLP）、简单重复序列（SSR）、随机扩增多态性（RAPD）等等。
2.基因组关联分析基因组关联分析是一种利用大规模基因组数据来解析复杂性状遗传基础的方法。
这种方法可以在典型生境群体中寻找有影响的变异位点，并确定它们与复杂性状之间的关系。
这种方法使用的主要技术是基因芯片和全基因组二代测序等高通量技术。
3.定位克隆定位克隆是一种在表型、遗传连锁图谱和基因组关联分析的基础上，利用分子遗传学的技术从候选区域中精确定位基因的方法。
这种方法最初是通过描述多态性突变体的表型特征并与别的单基因遗传性神经病的解决方案进行议会比较，通过遗传性状继承模式的推断、基因组DNA库筛选和分子标记标示等技术逐渐细化到定位至遗传连锁图谱中的一个小区域或物理图谱上的一小段碎片。
目前随着技术不断升级，整个过程已经极度自动化，能够对基因进行深准碎片定位和氨基酸序列注释，进一步明确植物基因的功能和作用机制。
二、基因功能分析方法1.反相留出反向遗传（反相留出）是一种采用RNA干扰技术降低或抑制嘌呤和非嘌呤物种基因表达的途径。
这种技术利用RNAi的调控机制，特异性破坏mRNA分子，并通过RNA的剪切或配对等方式，实现对靶基因的抑制。
这种技术能够有效地研究基因在发育、生长、代谢等过程中的功能，并探究不同基因之间的互相作用。
新基因功能研究的策略和方法
文档仅供参考，如有不当之处，请联系改正。
利用转基因技术，则可将外源基因引入动物体 内，建立携带而且能够遗传给子代旳转基因动物 模型，经过对转基因动物旳表型分析研究外源基 因旳功能，目前已经利用转基因技术建立了数千 种转基因动物，而且还能够经过在携带外源基因 旳载体上加上组织特异性开启子等手段，从而控 制外源基因在特定旳时间或特定旳组织器官体现。 利用转基因动物来研究基因功能旳优势在于它是 一种在活体水平上旳多维旳研究体系，能够从分 子到个体水平进行多层次、多方位旳研究。
同步，因为人类全基因组测序已经完毕，所以与其完全同源基因组DNA
文档仅供参考，如有不当之处，请联系改正。
序列及其染色体定位信息，而无需进行荧光原位 杂交等基因染色体定位技术，进而还可经过分析 其内含子、外显子序列及其调整位点，推测其可 能旳基因体现调控方式。即经过此法拟定了富含 亮氨酸反复序列蛋白新基因旳基因组DNA序列及 其染色体定位。
文档仅供参考，如有不当之处，请联系改正。
文档仅供参考，如有不当之处，请联系改正。
此类技术中最常用旳主要为反义寡核苷酸 （ASON）、核酶和RNA干扰（RNAi）技术。
然而，涉及这3种技术在内旳该类技术均具有 诱导干扰素和其他细胞因子体现等非特异性效应， 另外，它们也会因为作用与和靶分子序列相近旳分 子而产生脱靶效应，其中，ASON因使用剂量大，其 非特异性效应最大；而RNAi旳这两种副效应最小。
用expay软件分析氨基酸序列同源性
文档仅供参考，如有不当之处，请联系改正。
主要是经过联网或数据库行蛋白质是基因功 能旳体现者和施行者，而蛋白质旳构造则是蛋白质 执行生物学功能旳基础，所以对新基因所编码蛋白 质旳功能域分析将对推测新基因功能提供极其有价 值旳信息。目前，已经有大量被发觉旳蕴藏于蛋白 质构造中旳与特定生物学活性有关旳所谓保守模体。
功能基因组学研究概述
3.融合了全基因组鸟枪法和逐步克隆法绘制的牛基因组草 图，包含了26052388个可用测序读长，覆盖约7.0倍基因 组，拼接成2.87Gb的基因组序列。
2.牛基因组学
研究进展
截止到 2006年 6月 15日为止，GenBank 中牛的mRNA、EST等序列数目达到 914 944条，这些序列拼接得到 37 225 个 clusters，是转录水平获得序列最多的家 养动物。目前已经建成织细胞的基因表达 情况奠定了基础。
白质物理性质预测(如等电点、分子量、酶切特性、疏水性 等)。蛋白质结构预测（蛋白质二、三级结构及特殊结构预 测）、蛋白质功能的预测（通过相似序列的数据库比对确定 功能、确定序列特性、通过序列模体数据库等的比对确定功 能）
3. 功能基因组学研究 的内容及策略
3. 功能基因组学研究 的内容及策略
3. 功能基因组学研究 的内容及策略
3. 功能基因组学研究 的内容及策略
3.1新基因的生物信息学分析（基因结构及编码产物
功能预测)
3.1.3新基因的功能预测:序列同源比较:主要方法有同源检索
(NCBI数据库的 Blastn)和多序列对齐 (multiple sequence alignment,MSA)
3.1.4蛋白质结构与功能预测：从氨基酸组成辨识蛋白质、蛋
基因分析的基本策略
基因分析的基本策略引言基因分析是生物领域中一项重要的研究工具，通过对基因的分析可以揭示生物的遗传信息、功能以及与疾病相关的遗传变异。
基因分析的基本策略是一系列针对基因组的实验和计算方法，旨在深入理解基因的结构、功能和作用机制。
本文将介绍基因分析的基本策略和常用的分析方法。
1. 基因组测序基因组测序是基因分析的第一步，通过测序技术可以获取基因组的完整序列。
现代基因组测序技术包括传统的链终止法（Sanger测序），以及高通量测序技术，如 Illumina HiSeq、Pacific Biosciences 和Oxford Nanopore Technologies 等。
基因组测序的产出是一系列的DNA片段，通过生物信息学工具进行序列拼接和组装，可以得到完整的基因组序列。
2. 基因注释基因注释是对基因组进行功能和结构的标注，将序列信息翻译成有意义的生物学信息。
基因注释可以分为结构注释和功能注释两个层次。
结构注释结构注释主要用于预测基因的结构和组织结构。
常见的结构注释方法包括基因预测、剪接位点预测和重复序列识别等。
基因预测是确定基因的位置和转录本的起始和终止位点的过程。
剪接位点预测用于确定基因的剪接方式，即基因转录本的选择性剪接。
重复序列识别可以帮助鉴定基因组中的重复序列，例如转座子等。
功能注释功能注释主要通过比对基因组序列和已知功能基因库，将未知基因序列进行功能注释。
常见的功能注释方法包括BLAST、GO富集分析和KEGG通路分析等。
BLAST是一种比对算法，可以通过比对基因组序列和已知序列库，找到相似的序列并推断基因的功能。
GO富集分析是根据基因的注释信息，统计出某一功能术语在基因集中的富集程度，从而推断基因集的功能。
KEGG通路分析则是通过比对基因组序列和KEGG数据库，分析基因在代谢通路中的功能。
3. 基因表达分析基因表达分析是研究基因在不同条件下的表达水平和变化趋势。
通过基因表达分析可以了解基因在发育和疾病等生物过程中的功能和调控机制。
植物基因功能研究的主要方法_3215
植物基因功能研究的主要方法随着植物基因组计划的实施和完成，大量的基因组数据库和EST数据库得以建立和完成，因此产生的问题是成千上万新基因的功能有待分子生物学家鉴定。
研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学和反向遗传学策略。
正向遗传学是传统的方法，策略是通过筛选天然或人工产生的突变体进而克隆相关目标基因，即从功能（表型）－突变体－基因，最后得到具有相关功能（如对干旱敏感或耐旱）的基因，常用手段是图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）。
反向遗传学的策略是从已知的基因序列入手鉴定其功能，研究手段包括基因的互补实验、超表达、反义抑制、基因敲除、基因激活等。
采用反向遗传学鉴定基因功能是基因组计划由结构基因组学过渡到功能基因组学的必然要求。
目前，植物抗逆性功能基因的研究策略主要集中在利用差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析、cDNA微阵列（或基因芯片）等技术筛选与逆境胁迫相关的表达序列标签（EST）或转录因子，然后利用反向遗传学等技术对转录因子的功能进行研究。
正向遗传学手段主要集中在抗逆性状的遗传分析和QTL定位方面，然而目前尚无抗逆性状QTL基因克隆的报道；通过突变体抗逆筛选的途径主要是在模式植物拟南芥中，特别是克隆了一大批与ABA合成或ABA 敏感性有关的基因，例如ABA不敏感的abi8突变体(Brocard-Gifford et al., 2004)。
近年来许多国家（特别是我国）的水稻突变体数量剧增，为通过抗逆筛选克隆基因奠定了基础。
综合利用这些研究手段可以全面地了解植物对胁迫响应的复杂机制和相互作用以及相应的信号传导途径，从而为更加高效地利用基因工程技术来提高植物的抗逆性奠定基础。
下面就几种常见的研究抗逆基因功能的策略作简要介绍。
1. 超量表达（Over-expression）超量表达是指将目的基因全长序列与高活性的组成型或组织特异型启动子融合，通过转化获得该基因产物大量积累的植株，从而扩大该基因在生理生化过程中的效应，这部分扩大的效应带来的与正常植株在各种表型上的差异有助于帮助理解基因功能。
研究植物基因功能的策略和方法_3110
研究植物基因功能的策略和方法研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学（forward genetics）和反向遗传学（reverse genetics）策略。
正向遗传学即通过生物个体或细胞基因组的自发突变或人工诱变，寻找相关表型或性状改变，然后通过图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）从这些特定性状变化的个体或细胞中找到对应的突变基因，并揭示其功能，例如遗传病基因的克隆。
反向遗传学的原理正好相反，人们首先是改变某个特定的基因或蛋白质，然后再去寻找与之有关的表型变化，例如基因剔除技术或转基因研究。
简单地说，正向遗传学是从表型变化研究基因变化，而反向遗传学则是从基因变化研究表型变化。
研究植物体内基因功能的方法主要有以下几种：（1）基因功能丧失或减少，即筛选目的基因功能部分丧失或全部丧失的突变体，比较其与野生型的表型差异来确定该基因功能；（2）基因功能增加或获得，即筛选目的基因高水平表达的植株，比较其与相应对照植株（野生型植株，功能丧失突变体或模式植物植株）差异，观察其表型性状变化来鉴定基因功能；（3）基因异位表达（Ectopic expression），通过定向调控靶基因的时空表达模式来研究基因功能；（4）微阵列（Microarray）是一种在全基因组水平对基因表达进行高通量检测的技术；（5）酵母双杂交技术（Yeast two-hybrid system）用于分析基因产物即蛋白质之间的互作。
1 基因功能丧失或减少以前，通常通过筛选自然突变体来获得基因功能部分或全部丧失的突变体，但概率较低；现在一般通过各种人工方法来获得合适突变体。
人工产生基因功能丧失的方法有插入突变、反义抑制（antisense suppression）、共抑制（cosuppression）、双链RNA干扰（double-stranded RNA interference, dsRNAi）。
最新基因功能的研究方法
相关性可从已知的同源基因推测新基因的功能。
根据同源性预测基因时必需注意以下几点：
1. 一般认为aa的一致性或相似性在25%以上 可视为同源基因；
2. 同源性与相似性的含义不同，如aa顺序的 80%的相似性不能称为同源性。
3. 一致性常指同一位置同一aa在整个多肽序 列中所占的比例，而相似性除一致性aa外 还包括可取代aa的成员，因此相似性aa的 比例总是高于一致性aa。
之间相互作用的影响 2.6 利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图(Genome Protein
Linkage Map）
3. 开放读框顺序标签(open-reading-frame sequence
tags,OSTs）
确认DNA顺序中的基因序列后，下一个问题 就是探知其功能，这是基因组研究的一个难度 很大的领域。
1.1 基因敲除（Gene knock-out） ➢ 概念：基因敲除除可中止某一基因的
表达外，还包括引入新基因及引入定 点突变。 即可以是用突变基因或其它基因敲除 相应的正常基因，也可以用正常基因 敲除相应的突变基因。
➢ 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重 组原理发展起来的一门新技术。80年代初， 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的 成功奠定了基因敲除的技术基础。
基因功能的研究方法
一、计算机预测基因功能 二、实验确认基因功能 1．基因失活是功能分析的主要手段
1.1 基因敲除（Gene knock-out）
1.2 基因敲除的技术路线 1.3 基因敲除的主要应用领域及国内外研究进展 1.4 基因失活的表型效应有时不易分辨
2．转座子突变库的构建
2.1 插入序列 2.2 实验步骤
基因功能分析的基本策略
基因功能分析的基本策略一、利用转基因模型研究基因的功能1转基因动物：是指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动物。
2基本原理：将目的基因（或基因组片段）用显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中，使目的基因整合到基因组中，然后将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体动物园的输卵管（或子宫）中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物。
导入基因的方法有显微注射法、胚胎干细胞法、逆转录病毒感染法、精子载体法。
二、利用基因敲除模型研究基因的功能1基因打靶：是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。
若定向敲除某个基因，称为基因敲除，若定向将一段基因序列替代另一段基因序列，称为基因敲入。
2同源重组：是指发生在同源序列间的重组，它通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列之间进行单链或双链片段的交换。
又称基本重组。
3基因敲除：是目前在体内研究基因功能的最佳方法，是指通过DNA同源重组定向的将外源基因插入宿主细胞染色体DNA，从而使特定基因在细胞内或生物或体内失活的过程。
4基因打靶的必备条件：胚胎干细胞（ES）、打靶载体5打靶载体的筛选标志：neo（新霉素）阳性筛选标志；HSV-tk阴性筛选标志。
6基因敲除的基本程序：①打靶载体的构建②打靶载体导入ES细胞③基因敲除ES细胞注射入胚泡④胚泡植入假孕小鼠的子宫中⑤嵌合体的杂交育种7构建打靶载体的基本过程①获得目的基因的同源片段，将此DNA片段克隆到一般的质粒载体中；②从重组质粒中切除目的基因的大部分同源DNA序列，只留部分序列在线性质粒载体的两端；③将neo基因克隆到带有目的基因同源顺序的线性质粒中，使之位于残留目的基因同源顺序的中间；④在目的基因同源顺序的外侧线性化重组质粒载体，将HSV-tk基因克隆到此线性载体中。
三、通过抑制或沉默基因表达对基因的功能进行分析研究1利用反义RNA抑制基因表达水平2利用RNAi技术在细胞中沉默特定基因已研究其功能1。
新基因全长cDNA的克隆策略
随着人类基因组计划(H GP)和其它模式生物基因组计划的相继完成, 生命科学 已经进入了后基因组学时代(post genomics)。 在对基因组结构进一步了解的
同时,功能基因组学逐渐成为核心内容. 基因组序列测定的完成仅仅是基因组
计划的第一步, 更大的挑战在于如何确定基因的功能和阐述其调控的机制与 表达规律。 因而,基因功能研究已成为生命科学领域中的重大课题, 它将是21 世纪生命科学研究的重要领域. 那么,对于一个未知的新基因,如何对它制定基 因功能的研究方案从而进行全面和系统的研究是每个基因功能研究者面相 似的基因。
• 如果只知道某个基因的一段碱基序列,可以采用 RACE(cDNA 末端快速扩增)或反向
PCR和锚定 PCR方法克隆该基因的 cDNA全长序列的引物进行序列分析。
• 所有DNA片段；
• 2.连接至载体；
• 3.转化到受体细胞扩增；
• 4.目的序列的筛选鉴别。
• 如果已知一个基因的序列，那么可以通过已知序列设计引物，然后通过PCR技术获 得目标DNA片段。
• 如果一个或多个物种的某种基因已经被分离，可以通过同源性对比找到的保守性
• 转座子是染色体上一段可移动的DNA片段，它可从染色体的一个位置跳
到另一个位置。当转座子跳跃而插入到某个功能基因时，就会引起该基 因的失活，并诱导产生突变型，而当转座子再次转座或切离这一位点时， 失活基因的功能又可得一恢复。遗传分析可确定某基因的突变是否由转 座子引起。由转座子引起的突变便可部分突变株DNA序 列的克隆，。
• 目前基因功能的基本策略： • 1 .新基因全长 cDNA的克隆策略； • 2 .通过生物信息学预测新基因的功能； • 3 .新基因的表达谱分析；
基因功能分析的基本策略
后代
受精
植入
全能性细胞
假孕小鼠
转基因动物应用
1、通过转基因动物来研究特定基因在组织中特异表达或表达 的时相； 2、在活体内研究或发现基因的新功能； 3、可用于只在胚胎期才表达的基因结构和功能研究； 4、建立研究外源基因表达、调控的动物模型； 5、遗传性疾病的研究； 6、建立人类疾病的动物模型，为人类的基因治疗提供依据； 7、动物新品种的培育； 8、基因工程产品的制备；
13、乍见翻疑梦，相悲各问年。。22.8.722.8.718:19:4518:19:45August 7, 2022
14、他乡生白发，旧国见青山。。2022年8月7日星期日下午6时19分45秒18:19:4522.8.7
15、比不了得就不比，得不到的就不要。。。2022年8月下午6时19分22.8.718:19August 7, 2022
Cre／loxP系统的原理
➢ Cre／loxP系统来源于F1噬菌体，可以介导位点特异的 DNA重组。 ➢该系统含有两种成分：①一段长34bp的DNA序列，含有 两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。这段 34bp序列是重组酶识别的位点，被称为loxP位点(10cus of X—over in P1)。 ➢②Cre重组酶(cyclizationrecombination)，它是一种由343 个氨基酸组成的单体蛋白，可以引发loxP位点的DNA重组。 任何序列的DNA，当其位于两个loxP位点之间的时候，在 Cre重组酶的作用下要么被缺失(两个loxP位点的方向相同)， 要么方向发生倒转(两loxP位点的方向相反)，如图所示。
一、反义RNA技术
反义RNA技术是根据RNA序列人工合成的互补RNA。根 据反义RNA的作用机制可将其分为三类： 1、反义RNA是直接作用于靶mRNA的核蛋白体结合位 点或与靶mRNA直接结合形成双链RNA，从而直接抑制 mRNA的翻译或被RNA酶Ⅲ识别降解。 2、反义RNA是与mRNA的非编码区结合，引起mRNA 构象的变化，从而抑制其翻译。 3、反义RNA是作用于基因的启动子，直接抑制靶 mRNA的转录。
新基因功能研究的策略与方法
生物进化与物种多样性研究
基因功能研究在 生物进化研究中 的应用
基因功能研究在 物种多样性研究 中的应用
基因功能研究在 生物适应性研究 中的应用
基因功能研究在 生物系统发育研 究中的应用
未来展望与挑战
新技术与新方法的探索与应用
基因编辑技术：CRISPR/Cs9 等基因编辑技术的应用
单细胞测序技术：单细胞测序 技术的发展与应用
THNK YOU
汇报人：
基因功能研究的应用
ห้องสมุดไป่ตู้
疾病发生发展机制研究
基因功能研究在疾病发生发展中的作用 基因功能研究在疾病诊断中的应用 基因功能研究在疾病治疗中的应用 基因功能研究在疾病预防中的应用
药物靶点筛选与新药研发
药物靶点筛选：通过基因功能研究确定药物作用靶点 新药研发：基于基因功能研究开发新型药物 药物筛选：通过基因功能研究筛选出有效药物 药物优化：根据基因功能研究优化药物结构和剂量
生物信息学方法：生物信息学 方法在基因功能研究中的应用
人工智能技术：人工智能技术 在基因功能研究中的应用前景
数据整合与共享的重要性
提高研究效率：通过数据整合可以减少重复工作提高研究效率
促进合作与交流：数据共享可以促进研究人员之间的合作与交流共同推 进科学研究
提高研究质量：通过数据共享可以避免数据重复使用提高研究质量
基因过表达： 通过基因工 程手段增加 基因的表达 量观察其对 生物体的影 响
基因沉默： 通过RN干扰 技术抑制基 因的表达观 察其对生物 体的影响
基因突变： 通过基因编 辑技术引入 基因突变观 察其对生物 体的影响
基因表达分 析：通过基 因芯片、高 通量测序等 技术分析基 因的表达情 况了解其功 能
6分子生物学研究法(下)——基因功能研究技术
目前，主要采用两种PCR方法，重叠延伸技术（左图）和 大引物诱变法（右图），在基因序列中进行定点突变。
6.2 基因敲除技术
1、基本原理
经典遗传学（Forward genetics）是从一个突变体的表型出 发，研究其基因型，进而找出该基因的编码序列。 现代遗传学（Reverse genetics，反向遗传学）首先从基因 序列出发，推测其表现型，进而推导出该基因的功能。 基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶，通过外源DNA 与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因 改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗 传等特点。 基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲除（又称不完全 基因敲除）两种。 完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动植物 个体中的靶基因活性，条件型基因敲除是指通过定位重组系 统实现特定时间和空间的基因敲除。 噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统、酵母细胞的 FLP/FRT系统和R/RS系统是现阶段常用的四种定位重组系 统，尤以Cre/Loxp系统应用最为广泛。
ChIP不仅可以检测体内转录因子与 DNA的动态作用，还可以用来研究 组蛋白的各种共价修饰与基因表达 的关系。 定性或定量检测体内转录因子与 DNA的动态作用。 ChIP-chip and ChIP-seq：在基因 组水平研究DNA结合蛋白、组蛋白 修饰以及核小体分布。 ChIP-seq相对于ChIP-chip来说，具 有更高的分辨率、更小的噪音以及 更广的基因组覆盖范围。 Nucleosome Occupancy study: 一 些转录因子本身并不含有DNA结合 结构域，它是通过参与形成蛋白复 合物从而改变染色质结构来发挥作 用的；因此我们可以通过研究基因 组上核小体的分布变化来揭示转录 因子作用的过程。
基因组学研究的新技术与新方法
基因组学研究的新技术与新方法随着科技的不断发展，基因组学研究也在快速进步着。
从最初的Sanger测序到现在的高通量测序技术，基因组学研究不断涌现新的技术与方法。
本文将介绍一些基因组学研究的新技术与方法，并探讨其在基因组学研究中的应用。
一、单细胞测序技术单细胞测序技术是指通过对单个生物细胞进行基因组、转录组或表观基因组的测序，获得该细胞的完整信息。
相比于传统的混合细胞测序，单细胞测序技术具有更高的分辨率和灵敏度。
单细胞测序技术主要分为两种，一种是单细胞全基因组测序技术（single-cell whole genome sequencing，scWGS），另一种是单细胞转录组测序技术（single-cell transcriptome sequencing，scRNA-seq）。
在scWGS技术中，通过将单个细胞的基因组DNA进行扩增、建库和测序分析，可以获得单个细胞完整的基因组信息。
而在scRNA-seq技术中，则是将单个细胞的mRNA转录本进行扩增、建库和测序分析，获得单个细胞转录组的信息。
单细胞测序技术在各个领域都有着广泛的应用，如在肿瘤学中可以研究不同癌细胞的异质性，从而更好地了解癌症的发生机制和治疗策略；在演化生物学中可以深入研究物种的起源和演化；在发育生物学和神经科学中则可以探究单个细胞发育及神经元分类等问题。
二、DNA甲基化测序技术DNA甲基化是指DNA分子上甲基在胞嘧啶环上发生加成反应，从而形成5-甲基胞嘧啶。
这种化学修饰是细胞表观基因组调控的一种重要方式。
DNA甲基化测序技术是指对DNA分子进行甲基化信息的测序，以描绘基因组DNA上甲基化分布情况。
这类测序技术主要包括甲基化敏感限制性内切酶测序（methyl-sensitive restriction endonuclease sequencing, MRE-seq）、嵌入式甲基化测序（bisulfite sequencing, BS-seq）和甲基化免疫沉淀测序（methylated DNA immunoprecipitation sequencing, MeDIP-seq）等。
基因功能研究
基因功能研究基因是生物体内携带基本遗传信息的分子，它决定了生物体的性状和功能。
基因功能研究是科学家为了深入了解基因的作用，从而揭示生物体的生理和生化过程的一门科学。
基因功能研究对于人类的健康和疾病治疗有重要的意义。
基因功能研究主要通过以下几个方面来进行：首先，基因表达的研究。
基因的表达是指基因的信息以RNA为中介被转录成蛋白质的过程。
通过研究基因表达，可以了解基因在不同细胞类型和组织中的表达模式，以及在不同生理和病理状态下的表达变化。
这对于揭示基因的功能和调控机制非常重要。
其次，基因功能的破坏与修复研究。
通过研究特定基因的缺失或突变对生物体的影响，可以揭示该基因在生理过程中的作用。
例如，某个基因突变可能导致某种疾病的发生，通过研究该基因突变对生物体的功能影响，可以找到治疗这种疾病的新靶点。
再次，基因功能调控的研究。
基因的功能调控包括转录调控、转录后调控、转译调控等多个层面。
通过研究调控元件（如启动子、增强子等）和调控因子（如转录因子、组蛋白修饰酶等），可以了解调控网络的组成和运行机制，从而进一步理解基因的功能和调控网络在疾病中的异常变化。
最后，基因功能与疾病关联的研究。
许多疾病包括遗传性疾病和复杂性疾病都与基因功能异常有关。
通过研究基因与疾病之间的关系，可以寻找新的疾病标志物、诊断方法和治疗策略。
例如，通过研究肿瘤个体基因组，可以找到与肿瘤发生和发展相关的新靶点和药物。
总之，基因功能研究是生命科学研究的重要分支之一。
通过深入研究基因的作用和调控机制，可以为疾病的预防、诊断和治疗提供新的思路和方法。
随着技术的发展和研究的深入，相信基因功能研究将会在人类健康和疾病治疗领域发挥越来越重要的作用。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
h
4
二.新基因的体内表达规律分析
要开展新基因功能的研究工作，首要的研究任务 摸清新基因在体内的表达规律。包括从mRNA和蛋白质 两个水平上来对其基因表达谱进行分析，即看其在各 种不同的正常或病态组织细胞中是否表达以及表达的 水平高低等.新基因在某一特定的正常组织细胞中的表 达水平高往往提示其在其中发挥着重要作用，而新基 因在相应的病态组织中的表达异常则提示与该病理过 程相关的生物学意义。
新基因功能研究的策略与方 法
h
1
随着生命科学的发展及研究领域的不断开拓和生物 医学研究在分子水平上的不断深入和推进，越来越 多的未知新基因和基因的新功能被发现,越来越多 的新基因被得以成功克隆，因此对新基因功能的研 究显得日益重要，这也是后基因组时代功能基因组 学的重要研究内容和首要任务。
h
2
基因功能的研究策略主要包括：
用expay软件分析氨基酸序列同源性
h
12
蛋白质功能域分析
主要是通过联网或数据库行蛋白质是基 因功能的体现者和施行者，而蛋白质的结构则是蛋 白质执行生物学功能的基础，因此对新基因所编码 蛋白质的功能域分析将对推测新基因功能提供极其 有价值的信息。目前，已经有大量被发现的蕴藏于 蛋白质结构中的与特定生物学活性相关的所谓保守 模体。
h
13
蛋 白 质 的 结 构 功 能 域 分 析
h
14
mRNA水平的表达谱分析
对新基因在mRNA 水平上的表达分析涉及到的技术有半定 量RT-PCR 、实时定量RT-PCR 和Northern Blot 等。半定量 RT-PCR方法具有简便、快捷和经济的特点，但其存在着精 确度不高和不能进行绝对定量等缺点，多用于基因表达水平 的快速初步分析。实时定量RT-PCR是近年来新发展起来的 一种mRNA定量分析技术，因具有特异性更强、有效解决 PCR污染和自动化程度高等的特点而被广泛应用，但其成本 相对较高。Northern Blot历来是在mRNA水平上对基因表达 进行分析的经典技术，被各实验室广泛采用其不仅可以进行 定量分析，而且还能够检测基因转录本的大小及种类，这也 是RT-PCR技术所不具备的优势但Northern Blot操作较为繁 琐，采用放射性标记时也存在放射性污染的问题。在实际工 作中，需结合这两类方法同时进行，互为补充。另外，必要 时也应考虑使用原位杂交技术来对新基因的mRNA在特定组 织细胞内的分布进行定位观察。
（1）mRNA水平的表达谱分析； （2）蛋白质水平的表达分析。
h
5
三.功能获得策略
新基因功能研究的功能获得策略即通过将新基 因直接导入到某一细胞或个体中，通过观察细胞生 物学行为或个体表型遗传性状的变化来鉴定基因的 功能，常用的方法有：
（1）基因转染技术 （2）转基因技术
h
6
四.功能失活策略
通过观察某一细胞或个体在新基因的功能部 分或全部失活后的细胞生物学行为或个体表型 遗传性状变化来鉴定基因的功能。 常用的方法主要有基于核酸的基因沉默技术和 基因敲除等
（1）免疫共沉淀技术 （2）酵母双杂交系统
h
8
编码产物预测分析
研究者往往最开始得到有价值的EST序 列，进而通过电子延伸或和相关实验方法获取其 全长cDNA序列。这种情况下，首先要进行即是进 行全长cDNA序列的开放阅读框查找，推导其编码 蛋白质的氨基酸序列。 然后，进行信号肽序列预 测分析。初步判定其亚细胞定位，再进行蛋白质 的基本理化性质分析，包括氨基酸组成、分子质 量、等电点、亲/疏水性等。最后，以已知的氨基 酸序列的基础，分析预测其高级结构。
h
9
规律分析
Cs3亚基蛋白的计算机预测分析
h
10
序列同源性分析
包括核苷酸序列同源性分析和氨基酸序列同源性 分析，这也是目前生物信息学技术中应用最为广泛 的基本技术之一。主要采用BLAST和FASTA程序进 行，即从已知的各种核酸和蛋白质序列数据库搜索 与新基因对应的功能已知的高度同源基因和蛋白质， 从这些已知基因和蛋白质的功能信息中来初步推测 和判断新基因的功能。
同时，因为人类全基因组测序已经完成，所以 以新基因的cDNA序列来对基因组数据库进行同源性 比对，则可很方便地获得与其完全同源基因组DNA
h
11
序列及其染色体定位信息，而无需进行荧光原位 杂交等基因染色体定位技术，进而还可通过分析 其内含子、外显子序列及其调节位点，推测其可 能的基因表达调控方式。即通过此法确定了富含 亮氨酸重复序列蛋白新基因的基因组DNA序列及 其染色体定位。
h
15
蛋白质的水平表达分析
确定新基因在哪些组织细胞被转录后，进一步的工作
则是制备相应的抗体来检测其蛋白质终产物的表达情况，如
该蛋白质表达的亚细胞定位、分子质量大小、聚体形式等。
这种在蛋白质水平上的表达分析涉及到的常用技术主要是
Western Blot和免疫组化等。
Western blot
其中，Western Blot与 Northern Blot类似，不仅可
（1）基因沉默技术 （2）基因敲除
h
7
五.基因编码产物相互作用蛋白的研究
细胞各种基本功能的完成离不开蛋白质之间的 相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白质复合物。 因此，确定能够与新基因编码的蛋白质表达终产物 相互作用的上下游蛋白质分子，也是研究新基因功 能的一个十分重要的方面。目前常用的研究蛋白质 相互作用的技术包括传统的基亲和分析而建立的免 疫共沉淀技术和酵母双杂交系统.
一.新基因的生物信息学及体内表达规律分析; 二.新基因的体内表达规律分析 三.功能获得与功能失活策略研究; 四.功能失活策略 五.基因编码产物相互作用蛋白的研究
h
3
一.新基因的生物信息学及体内表达 规律分析
目前，生物信息学分析已成为新基因功 能研究首选和必用方法，其具有方便快捷和经济 等优点。研究者往往可以从中得到与新基因功能 有关的重要信息，初步推测基因的可能功能，进 而制定出进一步的实验室研究方案。 （1）编码产物预测分析 （2）序列同源性分析 （3）蛋白质功能域分析
以进行定量分析，而且还能
够检测蛋白质的分子质量大
小及其聚体形式。而免疫组
化技术的优势则在于其能够
确定蛋白质是在特定组织中