蛋白质组学WB

免疫印迹法
Western Blotting 实验技术
之 转膜方法
半干法
按：用缓冲液湿润滤纸 3张、膜、凝胶、缓冲液湿
润滤纸 3张顺序放置，电转 10－ 30min。但高分子
量的蛋白转移效率较低。
免疫印迹法
Western Blotting 实验技术 湿法
之 转膜方法
将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置
免疫印迹法——蛋白样品的制备
3.水溶性多聚物沉淀法 聚乙二醇（PEG）、葡聚糖（DEX）等溶于水中， 蛋白质的极性基团与多聚物分子中的氧或氢氧根结合，
形成二者的复合体，从溶液中沉淀析出。改变多聚物
的浓度可分段沉淀出不同的蛋白质。
4. 通过层析或电洗脱法、色谱等制备目的蛋白
免疫印迹法——蛋白样品的制备
免疫印迹法
Western Blotting 实验技术
之
一般流程

转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色
蛋白样品的制备
SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳




免疫印迹法
成功的要素
科学的对照
免疫印迹法
Western Blotting 实验技术
之
流程详解

转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色
（1） 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳
细胞裂解液： 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L Nacl ,5 mmol/L EDTA, 1%NP40 ， 0.05% PMSF ， 2μg/mL Aprotinin, 0.5μg/mL Leupeptin ， pH8.0
免疫印迹法——蛋白样品的制备
2.低温有机溶剂提取法 蛋白质处在一定量的有机溶剂中，分子间极性基团 的静电引力增强，水化作用降低，蛋白质聚集而沉 淀。对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机 溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。该法沉淀蛋 白质的选择性较高，不需脱盐。
免疫印迹法
Southern Blotting Northern blotting
检测对象是DNA
检测对象是RNA
碱基互补配对
Western Blotting
Eastern Blotting Southwestern blotting
检测对象是特定蛋白质 检测蛋白质翻译后修饰 检测DNA和蛋白质相互作用 检测蛋白质之间的相互作用
之 封闭
目的：防止抗体与膜的非特异性结合。 脱脂奶粉（5％）
BSA
Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）
管号
0
1
2
3
4
5
6
7
8
ddH2O
蛋白标 准液 HCl
90
50
55
60
65
70
75
80
85
0
40
35
30
25
20
15
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免疫印迹法
Western Blotting 实验技术
之
流程详解

转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色
蛋白样品的制备 （2） SDS-PAGE
BCA法 （适合微量、含少量化学物质的样品） 1 灵敏度高，检测浓度下限达到 25μg/ml，最小检测蛋白量 达到0.5μg，待测样品体积为1-20μl 。 2 不受绝大部分样品中去污剂等化学物质的影响，如：SDS， Triton X-100，Tween 。 3 在20-2000μg/ml浓度范围内有良好的线性关系。 4 检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法。 5 会受螯合剂和较高浓度还原剂的影响：如EDTA、DTT、巯 基乙醇。 其他商品化的试剂盒也可测蛋白含量。
硕士生学位课程：蛋白质组学-5
候选蛋白质的验证
易发平
基础医学院生物化学与分子生物学教研室
蛋白质组研究路线
酶解
肽的混合物 蛋白质
搜索引擎 Search engine
PMF
验证
数据库 搜索结果
RNAi实验流程
授课内容
1
免疫印迹法
2
免疫组化法
免疫荧光法
一
候选蛋白质的验证
1
3
下一讲
蛋白质与生物大分子 1 的相互作用
Bradford法 （适合小分子多肽） 考马斯亮蓝 G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定 浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结 合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，
化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。(上样量)
免疫印迹法—蛋白样品的定量
凯氏定氮法：蛋白质中氮在浓硫酸作用下生成铵盐，与浓
的缓冲液中，电转45min或过夜。
具体条件需考虑蛋白分子大小及样品中蛋白实际含量高低。
免疫印迹法
Western Blotting 实验技术 丽春红S染色 之 转膜后检测
蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维 素滤膜，换水几次，脱色。 印度墨汁染色
只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的 Western印迹过程。
简单快速封闭非特异性抗体结合 封闭非特异性抗体结合麻烦
膜的选择 尼龙膜 价格昂贵
需要更高的蛋白结合率
（尼龙膜： 480µ g/cm2 ；硝酸纤维素膜：80µ g/cm2 ）
特殊要求下的选择 目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱
需要更大的机械强度
PVDF膜
蛋白结合量最高，机械强度也高，其上的蛋白可用染 料染色也可免疫显色，但使用前需处理。特别适于氨 基酸组成分析和序列分析。




免疫印迹法
Western Blotting 实验技术
之 蛋白样品的制备
通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白 1.水溶液提取法
针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶
液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。盐析 沉淀出的蛋白质一般保持着天然构象。常用的中性盐是硫酸铵。
免疫印迹法
SDS-PAGE 注意事项
SDS-PAGE结果
免疫印迹法
Western Blotting 实验技术
之
流程详解

（3） 转膜 蛋白样品的制备
SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳

封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色



Western Blotting 实验技术 之 转膜
价格便宜 硝酸纤 维素膜
免疫印迹法
SDS-PAGE 电压设置 电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳 ,而在 溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。
通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳， 或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预
计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
免疫印迹法
SDS-PAGE 预染标准蛋白
免疫印迹法
浓缩胶浓缩蛋白质的原理
随着电泳的进行， Cl-与后面的蛋白带之间形成电 势梯度，同样的蛋白与甘氨酸离子之间也会形成电势梯 度。高电势使蛋白质和甘氨酸离子的移动速度加快，形 成一个迅速移动界面。由于蛋白质的有效泳动度居第二， 使蛋白质聚集在这个移动界面附近，被浓缩成一狭窄的 中间层。所以，加样后，通过此浓缩过程，都能形成一 狭窄的区带。
2-DE 分离蛋白
细 胞 叶 绿 体
验证
protein
细胞膜
病毒 2-DE
鉴定
免疫印迹法
重组蛋白的特点
目的蛋白质的量较多，至少占总蛋白量的 1%，常为
5%-9%，使纯化易于进行。 可利用融合蛋白质的特性进行纯化。利用标示物 （ tag）的特性，用亲合层析柱，可快速分离纯化融 合蛋白质，最后切除 tag即可。很多表达载体已带有 tag的DNA序列。
免疫印迹法
Western Blotting 实验技术
之
流程详解

转膜
蛋白样品的制备
SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳
（4） 封闭

一抗杂交 二抗杂交 底物显色


免疫印迹法
Western Blotting 实验技术
之 封闭- Why?
蛋白 膜 抗体
显色信号
免疫印迹法
Western Blotting 实验技术




Western Blotting 实验技术
之
SDS-PAGE
免疫印迹法
SDS-PAGE 原理
蛋白质进行PAGE时，其迁移率取决于所带的净电荷量 以及分子的大小、形状等因素。如在胶中加入 SDS和
巯基乙醇后，巯基乙醇使蛋白分子中的二硫键还原。
SDS使蛋白的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分 子上，形成蛋白质-SDS复合物。大量的SDS结合后， 各种蛋白都带上相同的负电荷，大大超过了蛋白原有 的电荷量，因而原有的电荷差别可忽略。所以，蛋白 质的迁移率主要取决于它的分子质量。
NaOH作用，产生氨气，吸收于标准硼酸溶液中，用标准酸 直接滴定，测出含氮量，按蛋白质恒定的含氮量（16%）， 换算出蛋白的含量。
福林-酚法（Lowry法）：蛋白质中的酪氨酸、色氨酸、
半胱氨酸残基与 Cu2+ 结合，生成复合物，进而还原酚试剂
的磷钼酸，生成蓝色化合物，用比色法测定。
免疫印迹法—蛋白样品的定量
免疫印迹法—蛋白样品的定量
试 剂 ： 考 马 斯 亮 蓝 工 作 液 ， 0.1N 盐 酸 ， 双 蒸 水 ， 蛋 白 标 准 液 （ 将 10mg/ml 蛋白溶液稀释至 4.0mg/ml, 3.5mg/ml, 3.0mg/ml, 2.5mg/ml, 2.0mg/ml, 1.5mg/ml, 1.0mg/ml, 0.5mg/ml。）
免疫印迹法
重组蛋白的特点
包含体的形成。主要出现在大肠杆菌等原核生物中，溶解度很 小的蛋白都进入包含体中，包含体中的蛋白质主要是外来性的 重组蛋白。离心的方法先收集包含体，再从中分离蛋白。 分泌蛋白质的生成。目的蛋白前加入信号肽序列，可使真核细 胞内表达的蛋白分泌到培养基中，因其中的蛋白质种类较少而 使目的蛋白的分离纯化得以简化。大肠杆菌等有细胞壁的细胞 可分泌至周质中，收集细胞后，改变渗透压，同时加入少量溶 菌酶破坏细胞壁，提取周质后，纯化目的蛋白。
免疫印迹法
Western Blotting 实验技术
之 蛋白样品的定量
生物化学所学的方法都可以。凯氏定氮法、 双缩脲法、福林-酚法和紫外吸收法。
免疫印迹法—蛋白样品的定量
紫外吸收法：蛋白质在280nm左右有吸收高峰（因色氨酸和 酪氨酸的吸收），不同的蛋白，其中色氨酸和酪氨酸的含量
各异，因此A280值不同。
4
流式细胞术
二
免疫印迹法
blotting 实验技术
印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用 相应的探测反应来检测样品的一种方法。
1975年，英国 Edwin Mellor Southern建立了将DNA转移到
硝酸纤维素膜（ NC 膜）上，并利用 DNA － RNA 杂交检测特 定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。
2D电泳分离蛋白质，然后转膜，特异的探针去检测
对 象 已 知 确 定
SDS-PAGE分离蛋白,转膜,尿素去除SDS,蛋白复性,特定DNA探针检测。
far-western blotting
与目标蛋白结合的非抗体蛋白质检测
对象 未知
免疫印迹法
Western Blotting 实验技术
之 基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持 体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。 抗原抗体之间特异的免疫反应。
SDS
配胶的Tris缓冲液
Tris-甘氨酸电泳缓冲液
免疫印迹法
凝胶浓度与蛋白分离范围
凝胶浓度（％） 15 10 7.5 5.0 线性分离范围（KD) 12-43 16-68 36-94 57-212
免疫印迹法
浓缩胶浓缩蛋白质的原理
在不连续SDS-PAGE时,采用了两种缓冲液浓度、pH值和
凝胶孔径，上层胶为浓缩胶（大孔径），下层胶为分离胶 （分子筛）。
**预染蛋白质分子量标准包含了从 19kD 到117kD共6种纯化的预染蓝色蛋白质， 可以直接使用，无需煮沸。每次上样 510 微升，就可以在电泳时、电泳后或转
膜后观察到非常清楚的蛋白条带。
免疫印迹法
SDS-PAGE 注意事项
1）电压。小的电压会使胶的分子筛效应得到充 分发挥，电压越小，条带越漂亮。
浓缩胶中的缓冲对为 Tris-HCl ，电泳 Buffer 的缓冲对为 Tris- 甘氨酸。电泳时，胶中的 Cl- 移动最快， 电泳缓冲液中 的甘氨酸（ pI 为 6.0）在浓缩胶 pH6.8时解离度很小，故移动 最慢。而SDS-Protein 在无分子筛效应的大孔径浓缩胶中移 动速度居第二。即泳动速度为Cl- >蛋白>甘氨酸离子。
免疫印迹法
SDS-PAGE 凝胶成份
丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺（Bis）
聚合而成的分子筛，孔径大小由二者的总浓度及 Bis的浓度决定。Bis一定的情况下，总浓度越高，孔 径越小。
免疫印迹法
SDS-PAGE 凝胶成份 TEMED 过硫酸铵（APS）(时间)
TEMED 及APS激发网状结构的形成。分子氧阻止链的延 长，防碍聚合作用。所以凝胶液需排气，在水或水饱合异丁 醇隔绝空气的条件下反应。