qPCR实验操作流程(20210224133254)

Q-PCR实验流程
一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打
开15-20分钟。

②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。

③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。

取完EP管/枪头后，袋子及时封好。

④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪
头盒及超净台面。

⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。

二、总RNA抽提
1）细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min；
组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称）
2）加入200卩氯仿，剧烈振荡混匀30s,使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min:（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致）
3）4C下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管：（用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层）
4）沉淀RNA :加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次）（不应用振荡器混匀），室温静置10min；
5）4C下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4C下，14,000g 离心
10min，收集RNA沉淀），去上清：
6）用75%乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）（加入乙醇后只需轻轻颠倒EP 管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不能过干或过
湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。

7）视沉淀量加入适量DEPC水（至少15ul）溶解沉淀。

三、去基因组
使用RNase-free的DNase ?（Promega），按以下体系配置反应液，37°C 消化30min，65C 灭活10min。

RNA30
DNase ?20
10 x buffer10
H2O(RNase free)39.5
RNasi n0.5
总体积100
然后按以下步骤操作：
1）加入等体积的苯酚/氯仿，上下颠倒混匀，室温放置5min，后14,000rpm，离心15mi n,取上清。

2）加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀，静置分层后14,000rpm,离心15min，取上清。

3）加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8 次） , -20C静置15min;
4）4C下，14,000g离心15min，收集RNA沉淀，去上清；
5）用75%乙醇洗涤两次（12,000g离心5min），超净台风干；
6）加入适量DEPC水（至少15ul）溶解沉淀。

四、总RNA纯度和完整性检测
1）纯度检测：取1卩l RNA样品50倍稀释，在核酸蛋白检测仪上测定OD值，OD260/OD280的比值大于1.8，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。

2）总RNA完整性检测：取RNA样品1门1 %琼脂糖凝胶电泳80V X20min, EB 染色10min，用凝胶成像系统观察并拍照，总RNA的5s rRNA，18s rRNA 和28s rRNA条带，三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。

五、逆转录
1. mRNA :
1）在RNase free的PCR管中配置下列溶液.
Total RNA
H
2
O
1.0
pg pl
总体积12
2）将上述溶液吹打均匀，置85C保温5min,使RNA变性。

随后立即冰上致冷, 以防止RNA复性；
3）在该PCR管中加入下列试剂（Promega
oligo (dT) 0.5
Ran dom primer0.5
10mM dNTP 2.0
RNase in hibitor0.5p
5 x buffer 4.0p
M-MLV0.5p
总体积8.0p
4）将上述20卩反应溶液30C保温10min;
5）42 T 保温50min；
6）85 T 保温10min；
7）-20 C 保存。

2. microRNA :
使用茎环逆转录法，原理如下图:
Step 2:
Real-time PCR
\ Forward prlmcf t
「. i「I 一
Raverstt
pirlm-ttr
1）在去RNase的PCR管中配置以下溶液
II111 丨I H lllllll J
cONA
2）将上述溶液混匀，85C孵育5min，以打开RNA二级结构。

随后立即置于冰上，以防止RNA复性再次恢复二级结构；
3）在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液：
10mM dNTP (promega) 2.0
RNase in hibitor (promega)0.5
U6逆转录引物0.5d
5x buffer 4.0d
M-MLV (promega)0.5d
总体积7.5d
4）将3）溶液加入到1）溶液中，混匀后30C保温10min；
5）42C 孵育50min;
6）85E孵育10min灭活逆转录酶。

四、定量PCR检测
1•引物测试：
根据mRNA设计的引物正式实验前需进行qPCR测试其特异性和扩增效率，具体反应体系和反应条件如正式实验，每对引物需做模板水对照。

得到结果后，首先根据熔解曲线判断引物特异性，选择标准为：单峰且峰形偏窄、水对照无明显引物二聚体熔解曲线峰。

若设计的多对引物熔解曲线均显示特异性良好，则应对比各引物的扩增曲线，优先选择Ct值小、扩增效率高的引
物进行正式实验。

2 •确定上机内容后，首先在记录本上编排好上机的样品排放顺序。

（1）一个样品的加样尽可能安排在同一行（2）如正式实验中三次重复不能安排在同一板上，则需把三次重复中的实验分开，但同一次重复的实验不能分开两板
3 •正式实验：
体系配制:
H2O4ul
SYBR Green PCR Master Mix10ul （TOYOBO）（使用前需振荡均
匀）
上游引物0.5ul (10uM)
下游引物0.5ul (10uM)
总体积15ul
计算好实验中需用多少份体系，则按具体量配置。

体系分装会有损失，一般多配0.5份--1份体系。

总的体系配好后，在振荡器中振荡均匀或用枪吸打均匀，然后15ul每管分装至8连管中。

3. cDNA用灭菌纯水稀释适当的浓度，一般为1:20稀释，如遇到基因表达低的样品，则适当降低稀释比例至1:10或1:5。

cDNA按一定顺序排好后，即可加至刚配好的反应体系中。

加样完毕，盖好八连管盖，并在八连管盖最上沿的边上标记好1-12的顺序（不可将标记写在反应管的盖子上，八连管盖避免裸手触摸中间透明的荧光采集区域，且保证每孔均盖紧，否则影响重复性或可能出现熔解曲线峰漂移。

）
4. 把各排八连管放在掌上离心机上离心数秒。

五.上机：
5.1先开电脑，进入Windows界面。

接着打开PCR仪电源开关。

5.2打开7500软件，选择“新建”，在“ Template”下拉菜单中选择“ 60”或
“65” （普通基因检测为“ 60”，MicroRNA检测为“ 65”）
5.3打开样品架，放入八连管，关上样品架，并在软件上选择已放反应管的孔
位，剔除无反应管的孔位。

5.4点击File菜单中Save,输入要保存结果的文件名，命名为日期-上机时间-
客户名字简写，如100830-1008-WL表示8月30日10点08分魏立的实验。

5.5点击Start键，开始运行程序。

5.6程序运行完毕后，取出样品架上的八连管，按顺序关闭ABI PRISM 7500
SDS软件、PCR仪电源开关。

5.7在7500软件上标记好每个反应孔的样品名称及检测基因的名称，分类保存
好结果文件。

反应完成后，八连管应装到封口袋中，袋子上标记好文件名，客户的名字。

（同一个客户的三次重复实验，则只需保存其中一次重复的反应管即可，其余可丢弃）
枯藤老树昏鸦，小桥流水人家，古道西风瘦马。

夕阳西下，断肠人在天涯。