第三章 发育生物学研究技术和方法
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Developmental Biology
第三章 发育生物学研究技术和 方法
Developmental Biology
• 在第一章回顾发育生物学的历史时，我们已了解 了实验技术对发育生物学发展的突出贡献，特别 是分子生物学的兴起给发育生物学的发展所带来 的活力。事实上，发育生物学是一门实验性很强 的学科，很多重要的发育理论和发育模型都是在 大量实验结果的基础上建立起来的。其中涉及各 种各样的研究技术和方法，既有传统的胚胎学和 细胞学方法，如胚胎移植、胚胎分割、细胞核移 植等，又有新发展的分子生物学方法，如显微注 射、原位杂交,基因转移及基因功能分析等。本章 将重点介绍发育生物学研究中的几种常用方法 ‘
Developmental Biology
• 三.SSH基本过程是： • 抽提2种不同细胞如肿瘤细胞和正常细胞的mRNA分别作 为检测样本(tester)和参照样本(driver)，反转录成cDNA．， 用Rsa I或Hae III酶切，以产生大小适当的平头末端cDNA 片段，将‘tester cDNA分成均等的2份，各自接上2种接 头，与过量的driver cDNA变性后退火杂交。第一次杂交 后有4种产物： (a)tester cDNA．，(b)自身退火的tester cDNA双链，(c)是tester和driver的异源双链，(d)是driver cDNA。第一次杂交的目的是实现tester单链cDNA均等化 (normalization)，即使原来有丰度差别的单链cDNA．的 相对含量达到基本一致，由于tester cDNA中与 drivercDNA。序列相似的片段大都和driver cDNA形成异 源双链分子(c)，使tester cDNA．中的差异表达基因的目 标cDNA得到大量富集。第一次杂交后，合并2份杂交产物， 再加上新的变性driver单链，再次退火杂交，此时，只有 第一次杂交后经均等化和扣除的单链tester cDNA和driver cDNA一起形成各种双链分子，这次杂交进一步富集了差 异表达基因的cDNA，产生了一种新的双链分子(e)，它的 2个5’端有2个不同的接头，正由于这2个不同的接头，使 其在以后的PCR中被有效地扩增(图3—3)。
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三．操作方法 1．实验所需溶液 2．爪蟾胚胎免疫组织化学检测 (1)胚胎固定 (2)漂白 (3)免疫检测 (4)胚胎切片
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第四节发育基因的启动子分析
• 一。用途 • 启动子调控作用分析是研究胚胎发育基因 功能的一种重要方法，特别在研究基因时 空表达的分子机制方面，更是有突出的作 用。通常，启动子分析包括基因特异调控 序列、启动子(promoter)和增强子元件 (enhancer element)的鉴别，它们都是基因转 录活性的重要调控单元。
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二．胚胎组织切片原位杂交
• 原位杂交是研究胚胎基因表达的常用方法。 虽然全胚原位杂交简单易行，但在许多情 况下，该方法还达不到研究的要求，因而 需要在胚胎的组织切片上进行杂交。在胚 胎的组织切片上杂交的有利因素在于不存 在探针不能渗入到胚胎内部的问题。
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• • • • •
1．实验用试剂 2．操作步骤 (1)胚胎总RNA提取 (2)RNA探针的合成和纯化 (3)杂交和RNA酶消化
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பைடு நூலகம்
第六节 抑制性差减杂交技术
• 一.应用： 抑制性差减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)最早见于1996年6 月Clontech公司、加州大学旧金山分校和俄罗斯 科学院合作的研究报道(Diatchenko et a1 .996)， 是一种简便而高效的通过比较两种总mRNA，而 克隆只存在于其中一种总mRNA中特异表达产物 的新方法。例如可以快速从不同细胞系、不同组 织间或同一细胞系、同一组织在不同条件下(如发 育时间的差异、病理性差异等)克隆出差别表达基 因。
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• 二..原理 • 是以抑制PCR为基础的DNA差减杂交。抑 制PCR．是利用DNA链内退火优于链间退 火，比链间退火更稳定的特点，使非目的 系列片段两端反向重复系列在退火时产生 类似于“锅一柄”的结构，无法与引物配 对，选择性地抑制了非目的基因片段的扩 增。同时，该方法运用了杂交二级动力学 原理，即高丰度的单链cDNA在退火时产生 同源杂交的速度要快于低丰度的单链cDNA， 从而使原来在丰度上有差别的单链cDNA相 对含量达到基本一致。
• 一 应用：核糖核酸酶(RNase)保护实验是 定量分析基因转录水平的常用方法之一， 它对mRNA的分析具有灵敏度高(比 Northern杂交和点杂交灵敏8～10倍)、 特异性强的特点。另外，核糖核酸酶保 护实验还可用于转录起始位点的确定、 内含子／外显子边界的确定、选择性剪 接(alternative splicing)分析及确定转入 到胚胎中的核酸的降解率等方面的研究。
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• 有多种方法可用于体内(in vivo)启动子分析， 如转基因动物、显微注射等，在不同的动 物中可选用不同的方法，但比较而言，转 基因动物法较为费时，而且需要一些特殊 条件，而显微注射法较为简单。本节将以 斑马鱼胚胎中goosecoid基因启动子分析为 例介绍启动子的定性和定量分析方法。
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• 第一节 显微注射 • 显微注射(microinj ection)是发育生物学研 究中最经典而又使用最为普遍的一种方法， 特别是近十几年来通过基因转移创造生物 反应器这一具有明显商业价值的应用研究 的开展，更显现出这一技术的活力。本节 将介绍显微操作系统、注射用卵子或胚胎 的准备、操作过程等。
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操作过程 1实验中所需试剂 2实验步骤 （1）RNA的提取 （2）Driver和Tester cDNA的制备 双链cDNA的合成 Rsa1消化 Driver cDNA的制备 （3）差减杂交 （4）PCR扩增 （5）差减文库的构建及差减基因的克隆
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1. 实验所需试剂 2．分散囊胚细胞中的启动子分析 3．完整胚胎中启动子的定量分析 4．整体胚胎中启动子空间活性分析
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第五节 基因表达的核糖核酸酶保护 分析
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• 二、显微注射步骤 • 1．注射用卵母细胞的制备 • 在鱼类和两栖类动物中，卵母细胞可采用两种方 法获得，一是将动物麻醉后，通过解剖取出卵巢 叶(两栖动物)，或用挖卵器从泄殖孔取出所需要 的卵母细胞；另一种方法是杀死动物，取出全部 卵巢。对哺乳动物而言，一般通过超数排卵 (superovulation)获得更多的卵母细胞，即模拟体 内卵母细胞发育与排放的激素调节模式，通过注 射不同的促性腺激素，刺激暂时处于休眠状态的 卵母细胞进入成熟发育期，成熟后排放到输卵管 中。由此可以获得的卵母细胞远多于自然排卵。 下面以两栖动物爪蟾为例，简要介绍制备卵母细 胞的这两种方法的基本步骤。
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• •
核糖核酸酶保护实验的基本原理是： 将待分析的目标DNA序列作为模板，用 逆转录的方法合成与之互补的放射性标 记的探针。将此探针加入到RNA混合物 中后，它便可与目标RNA杂交，形成双 链RNA。由于该双链对核糖核酸酶具有 抵抗力，因此，杂交体系中未杂交的样 品RNA．及过量的探针全部被核糖核酸 酶消化，只剩下杂交形成的双链RNA。 核糖核酸酶失活后，通过凝胶电泳和放 射自显影检测被保护的RNA探针的量， 即RNA样品中目标RNA的量。
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• 二。原理： • 启动子分析的第一步是将一系列大小不同的启动 子的片段克隆到含有报告基因(reporter gene)的载 体中，然后通过比较这一缺失系列中启动子的活 性，找到启动子中具有调控能力的序列。随后， 将被鉴定出来的调控序列分为更小的片段，并亚 克隆到含有异源活性启动子(如单纯疱疹病毒胸苷 激酶基因启动子)和报告基因的载体中，再次比较 缺失系列启动子的活性，以确定调控序列中的最 关键序列。最后，可通过野生型启动子中单个碱 基的点突变，进一步确定基因的关键调控元件(图 3—2)。
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(1)取出完整卵巢及卵母细胞的培养 (2)取出卵巢叶及卵母细胞的培养 2．注射用胚胎的制备 3.显微注射 在开始注射之前，应准备好所有试剂和器 具。
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第二节胚胎原位杂交
• 全胚原位杂交的基本原理: • 是用各种标记物标记与体内特定mRNA互 补的RNA分子(反义RNA)，以它们作为探 针与动物的整体胚胎进行原位杂交，然后 用相应的抗体来检测特异探针的分布情况。 以下以爪蟾胚胎为例介绍全胚原位杂交的 操作步骤。其他动物的全胚原位杂交与爪 蟾基本相同。
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• 一．全胚原位杂交 • 全胚原位杂交(whole mount insuite hybridization，WISH)是广泛用于胚胎发育 调控基因表达研究的一种技术。近年来该 技术发展较快，不仅可以检测到较弱的杂 交信号，而且可以多色杂交，检测多个基 因的表达情况。
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第三节 胚胎免疫组织化学技术
• 一．用途：胚胎免疫组织化学是定位 胚胎内的内源或外源蛋白质的一种有 效方法。该技术操作相对简单，如果 和其他一些免疫学技术结合使用，可 以快速获得相关蛋白质功能的有关信 息。
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• 二．胚胎免疫组织化学技术的基本原理： • 是用某种蛋白质免疫其他动物(通常为鼠或 兔)而获得相应的抗体(初级抗体)，再用初 级抗体免疫另一种动物，获得次级抗体。 在次级抗体上偶联上一种酶(如碱性磷酸化 酶)，构成免疫复合物。将胚胎与初级抗体 结合后，洗去多余的抗体，再与免疫复合 物结合。最后利用显色反应来确定胚胎内 特定蛋白质的表达位置。本节以爪蟾胚胎 为例介绍胚胎蛋白质免疫组织化学检测的 操作方法。
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• 一．显微操作系统 • 显微操作系统已经历了多次更新和发展。现今 普遍使用的显微操作器一般由带荧光或相差的倒 置显微镜、显微操作臂、注射器及玻璃微吸管、， 摄像装置和计算机图像处理装置等组成。为了配 制一个性能优良的用于发育生物学研究的显微操 作系统，虽有许多必须考虑的因素，但由于现在 普遍采用的显微操作系统一般都是配套购置，且 都具有详细的说明书，因而这里就不详述。有兴 趣者还可参考有关文献。
• • • • • • •
(一)单色全胚原位杂交 1．原位杂交试剂 2．操作步骤 (1)探针制备 (2)胚胎的固定与保存 (3)原位杂交 (4)洗脱和检测
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(二)双色全胚荧光原位杂交
• 用2种不同的标记物(DIG-11-dUTP，生物 素一11一dUTP等)分别标记2个探针，同时 与胚胎杂交，然后对两个探针分别用相应 的抗体进行检测。 • 在双色全胚原位杂交中，探针的制备、胚 胎的固定杂交及洗脱方法与单色原位杂交 步骤相同，只是检测方法有所不同。两次 加入不同的抗体进行两次显色。
第三章 发育生物学研究技术和 方法
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• 在第一章回顾发育生物学的历史时，我们已了解 了实验技术对发育生物学发展的突出贡献，特别 是分子生物学的兴起给发育生物学的发展所带来 的活力。事实上，发育生物学是一门实验性很强 的学科，很多重要的发育理论和发育模型都是在 大量实验结果的基础上建立起来的。其中涉及各 种各样的研究技术和方法，既有传统的胚胎学和 细胞学方法，如胚胎移植、胚胎分割、细胞核移 植等，又有新发展的分子生物学方法，如显微注 射、原位杂交,基因转移及基因功能分析等。本章 将重点介绍发育生物学研究中的几种常用方法 ‘
Developmental Biology
• 三.SSH基本过程是： • 抽提2种不同细胞如肿瘤细胞和正常细胞的mRNA分别作 为检测样本(tester)和参照样本(driver)，反转录成cDNA．， 用Rsa I或Hae III酶切，以产生大小适当的平头末端cDNA 片段，将‘tester cDNA分成均等的2份，各自接上2种接 头，与过量的driver cDNA变性后退火杂交。第一次杂交 后有4种产物： (a)tester cDNA．，(b)自身退火的tester cDNA双链，(c)是tester和driver的异源双链，(d)是driver cDNA。第一次杂交的目的是实现tester单链cDNA均等化 (normalization)，即使原来有丰度差别的单链cDNA．的 相对含量达到基本一致，由于tester cDNA中与 drivercDNA。序列相似的片段大都和driver cDNA形成异 源双链分子(c)，使tester cDNA．中的差异表达基因的目 标cDNA得到大量富集。第一次杂交后，合并2份杂交产物， 再加上新的变性driver单链，再次退火杂交，此时，只有 第一次杂交后经均等化和扣除的单链tester cDNA和driver cDNA一起形成各种双链分子，这次杂交进一步富集了差 异表达基因的cDNA，产生了一种新的双链分子(e)，它的 2个5’端有2个不同的接头，正由于这2个不同的接头，使 其在以后的PCR中被有效地扩增(图3—3)。
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三．操作方法 1．实验所需溶液 2．爪蟾胚胎免疫组织化学检测 (1)胚胎固定 (2)漂白 (3)免疫检测 (4)胚胎切片
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第四节发育基因的启动子分析
• 一。用途 • 启动子调控作用分析是研究胚胎发育基因 功能的一种重要方法，特别在研究基因时 空表达的分子机制方面，更是有突出的作 用。通常，启动子分析包括基因特异调控 序列、启动子(promoter)和增强子元件 (enhancer element)的鉴别，它们都是基因转 录活性的重要调控单元。
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二．胚胎组织切片原位杂交
• 原位杂交是研究胚胎基因表达的常用方法。 虽然全胚原位杂交简单易行，但在许多情 况下，该方法还达不到研究的要求，因而 需要在胚胎的组织切片上进行杂交。在胚 胎的组织切片上杂交的有利因素在于不存 在探针不能渗入到胚胎内部的问题。
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1．实验用试剂 2．操作步骤 (1)胚胎总RNA提取 (2)RNA探针的合成和纯化 (3)杂交和RNA酶消化
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பைடு நூலகம்
第六节 抑制性差减杂交技术
• 一.应用： 抑制性差减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)最早见于1996年6 月Clontech公司、加州大学旧金山分校和俄罗斯 科学院合作的研究报道(Diatchenko et a1 .996)， 是一种简便而高效的通过比较两种总mRNA，而 克隆只存在于其中一种总mRNA中特异表达产物 的新方法。例如可以快速从不同细胞系、不同组 织间或同一细胞系、同一组织在不同条件下(如发 育时间的差异、病理性差异等)克隆出差别表达基 因。
Developmental Biology
• 二..原理 • 是以抑制PCR为基础的DNA差减杂交。抑 制PCR．是利用DNA链内退火优于链间退 火，比链间退火更稳定的特点，使非目的 系列片段两端反向重复系列在退火时产生 类似于“锅一柄”的结构，无法与引物配 对，选择性地抑制了非目的基因片段的扩 增。同时，该方法运用了杂交二级动力学 原理，即高丰度的单链cDNA在退火时产生 同源杂交的速度要快于低丰度的单链cDNA， 从而使原来在丰度上有差别的单链cDNA相 对含量达到基本一致。
• 一 应用：核糖核酸酶(RNase)保护实验是 定量分析基因转录水平的常用方法之一， 它对mRNA的分析具有灵敏度高(比 Northern杂交和点杂交灵敏8～10倍)、 特异性强的特点。另外，核糖核酸酶保 护实验还可用于转录起始位点的确定、 内含子／外显子边界的确定、选择性剪 接(alternative splicing)分析及确定转入 到胚胎中的核酸的降解率等方面的研究。
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• 有多种方法可用于体内(in vivo)启动子分析， 如转基因动物、显微注射等，在不同的动 物中可选用不同的方法，但比较而言，转 基因动物法较为费时，而且需要一些特殊 条件，而显微注射法较为简单。本节将以 斑马鱼胚胎中goosecoid基因启动子分析为 例介绍启动子的定性和定量分析方法。
Developmental Biology
• 第一节 显微注射 • 显微注射(microinj ection)是发育生物学研 究中最经典而又使用最为普遍的一种方法， 特别是近十几年来通过基因转移创造生物 反应器这一具有明显商业价值的应用研究 的开展，更显现出这一技术的活力。本节 将介绍显微操作系统、注射用卵子或胚胎 的准备、操作过程等。
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操作过程 1实验中所需试剂 2实验步骤 （1）RNA的提取 （2）Driver和Tester cDNA的制备 双链cDNA的合成 Rsa1消化 Driver cDNA的制备 （3）差减杂交 （4）PCR扩增 （5）差减文库的构建及差减基因的克隆
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1. 实验所需试剂 2．分散囊胚细胞中的启动子分析 3．完整胚胎中启动子的定量分析 4．整体胚胎中启动子空间活性分析
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第五节 基因表达的核糖核酸酶保护 分析
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• 二、显微注射步骤 • 1．注射用卵母细胞的制备 • 在鱼类和两栖类动物中，卵母细胞可采用两种方 法获得，一是将动物麻醉后，通过解剖取出卵巢 叶(两栖动物)，或用挖卵器从泄殖孔取出所需要 的卵母细胞；另一种方法是杀死动物，取出全部 卵巢。对哺乳动物而言，一般通过超数排卵 (superovulation)获得更多的卵母细胞，即模拟体 内卵母细胞发育与排放的激素调节模式，通过注 射不同的促性腺激素，刺激暂时处于休眠状态的 卵母细胞进入成熟发育期，成熟后排放到输卵管 中。由此可以获得的卵母细胞远多于自然排卵。 下面以两栖动物爪蟾为例，简要介绍制备卵母细 胞的这两种方法的基本步骤。
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核糖核酸酶保护实验的基本原理是： 将待分析的目标DNA序列作为模板，用 逆转录的方法合成与之互补的放射性标 记的探针。将此探针加入到RNA混合物 中后，它便可与目标RNA杂交，形成双 链RNA。由于该双链对核糖核酸酶具有 抵抗力，因此，杂交体系中未杂交的样 品RNA．及过量的探针全部被核糖核酸 酶消化，只剩下杂交形成的双链RNA。 核糖核酸酶失活后，通过凝胶电泳和放 射自显影检测被保护的RNA探针的量， 即RNA样品中目标RNA的量。
Developmental Biology
• 二。原理： • 启动子分析的第一步是将一系列大小不同的启动 子的片段克隆到含有报告基因(reporter gene)的载 体中，然后通过比较这一缺失系列中启动子的活 性，找到启动子中具有调控能力的序列。随后， 将被鉴定出来的调控序列分为更小的片段，并亚 克隆到含有异源活性启动子(如单纯疱疹病毒胸苷 激酶基因启动子)和报告基因的载体中，再次比较 缺失系列启动子的活性，以确定调控序列中的最 关键序列。最后，可通过野生型启动子中单个碱 基的点突变，进一步确定基因的关键调控元件(图 3—2)。
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(1)取出完整卵巢及卵母细胞的培养 (2)取出卵巢叶及卵母细胞的培养 2．注射用胚胎的制备 3.显微注射 在开始注射之前，应准备好所有试剂和器 具。
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第二节胚胎原位杂交
• 全胚原位杂交的基本原理: • 是用各种标记物标记与体内特定mRNA互 补的RNA分子(反义RNA)，以它们作为探 针与动物的整体胚胎进行原位杂交，然后 用相应的抗体来检测特异探针的分布情况。 以下以爪蟾胚胎为例介绍全胚原位杂交的 操作步骤。其他动物的全胚原位杂交与爪 蟾基本相同。
Developmental Biology
• 一．全胚原位杂交 • 全胚原位杂交(whole mount insuite hybridization，WISH)是广泛用于胚胎发育 调控基因表达研究的一种技术。近年来该 技术发展较快，不仅可以检测到较弱的杂 交信号，而且可以多色杂交，检测多个基 因的表达情况。
Developmental Biology
第三节 胚胎免疫组织化学技术
• 一．用途：胚胎免疫组织化学是定位 胚胎内的内源或外源蛋白质的一种有 效方法。该技术操作相对简单，如果 和其他一些免疫学技术结合使用，可 以快速获得相关蛋白质功能的有关信 息。
Developmental Biology
• 二．胚胎免疫组织化学技术的基本原理： • 是用某种蛋白质免疫其他动物(通常为鼠或 兔)而获得相应的抗体(初级抗体)，再用初 级抗体免疫另一种动物，获得次级抗体。 在次级抗体上偶联上一种酶(如碱性磷酸化 酶)，构成免疫复合物。将胚胎与初级抗体 结合后，洗去多余的抗体，再与免疫复合 物结合。最后利用显色反应来确定胚胎内 特定蛋白质的表达位置。本节以爪蟾胚胎 为例介绍胚胎蛋白质免疫组织化学检测的 操作方法。
Developmental Biology
• 一．显微操作系统 • 显微操作系统已经历了多次更新和发展。现今 普遍使用的显微操作器一般由带荧光或相差的倒 置显微镜、显微操作臂、注射器及玻璃微吸管、， 摄像装置和计算机图像处理装置等组成。为了配 制一个性能优良的用于发育生物学研究的显微操 作系统，虽有许多必须考虑的因素，但由于现在 普遍采用的显微操作系统一般都是配套购置，且 都具有详细的说明书，因而这里就不详述。有兴 趣者还可参考有关文献。
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(一)单色全胚原位杂交 1．原位杂交试剂 2．操作步骤 (1)探针制备 (2)胚胎的固定与保存 (3)原位杂交 (4)洗脱和检测
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(二)双色全胚荧光原位杂交
• 用2种不同的标记物(DIG-11-dUTP，生物 素一11一dUTP等)分别标记2个探针，同时 与胚胎杂交，然后对两个探针分别用相应 的抗体进行检测。 • 在双色全胚原位杂交中，探针的制备、胚 胎的固定杂交及洗脱方法与单色原位杂交 步骤相同，只是检测方法有所不同。两次 加入不同的抗体进行两次显色。