透明质酸的微生物发酵法生产与应用概况

透明质酸的微生物发酵法生产与应用概况

作者：李萌季永甜等

来源：《湖北农业科学》2013年第13期

摘要：透明质酸是由葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺的二糖组成的高分子黏多糖，广泛地存在于动物组织中，具有独特的生理特性，在许多领域得到广泛的应用。目前，透明质酸的生产方法主要有提取法、微生物发酵法和人工合成法。对微生物发酵法进行了概述，对透明质酸在化妆品、保健品和医学医疗领域的应用进行了简要介绍，并对透明质酸的生产和应用前景进行了展望。

关键词：透明质酸；微生物发酵法；育种

中图分类号：Q538；TQ920 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）13-2980-04

透明质酸（Hyaluronic acid，HA）是1934年Meyer等从牛眼玻璃体中提取分离得到的一种大分子多糖，故又名玻璃酸[1]。透明质酸是由2 000～25 000个通过β-1，3糖苷键和β-1，4糖苷键交替地结合在一起的葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺的二糖组成的均匀重复的线性葡糖胺聚糖[2]。

透明质酸是胞外基质（Extracellular matrix， ECM）的重要组成部分[1]。近来的研究表明，透明质酸不仅广泛存在于细胞间的胞外基质中，还存在于细胞内，主要集中分布在新生细胞的胞浆和细胞核中[2]。除了在玻璃体中外，透明质酸在关节滑液和表皮细胞间隙中的含量也十分丰富，从数量上看，50%以上的透明质酸存在于皮肤的真皮和表皮中，约35%存在于肌肉和骨骼中。目前认为透明质酸主要是存在于软结缔组织中的惰性空间填料中，在组建蛋白多糖复合物的过程中起着重要的作用[2]。

1 透明质酸的性质

在电子显微镜下，观察到透明质酸分子呈线性单链结构，并在水溶液中扩展成随机的线圈状结构，线圈的直径约为500 nm。透明质酸分子中每一双糖单位均含有一个羧基，在生理条件下均可解离，形成阴离子，等空间距离阴离子之间的相互排斥使其分子在水溶液中处于松散的扩展状态，占据了大量空间，故可结合多于本身1 000倍的水[3]。

根据透明质酸的来源和提取方法的不同，其相对分子质量（Mr）为8×105～5×106[4]。透明质酸的结构及生物活性具有相对分子质量依赖性，其中低相对分子质量透明质酸在低浓度时仅生成碎片状网状结构，而高相对分子质量透明质酸却能生成整体的网状结构[3]。

由于分子内存在氢键，透明质酸分子在水溶液中呈现单螺旋结构[5]。当透明质酸在溶液中达到一定的浓度时，透明质酸分子间便会产生相互作用，从而形成双螺旋结构，浓度更高时则会形成网状结构[3]。目前公认的透明质酸结构理论是三级结构理论，即透明质酸分子中每

个三糖单位具有一个疏水区域，当溶液浓度较高时，透明质酸分子间的疏水区域相互作用，形成双螺旋结构，这是透明质酸分子间相互聚集的基础[6]。

透明质酸的特性是黏度非常高[2]，在低浓度或低相对分子质量时，溶液的黏度随浓度或Mr的增加变化较小；当Mr和浓度增高使黏度达10 mPa·s以后，透明质酸分子便开始缠绕，此时黏度随Mr和浓度的提高而迅速提高[3]。

2 透明质酸的生产技术

已经报道的透明质酸的生产技术有3种，即提取法、微生物发酵法和人工合成法[1]。

提取法是指从人或动物的组织中提取透明质酸[1]。提取法是最早采用的透明质酸的生产方法，目前用于生产的原料主要为鸡冠、人脐带和动物眼球，主要的工艺过程包括提取、除杂、酶解、沉淀和分离，不同组织透明质酸的提取纯化过程有一定的差别[3]。但是由于提取法的原料来源局限性大，产品提取率极低（仅为1%左右），并且工艺程序复杂，因此生产成本很难降低。此外，由于在动物组织中，透明质酸与其他高分子物质相结合，导致其分离纯化的难度更大，并且利用动物组织提取的透明质酸产品可能会导致感染，这些因素限制了提取法在医药和化妆品等工业中的广泛应用[2，3]。

人工合成法是指先利用生物高分子合成“玻璃酸氧氮杂环戊烯衍生物”，然后添加水和羊或牛的精巢透明质酸酶，制备出衍生物和酶的复合体，最后除去酶，纯化出透明质酸[1]。人工合成法尚处于实验室研究阶段，还未应用到工业化生产中[1]。

微生物发酵法是指利用经过筛选的菌种进行发酵培养，并从发酵液中分离纯化得到透明质酸产品[1]。由于提取法存在上述缺点，而人工合成法又尚未成熟，故微生物发酵法成为目前生产透明质酸最主要的方法。下面对透明质酸生产的微生物发酵法进行较系统的概述。

2.1 产透明质酸菌的育种

最早发现的微生物产生透明质酸是在1937年，当时发现链球菌属（Streptococcus）中具有β溶血性的酿脓链球菌（S. pyogenes）可产生透明质酸[7]。随后于1939年又发现链球菌属中的马链球菌（S. equisimilis）和兽疫链球菌（S. zooepidemicus）也能产生透明质酸[7]。

由于野生型链球菌有能产生透明质酸解聚酶、表达其他胞外蛋白、透明质酸产率低等缺点[2]，故实际生产中要通过各种手段对野生型菌种进行改良，以满足工业化生产的需要。

2.1.1 诱变育种诱变剂主要包括物理诱变剂、化学诱变剂和生物诱变剂。目前应用于产生透明质酸菌种育种的诱变剂主要有紫外线、60Co γ射线和亚硝基胍（NTG）[7]。许多研究报道表明，通过上述各种诱变处理方法处理一些能够产生透明质酸的原始菌种，如兽疫链球菌、马链球菌等，能够获得透明质酸产量较高的、或者产生的透明质酸相对分子质量较大的、或者

预先用透明质酸酶处理呈阴性反应的、或者是非溶血的、或者兼有以上几种特点的优良菌株[7]。

2.1.2 原生质体育种由于原生质体与一般的细胞相比去除了细胞壁，故原生质体对外界环境条件变化比一般细胞更为敏感，对诱变处理的反应也更为强烈[7]。目前已有成功的试验，利用NTG等化学诱变剂或利用激光等物理诱变方法处理原始菌种的原生质体，从而获得高产的菌株[7]。

2.1.3 基因工程育种链球菌中编码参与透明质酸合成途径的酶的基因位于一个单顺反子上，名为has操纵子。在酿脓链球菌中，has操纵子由3种基因组成，分别为hasA（1 248 bp）编码透明质酸合酶（42.0 u），hasB（1 204 bp）编码UDP葡萄糖脱氢酶（47.0 u），hasC （915 bp）编码UDP葡萄糖焦磷酸化酶（3

3.7 u）[2]。虽然目前尚不清楚透明质酸链是如何穿过细胞膜进行转运的，但在粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中，透明质酸合酶和UDP葡萄糖脱氢酶的表达足以指导透明质酸的生成和转运[2]。故只需将hasA和hasB基因转入宿主细胞内并使其在宿主细胞内表达，即可生产透明质酸[7]。

A组链球菌的黏液样GAS菌株S43/192/4的HA合成基因于1993年被首次克隆并构建大肠杆菌质粒，在大肠杆菌中成功表达，合成HA[8]。随后C组链球菌的HA合成基因于1997

年被克隆并在大肠杆菌中表达[8]。

凌敏等[9]从马链球菌总DNA中扩增出sqhas基因，构建表达质粒并转化大肠杆菌

DH5α，成功表达出sqHAS蛋白，并在加入底物的情况下合成了HA。张晋宇等[10]克隆了兽

疫链球菌的hasB基因，并在大肠杆菌中表达，得到了相应的蛋白。

中国台湾省Chien课题组将兽疫链球菌hasA和hasB基因通过NICE诱导表达系统引入乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），成功得到产生透明质酸的工程菌株[11]。

生举正[12]将兽疫链球菌透明质酸合酶基因通过NICE（The nisin-controlled gene expression system）诱导表达系统引入乳酸乳球菌，并得以成功表达，合成了HA。

2.2 发酵条件的优化

链球菌是营养条件苛刻的细菌，需要在营养丰富的培养基上生长。链球菌通常在含有酵母或者动物提取物、蛋白胨和血清的混合物的复杂培养基上生长，这些培养基的配方总是包括葡萄糖（10～60 g/L）、氨基酸、核苷酸、大量的盐、痕量的矿质元素和维生素[2]。

pH和温度对兽疫链球菌的生长和透明质酸产量非常重要，有研究表明，pH 6.7±0.2，温度37 ℃的条件对兽疫链球菌的生长和提高透明质酸的产量最为适合[13]。搅拌速率对透明质酸产量也有影响。研究表明，在搅拌速率低的条件下，乳酸产量高而透明质酸产量低[13]。高速率搅拌虽然会减弱乳酸合成的影响，提高透明质酸产量，但会破坏透明质酸多聚体，使其相对分