生防菌的分离.

田间防治效果测定
对柑桔炭疽病的防效 ① 药剂品种：广谱增产菌（北农大生防室）；高脂
膜（沙城）；70％甲基托布津可湿性粉剂（日 本）；Bacillus sp.菌悬液；Trichoderma sp.•菌悬液。 ②方法：对桔园新生春叶进行不同药剂处理，喷药 后对•Bacillus •和 Trichoderma套塑料袋保湿24小时， 每处理４个重复。喷药三天后统一接种炭疽菌 （浓度1.2×106个孢子/ml）。同时设立两个对照， ＣＫ1仅接炭疽菌而不任何药剂，ＣＫ2是仅喷水， 作原始校正。11Ｄ后采叶片保湿培养，5Ｄ后统计 病叶率及防效。
中,加入无菌水定容至10ml,充分 振荡10分钟，静置待土粒沉淀。
b 9ml灭菌水＋ 1ml土壤悬浮 液，充分混匀，即1/100浓度。
c 依次配制，1/1000浓度。 d 同上，即1/10000浓度。 e 同上，即1/100000浓度。
在稀释时，可在盛有无菌水 的试管中加入1滴100g/L的石炭 酸溶液，用以抑制细菌生长。
4．定植、转移的研究 无菌条件下的定植、转移(无菌液培法) 供试作物：辣椒 (8819线辣子) 供试菌：Ｂ4-110，Ｂ-54两个菌系 生长容器：标本瓶(210×300mm) [产地：武汉] 瓶内放一特制网架(直径16.5cm，高8cm)，瓶口用
5cm厚的脱脂棉和一层纱窗网封严。(15磅下蒸气 灭菌20分钟，备用。) 培养液成分：Shive和Robbins营养液Ⅰ(1942) g／l
青霉菌落
乳酸菌Lactobacillus
Bordetella pertussis
芽孢杆菌的分离鉴定和活性测定
1．生长适温测定 将供试枯草芽孢杆菌单胞菌系接于牛肉膏蛋白胨
培养液中(pH7.2)，置于25℃，30℃，35℃，40℃ 四个温度等级下培养，每日用血球计数崐板检测 菌液的浓度。 2．适宜碳源测定 ① 培养基的制作：在无葡萄糖的营养洋菜中分别加 入可溶性淀粉、葡萄糖、麦芽糖、木糖、果糖、 蔗糖、甘露醇和桔粉(由广州糖果厂生产)，浓度为 2％(W/V)，灭菌备用。 ② 培养测定：将供试单胞菌分别接于上述各培养基 平板上，30℃下恒温培养72h后，测定菌落直径。
③ 分离方法：
A:分部位压印分离：按无菌操作条件，分别剪取处 理和对照地上部苗和地上部分别剪取３对真叶和 茎段，一对真叶分正反两面(一片取正面，一片取 反面)，放在培养基平板上，盖一层无菌滤纸， 用 镊子轻压使样品与崐培养基紧密接触，然后取出 滤纸和样品，置30℃温箱培养48h观察。
B:表面消毒后分离：分别选取不同茎段、叶片，剪 成小块(约2mm)，•接崐常规无菌操作于NYDA培 养基上分离，置于30℃温箱培养48h检测供试菌分 布。
3．适宜氮源测定 ① 基础培养基制作：葡萄糖1％(W/V,下同)，
NaH2PO4、K2HPO4各0.05％， MgSO4.7H2O 0.02％，CaCL2.2H2O 0.01％， 琼脂10克，蒸馏水500ml，•沸水中搅拌均匀， 分成五等份，灭菌备用。 ② 氮源种类及含量：蛋白胨 0.5％，酵母汁 0.1％，牛肉膏 0.3•％，NH4CL 0.1％， KNO3 0.1％，分别加入上述基础培养基中， 灭菌备用。 ③ 培养测定：
HV 培养基是以土壤腐殖质为唯一的碳源和氮源的培养基， 只有放线菌能利用腐殖质，所以它能够选择性分离包括 稀有放线菌在内的多种放线菌。但是，HV 培养基的颜 色较深，而且此培养基上长出的放线菌菌落一般比较小， 不易辨认和挑菌。
3. 接种方法：
（1） 稀释平板法 A. 土壤悬浮液制备： a 称取研细的土样1g,倒入试管
细菌 连片 连片
42 连片
25 19 连片
6%酵母膏+0.05%SDS CK1
5 10 0(CK2) 5 10
67
16
72
13
8
连片
21 连片
29
45
真菌 连片
2 0 8 1 0 连片
0 0 连片
2 1
2. 培养基与平板的制作：
高氏1号培养基： 改良高氏无机一号琼脂培养基：
淀粉 20g
淀粉 20g
Ca(NO3)2 0.938 (NH4)2SO4 0.0924 KH2PO4 0.313 MgSO4.7H2O 0.567 FeSO4.7H2O 5.5mg H3BO3 0.57mg MnSO4.4H2O 0.57mg ZnSO4.7H2O 0.57mg 〔可用EDTA-Fe代替FeSO4〕
实验操作步骤
实验一 生防菌的分离
一、实验目的
1. 掌握生防菌的分离方法、分离培养基与培养条件。 2. 观察生防菌如放线菌、细菌、真菌的菌落形态。
二、实验原理
采用稀释法、弹土法。将土壤样品接种到相应 的分离培养基上培养，利用适宜生防菌生长的培养 基与条件，分离不同种类的生防菌。
三、实验材料和仪器
1. 样品：土壤、植物（表面、体内）、果实。
不同浓度对放线菌分离的影响
放线菌的菌落特征 A：诺尔斯氏链霉菌 C：酒红指孢囊菌 E：小单胞菌
B：皮疽诺卡氏菌 D：游动放线菌 F：皱双孢马杜拉放线菌
细菌
假单胞菌PseudomonaEsnterobacter cloacae aeruginosa
葡萄球菌Staphylococcus 链球菌Streptococcus sobrinus 葡萄球菌Staphylococcus 螺原体Spirillum Borrelia burgdorferi
对番茄早疫病的防效
① 供试菌株浓度分别为 1×10標拝6个/ｍｌ。② 供试化学农 药：70％甲基托布津ＷＰ800×液，杀毒矾Ｍ８ 400×液。 ③ 供试番茄品种：利春。④试验地点：咸阳市秦都区沣西 乡伍家堡。生态环境为塑料大棚（总面积约300平方米）。 ⑤ 试验小区设计：各供试药剂及空白对照各自为一个处理， 共９个处理，重复三次，小区面积为5×0.7米，按随机区 组排列。⑥ 田间喷雾及病情调查：在4月8日（现蕾期）和 4月19•日（开花期）两崐次喷雾，每次均在傍晚进行，空 白对照喷清水；喷药前调查一次发病基数，每次喷药以后， 大致在第五、十、十五天以小叶为单位调查发病情况，分 别崐记载病叶数和严重度。
放线菌的分离计数用培养基（淀粉铵盐培养基）：
可溶性淀粉 10g, (NH4)2SO4 2g, K2HPO4 1g , MgSO4·7H2O 0.5g, KCl 0.5g, FeSO4·7H2O 0.01g , 琼脂 18g, 水 1000ml , pH7.6～7.8。
实验方法
<1>熔化培养基倒皿，每皿12ml左右。设三个皿为 对照(CK)，每个土样处理3个皿。培养基冷凝后， 放入80℃的烘箱中，除去表面的冷凝水，一般烘 10～15分钟。
已融化好的高氏一号培养基中加入K2Cr7O4溶 液(每300ml加入100ppm 1ml)调至pH 7.2～7.4，待 温度降至40℃时倒皿，皿/40毫升培养基。
其它分离培养基
玉米粉琼脂、黄豆粉琼脂、Waksman 、Bennett 培养基均用 于分离放线菌。
几丁质培养基是分离放线菌的最有用的培养基之一，只有放 线菌够利用几丁质，所分离的放线菌菌落较小，呈白色， 再转接到适于产生可溶性色素的适当培养基上来加以区 别。
自然条件下的传导实验
生防菌的标记实验
① 抗生素：利福平（有效成份甲哌力复霉素：150mg/片；陕 西省医药工业研究所制造）
② 供试菌：Ｂ-51菌系 ③ 培养基：改良NYDA(％)[107]：牛肉膏0.8，酵母浸出液0.5，
蔗糖1.0 琼脂2.0，pH为7.0。 实验方法：将利福平药片去糖衣，研成粉末，按有效成分计
杂菌抑制剂：多菌灵(1×10-3 g/l)、放线菌酮 (5×10-6 g/l)、制霉素(4×10-6 g/l) 、重铬酸钾(5×10-6 g/l)。
土样预处理的分菌效果
处理 预处理剂
6%酵母膏
0.05%SDS
风干(d) 0 5 10 0 5 10 0
放线菌 27 78 76 30 69 65 28
①种子消毒与浸种催芽：种子用0.1％401杀菌剂浸泡 4小时， 用无菌水冲洗后再浸种16小时；将双层滤 纸(灭菌)铺到无菌培养皿中，加无菌水湿润，将浸 种后的种子摆好，置30℃温箱中催芽。
② 拌种处理与播种培苗：将催芽至2cm的种子分装 于两个无菌培养皿中，一皿倒入10ml菌悬液，另 一皿倒入10ml无菌水作对照，轻摇混匀，静置10 分崐钟后，分别选萌发一致的种芽等距离播于无 菌生长容器的网架上，每瓶播17崐粒，封瓶后， 置温度28℃、光暗各12小时的光照培养箱中培养， 待苗子长出３对真叶时(6周)分离。
细菌 真菌 数量 数量
放线菌/总菌落数
3. 每克土样中的菌落数的计算（间接法）
每克土样中的菌落数＝（每皿菌落平均数×稀释倍数）/干土的百分数 注：干土的百分数即土壤干重％，本次实验烘干土样的百分数按100% 计。
*认真填写每次实验报告，完成实验记录、计算、绘图等，实 验报告成绩占30%
实验结果的观察与记录方法
（4）拮抗菌株的筛选（体外平板初筛） 涂抹法或混菌法接种
（5）发酵培养
（5）化合物鉴定 农抗的下游加工工艺
（6）提取总化合物
（7）化合物分离 （5）盆栽试验（抗菌谱） 作用机理
理化性质 生物学性质
四、实验操作
1.土样准备：
采集土样应该尽快进行土样预处理与分离工作，放置时间过 长会影响分菌的准确性。
芽胞杆菌Bacillus subtilis 大肠杆菌Escherichia coli 棒状杆菌Corynebacterium
乳酸菌Lactobacillus
Bordetella pertussis
单细胞真菌形态
酵母菌出芽繁殖
新生隐球菌
酵母型菌落 C. albicans菌落 曲霉属
(类酵母型)
2. 用品与仪器：三角瓶、刻度试管、灭菌水、称
量纸、玻璃吸管、电子天平、超净工作台、微波炉。
3. 培养基：
（1）高氏一号：培养放线菌。 （2）PDA：分离真菌; （3）KB：培养细菌。
生防微生物的筛选程序
（1）样品的采集
（2）生防菌的分离（分离培养基）
原始菌种保存
（3）纯化与培养 （单菌落稀释后划线、单孢分离纯化）
B. 接种方法： d或e土壤溶液，每皿加入20～30µl，用吸管吸
0.1ml(2滴)，取用无菌三角玻璃棒涂抹接种。
（2） 弹土法 每皿弹入约0.2毫克土壤样品粉末。
4. 培养：
放线菌28℃培养7-14 天 细菌3－5天 真菌5－7天 观察、调查菌落数、计数。
5．放线菌计数方法
采用平板菌落计数方法。
K2HPO4 0.5g K2HPO4 0.5g
NaCl 0.5g
NaCl 0.5g
KNO3 1g
KNO3 1g
Hale Waihona Puke Baidu
MgSO4 0.5g
MgSO4·7H2O 0.5g
FeSO4 0.01g 琼脂 10g 水1000ml。
FeSO4·7H2 O 0.01g 琼脂 18-20g 水 1000ml，pH 7.2～7.4。
算浓度，用无水配成不同浓度梯度的药液，加到NYDA培 养基中，配制成合乎设计浓度要求的含药平板，然后按逐 级梯度筛选法，从低浓度到高浓度逐级锻炼培养，直至获 得抗适宜利福平浓度的标记菌株。
药物传导实验
① 供试作物：番茄（品种：早丰） ② 步骤：将标记的Ｂ-51菌悬液用涂抹法接于番茄最
上端叶片，按不同时间不同部位取样，经升汞表 面消毒后用NYDA药板分离，统计分离结果。 （接种部位和分离部位示意图)
<2>选取每皿放线菌菌落数20～200个的平板用于计 数
五、实验结果的观察记录与实验课作业
1. 描述2-3种培养性状不同的放线菌： 菌落的形态、大小、颜色，绘图。 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
2. 分离结果记录与计算： 放线菌分离结果的调查表
分离方法 弹土法 稀释法
放线菌
数量
种类数
土样25℃恒温箱中干燥3天，干燥后的土样与 CaCO3 10:1混 合，26℃下保温4天。
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土壤预处理方法: 为了提高土壤中放线菌的分离效率，采集的 土样应立即于28℃风干10d，用6%酵母膏和0.05%SDS（5mmol/L 磷酸缓冲液配置）对其悬浮液进行预处理，再采用接种至添加重 铬酸钾（250mg/L）的培养基中分离放线菌，加入抗真菌试剂和 抗细菌抗生素抑制细菌和真菌的生长增加放线菌的分出率。