生防菌的分离.
生防菌对植物真菌病害作用整理
生防菌对植物真菌病害的作用学院：生命科学学院专业班级：学生姓名：目录摘要 (3)1植物真菌病害 (3)2生防菌的种类及生防机制 (3)2.1 生防菌的种类 (3)2.2 生防菌的生防机制 (4)2.2.1 竞争作用 (4)2.2.2 拮抗作用 (5)2.2.3 诱导抗性作用 (5)2.2.4 促生作用 (6)3 生防菌的筛选与鉴定 (7)3.1 拮抗芽孢杆菌的分离 (7)3.2 芽孢杆菌的分类鉴定 (7)参考文献： (8)生防菌对植物真菌病害的作用摘要：真菌病害是造成作物产量损失的主要原因，作物病害的80％由病原真菌引起，利用微生物及其代谢产物对其进行生物防治，是目前研究的热点。
可用于生物防治的微生物有真菌、细菌、放线菌、病原菌弱致病菌等。
生防菌的生防机制各不相同，主要有竞争作用、拮抗作用、诱导作物抗性和促进作物生长，间接提高作物抗性等作用，许多生防微生物还可通过几种不同机制之间的联合来发挥功能。
本文还对生防菌的分离与分类鉴定进行了简单介绍。
关键词：真菌病害，生物防治，生防机制，木霉菌，芽孢杆菌，放线菌1植物真菌病害植物病害一直是农作物优质高产的重要制约因素之一。
据估计, 全球主要农作物的平均损失约占总产量的10 %～15 %, 每年直接经济损失高达数千亿美元。
在植物病害中,70 %～80 %的病害是病原真菌侵染所引致的。
植物真菌病害不仅直接造成农作物产量下降与品质降低, 而且部分病原真菌在侵染农作物过程中, 可分泌产生多种对人畜有害的毒素与代谢物, 对农产品的安全性构成极大威胁。
此外, 重大农作物真菌病害的控制往往依赖化学防治, 杀菌剂的使用不仅增大生产成本, 而且其反复施用不可避免地带来环境污染与农产品农药残留问题[1]。
因此，近年来世界各国都在努力开发可替代传统化学药剂控制植物病害的新方法。
其中利用微生物及其代谢产物进行生物防治，被公认为是一种环境友好型的选择。
2生防菌的种类及生防机制2.1 生防菌的种类生防菌的种类繁多,生产上广泛应用的有真菌、细菌、放线菌、病毒等。
土传病害生防菌的分离筛选及鉴定
Screening and Identification of Antagonisms Against the Soilborne Pathogens
(1Institute of Animal Husbandry and Veterinary, Anhui Academy of Agricultural Sciences , Hefei 230031;
陈丽园等： 土传病害生防菌的分离筛选及鉴定
·9·
土传病害危害程度深。20 世纪 70 年代， 美国俄亥俄州 大学植物病理学教授 Hoitink 等[1]首次利用树皮制作的 堆肥， 成功地防治苗圃中严重的根腐病、 疫霉病和立枯 病等土传病害， 开拓了利用土壤有益微生物对土传病 害进行防治的研究领域。生物防治具有高效、 零污染、 不产生抗药性和防治结合等优势， 其中生防有机肥集 生物肥和有机肥的优点于一身， 有机肥作为拮抗菌的 载体， 能为其提供足够的碳、 氮源， 延长其在土壤中的 生存时间， 使其容易形成优势菌群， 从而有效抑制了病 原菌的生长
基金项目： 国家现代产业技术体系 “国家现代产业技术体系 （蛋鸡） 专项经费” (CARS-41-K19)。 第一作者简介： 陈丽园， 女， 1981 年出生， 福建永定人， 助理研究员， 硕士， 主要从事饲料及环境微生物方面的研究。E-mail： semidry2@。 通讯作者： 詹凯， 男， 1968 年出生， 安徽安庆人， 研究员， 博士， 从事家禽育种及生产研究。通信地址： 230031 安徽省合肥市农科南路 40 号省农科院创 新大楼 402 室 安徽省农科院畜牧所， Tel： 0551-62160598， E-mail： zhankai633@。 收稿日期： 2014-02-20， 修回日期： 2014-05-12。
《葡萄根癌病生防菌Ag-5的分离鉴定及全基因组特征分析》
《葡萄根癌病生防菌Ag-5的分离鉴定及全基因组特征分析》一、引言葡萄根癌病是一种由根癌细菌引起的植物病害，严重威胁着葡萄产业的健康发展。
为了有效防治这一病害，本文针对一种具有生防潜力的细菌——Ag-5进行了深入的分离鉴定及全基因组特征分析。
该研究不仅有助于理解Ag-5的生物学特性，而且为开发新型的生物防治产品提供了理论依据。
二、材料与方法1. 材料本研究所用材料包括葡萄根癌病患处组织、土壤等。
实验所使用的试剂和仪器均符合相关标准。
2. 方法（1）Ag-5的分离与纯化：从葡萄根癌病患处组织及土壤中分离出潜在生防菌，经过纯化获得纯菌株Ag-5。
（2）形态学鉴定：通过显微镜观察Ag-5的形态特征，包括菌落形态、细胞形态等。
（3）生理生化鉴定：利用API等生化鉴定系统对Ag-5进行生理生化特性分析。
（4）分子生物学鉴定：通过16S rRNA基因序列分析对Ag-5进行分子生物学鉴定。
（5）全基因组特征分析：利用新一代测序技术对Ag-5进行全基因组测序，分析其基因组特征。
三、结果与分析1. Ag-5的分离与纯化结果通过分离与纯化，成功获得纯菌株Ag-5。
该菌株在葡萄根癌病患处组织及土壤中均有分布。
2. 形态学鉴定结果显微镜观察结果显示，Ag-5为短杆状细菌，菌落呈圆形，表面光滑，具有典型的生防菌形态特征。
3. 生理生化鉴定结果API等生化鉴定系统分析结果表明，Ag-5具有多种生理生化特性，如能够利用多种碳源、具有产酸产气能力等。
这些特性表明Ag-5具有较强的适应性和生存能力。
4. 分子生物学鉴定结果通过16S rRNA基因序列分析，确定Ag-5属于根癌菌属。
该结果进一步证实了Ag-5的生防潜力。
5. 全基因组特征分析结果通过对Ag-5进行全基因组测序，获得了其全基因组序列。
分析结果显示，Ag-5基因组具有丰富的功能基因，包括抗逆性、生物防治、代谢等相关基因。
这些基因的发现为进一步研究Ag-5的生物防治机制提供了重要依据。
猕猴桃溃疡病病原菌的鉴定及生防菌的筛选
2021年34卷4期Vol.34No.4西"农业学&Southwest China Journal of Agricultural Sciences755文章编号：1001-4829(2021)4-0755-07DOI:10.16213/kb scjas.2021.4.011狒猴桃溃疡病病原菌的鉴定及生防菌的筛选杜贞娜，晏子英，候忠余，李树江，张晓勇，杨友联(六盘水师范学院生物科学与技术学院，贵州六盘水553004)摘要：！目的】探明獄猴桃溃疡病的致病病原，为该病的生物疗诒提供有效的菌种资源。
【方法】采用常规组织分离法从獄猴桃感染溃疡病的染病组织分离致病病原菌，从獄猴桃种植土壤和健康獄猴桃组织中分离细菌，采用抑菌圈法筛选拮抗菌株，通过-态学与分子生物学相结S的方法对分离的菌株进行鉴定。
【结果】从獄猴桃感染溃疡病的染病组织中分离到9株菌株，经鉴定确定致病病原菌为丁香假单胞杆菌獄猴桃致病变种(Pseudomonas syringa e s>v.a；epgas%;从土壤和健康的獄猴桃组织分离到35株细菌，其中3株芽抱杆菌(BaciPus e pp-对獄猴桃溃疡病病原菌具有较好拮抗效果，抑菌圈直径平均为20.8-23.7mm…［结论】为獄猴桃溃疡病生疗菌剂的开发应用奠定了基础&关键词：獄猴桃；溃疡病；病原菌;拮抗真菌；生物疗诒；分子生物学鉴定；天盘水；贵州中图分类号:S436-34.1+2文献标识码：AIsolation and Hentification of Patiogen Causing Canker andScreemng of Biocontrol Bacteria in KiwifruinDU Zhen-na,YAN ZTying,HOU Zhong-yu,LI Shu-jiang,ZHANG Xiao-yong,YANG You-lian*(Colleve of Biological Sciences and Technology,Liupanshul Normal University,Guizhou Liupanshui553004,China)Abstract:【Objecfve】The peesentpapeeaimed toeeeieypathogenicbacteeiaoekiwieeuitcankeeand peoeidee e e ctieesteain eesoueceseoebio-logical control against kiwWruit canker-【Method]The pathogenic bacteria were isolated from infected bsucs of kiwifruit plan—infected with canker by a convention tissue isolation method.The antagonbtic strains were screened from the bacteria isolated from soil and heal—y kl-wbruit tissues by an inhibition zone method.The isolated antagonis/c r—ains were identified by morphology and molecular biology methods-【Result]9strains isolated from the infected tissues of kiwifmit plants infected with canker were identified as Pseudomonae38x050pv.Ac-tinidae.35strains were isolated from soil and healthy kiwWruit tissues.3screened Bacillus strains had the good antagonism e/ect against Pseudomooas syringa c pv.Actinidat and the average diameter of inhibiA/zone was20.8-23.7mm.【Conclusion]Three screened Bacillus strains lay a foundation As development and application of biological agents against kiwifmit cankes-Key words:KiwifmW；Canker；Pathogen；Antagonistic fungus,Biological control；Molecular biological identWicaCon；Liupanshul；Guizhou【研究意义］I猴桃(ActiniPP spp.)是一种经济价值极髙的水果，其中Vc含量非常丰富，每100y 果肉中含有Vc100〜420my,被誉为“水果之收稿日期：2019-06-23基金项目：贵州省教育厅特色重点实验室建设项目“贵州省特色农业种质资源开发与利用重点实验室”&黔教合KY(2017) 012］%国家级大学生创新创业项目“六盘水I猴桃溃疡病生防菌筛选研究”(201710977019)%六盘水科技局联合基金项目“I 猴桃内生真菌多样性及溃疡病生防菌筛选(52020-2018-04-02),2六盘水特色果树资源研究与利用重点实验室3(52020-2017-02-03)%六盘水师范学院科技创新团队项目2分子生物学与生物化学科技创新团队”(LPSSYKJTD201602号)作者简介：杜贞娜(1994-),女，E-mail：2820218998@qq.cm% *为通讯作者:杨友联(1975-),男，教授，博士,主要从事微生物学研究和教学,E-mail：yangyoulianl@163-com。
大麻白绢病生防菌贝莱斯芽孢杆菌的筛选鉴定及发酵条件优化
文章编号:１６７１ － ３５３２(２０２３)０２ － ００６６ － １１
大麻白绢病生防菌贝莱斯芽孢杆菌的
筛选鉴定及发酵条件优化
王芳１ꎬ２ ꎬ曹璐２ꎬ３ ꎬ秦菁菁２ꎬ４ ꎬ林宇丰５ ꎬ许秀美５ ꎬ张政兵５ ꎬ
的最佳发酵条件为:酵母粉浓度 １４.１２ ｇ / Ｌ、葡萄糖浓度 １１.８４ ｇ / Ｌ、发酵温度 ３１.５６ ℃ 、发酵时间
１７.９１ ｈꎬ预测抑菌率最高可达 ８９.２７％ꎮ
关键词:贝莱斯芽孢杆菌ꎻ生防活性ꎻ发酵培养ꎻ条件优化
中图分类号:Ｓ５６３.３ 文献标识码:Ａ 开放科学( 资源服务) 标识码( ＯＳＩＤ) :
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ:Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｅｌｅｚｅｎｓｉｓꎻ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ａｃｔｉｖｉｔｙꎻ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅꎻ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
大麻( Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ Ｌ.) 是我国传统的经济作物ꎬ目前为止ꎬ科研人员已从大麻植株中提取并
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１ 材料与方法
１.１ 试验材料
１.１.１ 材料
大麻植株叶片ꎬ用于分离大麻内生菌ꎻ
供试菌株:大麻白绢病菌( Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ ｒｏｌｆｓｉｉ Ｓａｃｃ.) ( 工业大麻叶片内生菌) ꎬ用于筛选大麻白绢
病原生防菌ꎮ
１.１.２ 培养基
肉膏蛋白胨培养基( Ｌｕｒｉａ －Ｂｅｒｔａｎｉ 培养基 / ＬＢ 培养基) :蛋白胨 １０ ｇ / Ｌꎬ酵母提取物 ５ ｇ / Ｌꎬ氯化
测定研究ꎬ并结合单因素试验和响应面法优化该菌株发酵条件ꎬ旨在分离大麻内生细菌ꎬ并从中筛
生防菌的纯化与鉴定
孢子囊梗与菌丝无区别，孢子 囊呈袋状，有的呈袋状叶瓣状。成 熟时不脱落，萌发时形成泡囊，由 泡囊产生游动孢子，有性产生一个 卵孢子。 •
(2)疫霉属(Phytophthora)
取马铃薯晚疫病(P.infestans)标本，观察受
害部位。注意症状特点，特别要注意叶片 上病斑的位置，大小、状态、颜色，边缘 是否清楚，是否产生灰白色的霉层(特别是 叶背面)?挑取马铃薯晚疫病菌斜面培养菌制 片镜检游动孢囊梗、游动孢子囊和游动孢 子，注意孢囊梗分枝的特点及游动孢子囊 的形态。
链霉菌 myctinomycetes•
•属于链霉菌属（Streptomyces），粉红孢类群（Roseoporus）弗氏亚群 亚群（Fradiae）
链霉菌属（Streptomyces）蓝色亚群（Gyaneus）.
链霉菌属（Streptomyces）黄色亚群（Flavus）
菌落边缘菌丝、产孢子形态
(1)单胞锈菌属(Uromyces)
冬孢子有柄，单细胞，顶壁较厚，突破寄主 表皮生于体外，取菜豆锈病 (U.appendiculatus)病叶和病荚标本观察夏孢 子堆和冬孢子堆的大小、颜色，是否穿破 表皮?用解剖针挑取病叶上的冬孢子制片镜 检，注意该属锈菌的形态特征。
(2)黑粉菌属(Ustilago)
2. 镜检：方法同上，观察酵母菌的细胞形态及生殖方式。 3. 菌落观察：仔细观察平板培养基上的孤立菌落，记载所观
察酵母菌种类的菌落特征。
注意：1. 加盖玻片时，以一边先接触液体，勿使产生气泡 ； 2. 用完油镜后一定要将镜头上的油擦干净。
五、实验结果的观察记录
1. 放线菌菌落特征：
菌落特征：圆形、较小、干燥、质地致密，表面粉粒 状或绒毛状，有呈同心环或辐射状。皿内菌丝与培养基紧 密结合，用针难以挑取。菌丝体与孢子常具不同色素，故 菌落正面和背面可显示相应颜色。有的种类可散发特殊气 味。
24个油棕品种对3种真菌性叶斑病的抗病性评价及生防细菌的分离、筛选
24个油棕品种对3种真菌性叶斑病的抗病性评价及生防细菌的分离、筛选郑丽;张海鹏;林江;王娇娇;李梦倩;潘登浪;李静;曾宪海【摘要】通过针刺接种方法,将24个油棕品种对3种病原菌(YZ-4、YZ-6和 YZ-8)的抗病性进行评价,发现对YZ-4抗病性较强的油棕品种为RY-2和RY-6,对YZ-6抗病性较强的油棕品种为RY-9、RY-14、RY-15、RY-31、RY-37、RY-38,对YZ-8抗病性较强的油棕品种为RY-38;可见不同品种对病原菌的抗性存在差异.针对3种病原菌进行生防菌株的分离和筛选,从不同生境(根、叶、土壤)中分离到138株细菌,测定其几丁质酶、蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶活性,以及产生吲哚乙酸和嗜铁素等次生代谢物能力,采用平板对峙法进行颉颃活性测定.结果表明,138株菌株产生长素的菌株最多,比例达75.36%;无产几丁质酶和葡聚糖酶的菌株;产蛋白酶、纤维素酶和嗜铁素的比例分别为67.39%、58.70%和63.04%.AR156对YZ-4具有很强颉颃性,综合赋值总分为13;HNLE-4-2和3BS3对YZ-6具有最好颉颃效果,其综合赋值总分为10;3BS3对YZ-8具有最好的颉颃效果,综合赋值总分为10.【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2017(044)007【总页数】9页(P96-103,封3)【关键词】油棕;抗性评价;颉颃;水解酶;筛选【作者】郑丽;张海鹏;林江;王娇娇;李梦倩;潘登浪;李静;曾宪海【作者单位】农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室/省部共建国家重点实验室培育基地——海南省热带作物栽培生理学重点实验室/农业部儋州热带作物科学观测实验站/农业部儋州油棕种质资源圃,海南儋州 571737;中国热带农业科学院广州实验站,广东广州 510140;华南农业大学农学院,广东广州 510642;华南农业大学农学院,广东广州 510642;海南大学热带农林学院,海南儋州 571737;海南大学热带农林学院,海南儋州 571737;海南大学热带农林学院,海南儋州 571737;农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室/省部共建国家重点实验室培育基地——海南省热带作物栽培生理学重点实验室/农业部儋州热带作物科学观测实验站/农业部儋州油棕种质资源圃,海南儋州 571737;中国热带农业科学院广州实验站,广东广州 510140;农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室/省部共建国家重点实验室培育基地——海南省热带作物栽培生理学重点实验室/农业部儋州热带作物科学观测实验站/农业部儋州油棕种质资源圃,海南儋州 571737【正文语种】中文【中图分类】S765.5油棕（Elaeis guineensis Jacq.）属棕榈科，别名油椰子，是热带地区重要的木本油料作物，除食用外，也可用于工业和生物柴油的生产［1-4］。
抗稻瘟病生防细菌的分离与筛选
卫 甜，吕 敏，刘怀阿，等．抗稻瘟病生防细菌的分离与筛选［Ｊ］．江苏农业科学，２０２１，４９（７）：１０６－１１１．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２１．０７．０１７抗稻瘟病生防细菌的分离与筛选卫 甜，吕 敏，刘怀阿，朱锦磊，苏建坤（江苏里下河地区农业科学研究所，江苏扬州２２５００７） 摘要：由病原真菌Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅｏｒｙｚａｅ引起的稻瘟病是水稻生产上的一种毁灭性病害。
从稻瘟病发病严重的田块分别采集健康株和病株，从１４个不同生境（土壤、根茎叶围、根茎叶内）中共分离得到３０４株潜在生防细菌。
通过对各细菌胞外产酶活性（葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶）及产吲哚乙酸活性进行测定，并根据不同指标对细菌进行赋值，最终选择评分≥３分的１１４株细菌进行稻瘟病菌的平板拮抗试验，从中筛选得到１５株对稻瘟病病菌有明显拮抗作用的生防细菌。
最终根据赋值评分结果及平板拮抗试验在实验室条件下对筛选出的１７株具有防治稻瘟病潜在能力的生防细菌进行１６ＳｒＤＮＡ鉴定，鉴定结果表明，有１５株为芽孢杆菌，１株为糖霉菌，另１株为水库杆菌。
本研究以此建立一个针对稻瘟病生防细菌筛选的系统，得到的生防细菌可以为田间防治稻瘟病并最终应用于实际生产提供理论基础。
关键词：稻瘟病；细菌筛选；酶活性测定；平板拮抗；生防细菌 中图分类号：Ｓ４３５．１１１．４＋１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０２１）０７－０１０６－０５收稿日期：２０２０－０６－０４基金项目：江苏里下河地区农业科学研究所专项基金［编号：ＳＪ（１７）１０３］。
作者简介：卫 甜（１９９０—），女，山西运城人，硕士，助理研究员，主要从事植物病害的生物防治工作。
Ｔｅｌ：（０５１４）８７３０２２２９；Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｅｉｔｉａｎ９００１２８＠１６３．ｃｏｍ。
通信作者：苏建坤，硕士，研究员，主要从事植物病虫害的绿色防控工作。
Ｔｅｌ：（０５１４）８７３０２３２５；Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｚｓｕｊｋ＠１６３．ｃｏｍ。
生防芽孢杆菌的分离筛选与初步鉴定
生防芽孢杆菌的分离筛选与初步鉴定任士伟;邢小霞;董向丽【摘要】30 Strains of Bacillus spp. were isolated from 7 soil samples using repeated plate streaking, and 4 strains of them had rivalry ability to Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum. They had also antagonism effect and broad spectrum to other plant pathogenic fungi proved by the method of plate test. We detected that the secondary metabolites of Bacillus spp. had fungistasis and could induce deformed growth of hyphae, the metabolites had water-solubility ability. The hyphae of Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum et al. could be induced bulge, browning, tip dulled. produced sporule by zymotic fluid. A strain of Bacillus subtilis was preliminary identified through observation of its morphological features and culture characters and a series of biochemical experiments.%从不同环境中采集7份土壤样品用于芽孢杆菌的分离纯化,通过多次平板划线分离纯化得到30个菌落形态不同的菌株.以黄瓜枯萎病菌为指示菌对得到的菌株进行抑菌活性筛选,其中的4个菌株具有明显的抑菌作用.采用对峙生长法,测定4株芽孢杆菌对其它植物病原真菌的活性,结果显示4个芽孢杆菌均具有广谱抑菌性.进一步试验表明,4株芽孢杆菌的发酵液也具有明显的抑菌作用,说明对病原真菌有抑制作用的物质水溶性较大,大部分释放到发酵液中,并且发酵液可使黄瓜枯萎等植物病原真菌菌丝膨大、褐变、末端钝圆,促进镰刀菌产生小孢子.通过菌落形态特征、系列生化测定对其进行初步鉴定,结果表明其中一株为枯草芽孢杆菌.【期刊名称】《现代农药》【年(卷),期】2011(010)001【总页数】4页(P44-47)【关键词】芽孢杆菌;拮抗作用;植物病原真菌;发酵液【作者】任士伟;邢小霞;董向丽【作者单位】青岛农业大学农学与植物保护学院,山东青岛266109;青岛农业大学农学与植物保护学院,山东青岛266109;青岛农业大学农学与植物保护学院,山东青岛266109【正文语种】中文【中图分类】S482.2+92植物病害是影响农业生产的主要因素之一，其中80%以上为真菌病害[1]，目前对其防治主要以化防为主，但化学农药常常导致“3R”等负面影响，利用微生物及其所产生的抗菌物质进行植物病害生物防治具有很大的应用价值和潜力。
土壤中杨树溃疡病生防菌的分离鉴定
Isolation and Identification of Biocontrol Microorganisms in Soil to Poplar Canker
Yang Lei
2， 3
Liang Jun
1， 3
Zhou Guoying
2
Ni Yang
3
Lü Quan
3
Zhang Xingyao
1， 3
Nanjing 210037 ;
Changsha 410004 ;
3 ． The Key Laboratory of Forest Protection of China State Forestry Administration ，Ｒesearch Institute of Forest Ecology ， Environment and Protection ，Chinese Academy of Forestry Beijing 100091 ，China )
( 1 ． Southern modern forestry cooperative innovation center ，Nanjing Forestry University 2 ． College of Forestry ，Central South University of Forestry ＆ Technology
第 51 卷 第 4 期 2015年 4 月 7488．20150415 doi :10．11707 / j．1001-
林
SCIENTIA
业Leabharlann 科SILVAE学
SINICAE
Vol. 51 ， No. 4 Apr． ， 2015
土 壤 中 杨 树 溃疡 病 生 防 菌 的分 离 鉴 定
烟草赤星病生防菌的分离与鉴定
摘要从连作障碍较严重的烟草根际土壤中分离出49株细菌活体纯培养物,依次编号为HHHB1~HHHB49,并筛选出对烟草赤星病病原菌(Alternaria alternate )具有拮抗活性的菌株HHHB7和HHHB19,二者抑菌圈直径分别为5、23mm 。
二者初步定性为具有生防活性。
多相鉴定结果表明,活性最强的菌株HHHB19隶属于假单胞菌属(Pseudomonas ),暂定名Pseudomonas sp.HHHB19。
盆栽试验证实,HHHB19菌株悬液叶面喷雾混合处理对烟草赤星病不同发病阶段均表现出一定的防治效果,其中喷施14d 后防治效果达61.83%。
菌株HHHB19可作为良好的生防菌备用资源。
关键词烟草赤星病;生防菌;分离鉴定;应用效果中图分类号S476+.1文献标识码A 文章编号1007-5739(2023)01-0071-04DOI :10.3969/j.issn.1007-5739.2022.01.018开放科学(资源服务)标识码(OSID ):Isolation and Identification of Biocontrol Bacteria of Tobacco Brown Spot DiseaseHAO Haohao 1LI Xiang 1ZHOU Quan 1LYU Haoqiu 1YU Liye 1SUN Huizhong 2(1Zhumadian Branch of Henan Provincial Tobacco Company,Zhumadian Henan 463000;2College of Agriculture,Henan University of Science and Technology,Luoyang Henan 471000)Abstract A total of 49strains of live pure cultures were isolated from tobacco rhizosphere soil with serious conti-nuous cropping obstacles,which were numbered from HHHB1to HHHB49,respectively,and the strains of HHHB7and HHHB19with antagonistic activity against Alternaria alternate were screened out.The diameters of bacteriostatic circles of the two strains were 5mm and 23mm,respectively.The two strains were preliminarily characterized as having biocontrol activity.The results of polyphasic identification showed that the most active strain (HHHB19)belonged to the genus of Pseudomonas ,and its temporary name was Pseudomonas sp.HHHB19.Pot experiment confirmed that the mixed treatment of HHHB19strain suspension foliar spray showed certain control effects against tobacco brown spot disease at different stages,and the control effect reached 61.83%after 14days.HHHB19strain can be used as a good reserve resource for biocontrol bacteria.Keywords tobacco brown spot disease;biocontrol bacterium;isolation and identification;application effect烟草赤星病生防菌的分离与鉴定郝浩浩1李翔1周权1吕浩秋1余立业1孙会忠2(1河南省烟草公司驻马店市公司,河南驻马店463000;2河南科技大学农学院,河南洛阳471000)从植物根际环境分离筛选功能微生物资源一直是生物资源开发的热点方向之一。
杨树烂皮病生防菌株X4筛选与鉴定
ｓｔｒａｉｎ Ｘ４ ｗａｓ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｐｌａｔｅ ｓｔａｎｄｏｆｆ ｍｅｔｈｏｄ ａｇａｉｎｓｔ Ｖａｌｓａ ｓｏｒｄｉｄａ Ｎｉｔ， ｗｉｔｈ ｉｔｓ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｒｅａｃｈｉｎｇ ８３．９６％．
［１６］
的方法分
离土壤样品中的芽孢杆菌；利用平板划线法分离纯
菌株 Ｘ４ 生防效果测定。 参照乔国彪等 ［２３］ 和宿
静瑶等 ［２４］ 的方法，利用烫伤接种法测定菌株在杨树
化出不同形态单菌落，冰箱 ４ ℃ 保存备用。
枝条上对杨树烂皮病的拮抗活性。 选取若干 ２ 年生
防菌筛选，以污黑腐皮壳菌为靶标菌，使用平板对峙
２％次氯酸钠浸泡 １０ ｍｉｎ，７５％酒精浸泡 １ ｍｉｎ，无菌
生防菌的筛选。 参考张宁等
［１７］
的方法进行生
法筛选出对靶标菌具有显著拮抗效果的细菌。 利用
下列公式计算抑菌率，筛选对杨树烂皮病菌具有拮
健康杨树枝条，截成 １０ ｃｍ 左右粗细相似的短枝，用
去离子水冲洗 ３ 次后晾干。 用石蜡将枝条两端封住
℃ 、１８０ ｒ·ｍｉｎ －１ 培养 ４８ ｈ 的 Ｘ４ 拮抗菌菌液装入喷
菌饼贴在伤口上，用无菌脱脂棉包裹并使用保鲜膜
封口，定时喷水保持无菌脱脂棉湿润。 本试验中的
阴性对照处理为不接种杨树烂皮病菌的枝条致伤后
喷施 ＬＢ 液体培养基，阳性对照除此之外枝条伤口
处还贴杨树烂皮病菌菌饼，将所有对照组和处理组
荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MF11对根结线虫病的防效评价
江苏农业学报(Jiangsu J.qfAgr.Sci.),2021,37(2)：326-332http：// 326周冬梅，何亮亮,李伟山，等.荧光假单胞菌(Pseudomonas Jluqrescens)MFH对根结线虫病的防效评价[J].江苏农业学报,2021, 37(2)：326-332.(loi：10.3969/j.issn.l000-4440.2021.02.007荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)MF11对根结线虫病的防效评价周冬梅1,何亮亮,李伟山⑴，冯辉1,赵敏1,纠敏3,魏利辉(1.江苏省农业科学院植物保护研究所，江苏南京210014； 2.南京农业大学植物保护学院，江苏南京210095； 3.河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳471023)摘要：在根结线虫危害严重的番茄田块采集健康植株的根际，从中分离并筛选对根结线虫病具有防治作用的生防菌株。
采用稀释分离法以及离体试验获得16株能显著杀灭南方根结线虫二龄线虫(J2)的菌株，其中菌株MF11对J2的致死率最高。
基于生理生化分析、gyrB和16S rRNA基因碱基序列比对，确定菌株MF11为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)o菌株MF11发酵液浸泡番茄幼苗24h后,J2在番茄根尖的聚集数量显著减少，侵入番茄根尖的虫量下降80.65%,表明菌株MF11可降低J2对番茄的侵染力。
温室试验结果表明，菌株MF11发酵液处理可以显著降低番茄植株86.53%根结数，以及70.2%的卵块数。
田间试验结果表明,菌株MF11发酵液处理降低了根结线虫病的病情指数，其平均防效达66.71%,与10%噻唑膦颗粒剂处理防效相当。
综上所述，菌株MF11不仅对根结线虫具有毒杀作用，还能降低根结线虫的侵染、发育和繁殖能力，从而有效防治作物根结线虫病。
关键词：南方根结线虫；生防菌；荧光假单胞菌；防治效果中图分类号：S432.4+5文献标识码：A文章编号：1000-4440(2021)02-0326-07 Evaluation of the control effect of Pseudomonas fluorescens MF11on diseases caused by Meloidogyne incognita in tomatoZHOU Dong-mei1,HE Liang-liang1，2,U Wei-shan1，3,FENG Hui1,ZHAO Min1,JIU Min3,WEI Li-hui1，2 (1.Institute of Plant Protection,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Nanjing210014,China； 2.College qf Plant Protection,Nanjing Agricultural University,Nanjing210095 ,China； 3.College of Food and Bioengineering,Henan University of Science and Technology,Luoyang471023,China) Abstract:Rhizosphere of healthy tomato plants in fields severely infected by root-knot nematode was collected to isolate and screen biocontrol strains with antagonistic effects on diseases caused by Meloidogyne incognita.16bacterial strains with significant nematocidal activity on the second-stage larvae(J2)of M.incognita were obtained by separation method of dilution and in vitro experiment.Among them,MF11strain showed the highest lethality rate to J2.The MF11strain was identified to be Pseudomonas fluorescens based on physiological,biochemical analysis and gene sequence alignment between gyrB and16S rRNA.The number of J2aggregated around the root tips of tomatoes decreased significantly24h after the tomatoseedlings immersed in the fermentation broth of MF11strain.收稿日期：2021-01-21基金项目：国家自然科学基金项目(31871943)；江苏省农业科技自主创新基金项目[CX(18)2005]作者简介:周冬梅(1985-)，女，江苏仪征人，博士，助理研究员，从事植物病原菌的致病机制和生防菌的作用机理研究。
人参内生真菌的分离鉴定及其生防功能的初步验证
第42卷第2期2021年5月Vol.42,No.2May,2021吉林师范大学学报(自然科学版)Journal of Jilin Normal University(Natural Science Edition)doi：10.16862/ki.issn1674-3873.2021.02.020人参内生真菌的分离鉴定及其生防功能的初步验证曹昆，高福泉，董佳伟，徐洪伟”（吉林师范大学吉林省植物资源科学与绿色生产重点实验室，吉林四平136000）摘要:人参主要产于中国的东北和朝鲜半岛，因为其具有极高的药用价值而被认为是草药中最重要的植物.内生真菌是一种有趣的微生物，它和植物形成互惠共利的联系.不同的内生真菌能够根据寄主及所处的生态环境的不同而产生不同的代谢物质.此外，内生真菌还能够促进宿主种子的萌发、茎的生长和诱导宿主耐受生物和非生物胁迫.本实验从7个地点进行采样,一共分离获得107株人参内生菌.对其中的29株内生菌进行ITS分子验证，比对后的结果表明主要的内生真菌是镰刀菌和木霉菌.另外还有冻土毛霉和艾米斯托克篮状菌.鉴于木霉菌的生防功能，平板对峙实验的结果表明，木霉菌能够抑制病原镰刀菌和韦状节抱霉的生长.这些实验结果表明人参拥有各种不同的内生真菌，这些内生真菌为新的生物活性的化合物的鉴定以及病原菌的生物防治提供了基础.关键词:人参；内生真菌;生防中图分类号:Q939文献标志码:A文章编号：1674-3873-（2021）02-0122450引言人参（Panax ginseng C.A.Meyer）属于五加科药用植物，具有两降三抗的药用功效，因其药用价值极高而为人们所推崇,也被人们称为中药之王•人参主要产于中国的东北地区和朝鲜半岛,并在中国的吉林省规模化种植［1］.人参的根腐病是造成人参减产和影响人参品质的最重要的因素之一，根腐病是土传病害，防治困难•常见的病原菌包括尖抱镰刀菌和腐皮镰刀菌•主要侵染人参的根茎部,初期表现不明显，中后期叶片逐渐萎蔫直至死亡［2］.植物内生真菌是一类在整个或大部分的生命周期中,都与植物生活在一起,并且不对植物产生病害的一类真菌［3］.实际上，大多数的植物体内都含有内生真菌，内生真菌可以大体上分为两大类:麦角菌科（C）和非麦角菌科（NC）内生真菌•前者是通过系统性种子传播的方式进行传播•后者还没有很好的分类,但大多数属于子囊菌门和担子菌门［3］.20世纪70年代植物内生菌在全世界范围内引起了科学家们的极大兴趣⑷，研究发现含有毒性生物碱和内生菌的植物对生物和非生物胁迫表现出抗性•例如在苇状羊茅植物体内发现麦角菌科的内生真菌，这种内生菌能够对取食苇状羊茅的牛产生毒性，从而对植物宿主起到保护作用⑷.M.Shoresh等［5］将暗适应条件下生长的拟南芥转移至强光环境下，植物的叶片由于强光带来的损伤而变成红色，但是接种哈茨木霉T22的植株没有受到类似的损伤.内生真菌在植物组织内部广泛存在，由于在其内部长期存在并与之共同进化，内生真菌和宿主形成了互利共生的关系•一些内生真菌能够协助宿主抵御病虫害，促进植物的生长和提高植物的抗逆性•人参作为中药之王,与之共生的内生真菌可能含有某些特殊的次生代谢物质，可用于医药领域的研究.病害是造成人参减产的重要因素,分离具有抗生作用的重要的内生菌，对于防治病害,也具有重要的意义.收稿日期：2021-02（3基金项目：中央引导地方科技资金项目（202002016JC）第一作者简介:曹昆（1982—）,男'吉林省延吉市人'讲师'博士•研究方向：植物分子生物学.通讯作者:徐洪伟（1964—）,男'吉林省公主岭市人'教授'博士'硕士生导师•研究方向：基因工程.第2期曹昆，等：人参內生真菌的分离鉴定及其生防功能的初步验证1232实验材料和方法2.1实验材料在7个地点(汪清县，棒槌园沟，海拔73m N43.19E130.28；抚松县池西区白溪林场，海拔885m N42.02E127.40；长白县十四道沟镇，海拔1191m N41.32E127.56；临江市四道沟镇岗头村，海拔817m N41.43E127.08；江源区正岔街道新开村，海拔627m N42.07E126.39；靖宇县龙泉镇侯家店村，海拔600m N42.25E126.38；靖宇县蒙江乡中华村，海拔585m N42.23E126.45)开展人参的采集工作，选取健康的人参植株•取材后立即低温保存,邮寄回实验室并开展工作•2.2人参的表面灭菌取人参的根和茎部位，用流水冲洗去掉表面的泥土•吸水纸去除表面的水.75%的乙醇消毒1min,无菌水冲洗3次，无菌滤纸将其表面的水分吸干.消毒液(V(次氯酸钠)：V(水)=1：8)浸泡处理15min,再用无菌水冲洗3次(最后一次冲洗的水用于涂平板做阴性对照)，无菌滤纸吸干水分•将根和茎切成1cm的小段平放在PDA培养基上培养•2.3人参内生真菌的分离纯化28弋培养3d,观察是否有菌落形成•有单菌落形成后，立即挑取到新的PDA培养基中进行纯化培养并保存菌种.2.4DNA的提取本实验采用SDS法提取真菌的基因组DNA,取0.2g菌丝液氮研磨成粉末，加入1mL裂解液(0.2mol/L Tris-HCL(pH8.0),50mmol/L EDTA,2%SDS,0.1mol/L NaCl),65T水浴30min,加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇，混匀并静置2min,10000g离心10min,取上清液加入到新的离心管中，加入等体积的氯仿再次抽提，混匀后静置2min,10000g离心10min.取上清液,加入等体积的异丙醇，混匀.室温放置10min,10000g离心10min，弃上清液.75%的乙醇洗涤沉淀,10000g离心5min,弃去乙 醇并用无菌风吹干,加入含RNA酶的水溶解沉淀获得所需的DNA.2.5ITS扩增和比对弓I物：ITS-1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')ITS-4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')对模板DNA进行扩增,反应条件为：预变性94T,5min；变性94T,30s,退火55T,30s,延伸72T,50s, 30个反应循环;延伸72T,10min.电泳并将扩增好的条带切下做胶回收，与T载体做酶联反应,转化,测序•将测序的结果与NCBI的数据库进行比对.2.6平板对峙实验在9cm的平板的两端，分别接种内生菌绿色木霉和病原菌燕麦镰刀菌以及韦状节抱霉，观察菌落生长情况.3实验结果3.1内生菌的分离我们将人参的根和茎段接种到PDA培养基上,3d后观察，外植体贴近培养基的一侧长出白色的菌丝•但是作为阴性对照，涂布有最后一次洗涤外植体的水的培养基，并没有长出菌落•说明外植体周围的菌丝为人参内生真菌•共分离获得107株内生菌•我们对其进行形态学初步观察后，选取29株内生菌做进一步的分子检测.3.2内生菌的分子鉴定我们将29株真菌的测序结果在NCBI网站上进行序列比对，结果发现它们从属的层次上可以划分为4类:镰刀菌属、篮状菌属、木霉菌属和毛霉(见图1).镰刀菌属的数量最多达到14株,木霉属的为13株.镰刀菌中包括：芳香镰抱菌(FusariurnredoZens)、尖抱镰刀菌(Fusariurnoxysporurn)和腐皮镰刀菌(FusariurnsoZani).蓝状菌属包括一种菌为艾米斯托克篮状菌(TaZaromycesamestoZkiae).木霉菌属包括4个菌种，分别为哈茨木霉(T ricAodermaAarzianum)、勾状木霉(TricAodermaAamatum)、绿色木霉124吉林师范大学学报（自然科学版）第 42 卷（Frichoderma. ©iride ）和康宁木霉（Frichodermaboningii ）.毛霉包括一种为冻土毛霉（MucorhiemaZis ）.另 外,还有两株内生真菌在数据库中没有注释.（A ）腐皮镰刀菌；（B ）绿色木霉；（C ）芳香镰抱菌；（D ）冻土毛霉；（E ）尖抱镰刀菌；（F ）哈茨木霉图1人参根和茎段分离得到的部分内生真菌Fig. 1 Partial endophytic fungi obtained from the isolation of ginseng root and stem3・3内生菌的生防功能向PDA 培养基上分别接种内生菌绿色木霉和燕麦镰刀菌以及韦状节抱霉，我们发现绿色木霉的生 长不受限制,而两种病原菌的生长速率明显放缓，特别是韦状节抱霉的生长明显受到抑制（见图2）.这 说明绿色木霉菌能够有效地抑制两种病原菌燕麦镰刀菌和韦状节抱霉的生长.(b )I傢色木畫韦状节砲劃.IK.丿严麦镰刀菌乞丫绿色木霍（A ）绿色木霉vs 燕麦镰刀菌；（B ）绿色木霉vs 韦状节抱菌图2平板对峙实验Fig. 2 Plate confrontation experiment4结果与讨论真菌在解决世界农业问题方面扮演着重要的角色.由于内生真菌长期存在于植物的组织中并与其 共同进化,因此一些内生真菌能够防治病虫害.例如印度梨形抱不仅能够增强宿主的抗病性，而且能够 提高宿主的生物量和对非生物胁迫的抗性⑶.本实验中，我们共分离获得107株菌株，根据菌落的形态 特征,对其中29株内生菌进行了 ITS 测序.并将结果进行了基因比对，可以把获得的菌种分为4个属: 镰刀菌属、篮状菌属、木霉菌属和毛霉.我们分离的菌株数量并不多,这一方面可能与吉林东部地区的气第2期曹昆，等：人参內生真菌的分离鉴定及其生防功能的初步验证125候条件有关，另一方面可能与我们对外植体的消毒的严谨度有关.镰刀菌因其产生的分生抱子形似镰刀而取名为镰刀菌,又因其分类中的很多菌种属于致病菌而恶名昭彰•镰刀菌的传播方式分为两种，即垂直传播和水平传播•前者是由母代到子代的传播，后者通过外源侵入寄主的方式进行传播•镰刀菌中的植物病原菌侵入植物维管或导管组织后,常导致植物根系出现腐烂、叶片萎蔫和促进植物疯长的现象[6].本文通过分子鉴定获得的29株菌中，有14株菌属于镰刀菌属，在种上划分为芳香镰抱菌、尖抱镰刀菌和腐皮镰刀菌•这样的实验结果似乎与内生菌的对植物的益生作用相悖,但上述菌种也不仅仅只包括一个种，也是复合种[7].而且并不是所有的镰刀菌都只能为植物带来病害，有些植物内生镰刀菌还可以成为生防菌，这些内生非致病菌通过竞争和生态位排斥的方式,对致病镰刀菌起到排斥作用•例如:铀ia等[8]分离获得3株内生木贼镰刀菌(Fusariumeguiseti)，单独施用时能显著地促进梨树的生长•和燕麦镰刀菌联合施用时，能显著地减少根部燕麦镰刀菌的定殖和根腐病的发生;N.Benhamou等[9]研究发现，植物内生菌尖抱镰刀菌Fo47通过抗菌和重寄生，以及诱导植物产生防御应答的方式,能够有效地对抗终极腐霉(PytAiumuZtimum)对黄瓜的致病危害;I.Iori等[10]试图从分子系统发育的角度来解析病原镰刀菌和非致病镰刀菌，但是二者的分子系统发育特征并没有明显的不同•镰刀菌的内生行为与它的生防菌的作用之间的关系也是研究的热点，同样值得从分子生物学的角度对其进行深入的挖掘.木霉属于丝状子囊真菌属，是土壤中一种很常见的微生物•在热带土壤中，每克土壤中含有10~ 103个抱子•本文通过分子鉴定的方法共分离获得13株木霉内生菌，包括哈茨木霉、勾状木霉、康宁木霉和绿色木霉•木霉定殖于单子叶或双子叶植物的根系上，根际中的木霉和次生代谢物质有利于植物的生长和对矿质元素的吸收.G.Harman等[11]研究发现，向豆科植物施加哈茨木霉T22,植物根系变得发达，产量增加到123%.D.L.Lindsey等[12]向无菌的番茄组培苗施加绿色木霉，植物的株高和鲜重分别增加28%和8%.在矿质元素吸收方面，哈茨木霉T22能够溶解磷酸岩、Fe3+、Cu2+、Mn"+and Zn0•此夕卜,它还能够产生可溶性代谢物用于还原Fe3+和Cu2+生成Fe(I)-Na2-邻菲咯啉二磺酸和Cu(I)-Na2-2, 9-二甲基-4,7-联苯-1,10-菲咯-线二磺酸[13].这种螯合和还原作用增加了植物对土壤中的营养元素的吸收,从营养学的角度也就解释了木霉对植物生长的促进作用•在抵御非生物胁迫方面，木霉菌表现同样出色•当培养基中的水势降低到-0.2~-0.3MPa时，种子的发芽率受到了显著影响•而施加哈茨木霉T22的种子在受到相同干旱胁迫条件下，仍然保持较高且均一的萌发率[14].此外，在生物胁迫方面，木霉通过霉菌寄生和激活宿主免疫应答的方式在植物抗病方面发挥着重要的作用.Harman研究发现：向植物喷施生防试剂哈茨木霉T22,能有效控制病原菌对叶面和果实侵害[11].在我们的研究中，平板对峙实验同样表明绿色木霉对镰刀菌有抑制的作用.和前面两种真菌相比，有关冻土毛霉在植物中的研究相对较少.A.H.Molla和H.I.Khan研究发现:冻土毛霉可用于污水处理,经冻土毛霉和哈茨木霉处理的污水，水质得到了明显的净化,83%~100%的金属离子被过滤去除•使用污水直接浸泡种子,萌发率最高为30%.而经过冻土毛霉和哈茨木霉净化后的污水，种子萌发率为100%[15].因此冻土毛霉有螯合金属离子的功效•D.B.Wietse等[16]研究发现，向植物的根部接种冻土毛霉BHB1和哈茨木霉PvdG2够改变根际周围的细菌群落结构•这些新增加的细菌一方面能够产生几丁质酶对抗病原菌,另一方面与病原菌竞争根系分泌物和空间，使病原菌处于“饥饿”的状态•因此冻土毛霉同样有对抗病原菌的功效.以上的实验结果表明：无论是我们分离得到的镰刀菌，还是木霉或冻土毛霉都有潜力成为人参的生防菌,为人参的抗病研究做有益的探索.参考文献[1]YLN T K.Brief introduction of Panax ginseng C.A.Meyer[J].J Korean Med Sci,2001,I6：S3-5.[2]ZHENG Y K,MIAO C P,CHEN H H,et al.Endophytic fungi harbored in Panax notoginseng:Diversity and potential as biological control agentsagainst host plant pathogens of root-rot disease[J].J Ginseng Res,2017,4I(3)：353-360.[3]RODRIGLEZ R J,JR J F W,ARNOLD A E,et al.Fungal endophytes:Diversity and functional roles[J].New Phytol, 2009,182(2)：3I4-330.[4]LI X Z,SONG M L,YAO X,et al.The effect of seed-borne fungi and EpicAZo endophyte on seed germination and biomass of Elymus sibiricus[J].Front Microbiol,20I7,8：2488-2496.126吉林师范大学学报（自然科学版）第42卷[5]SHORESH M,HARMAN G E,MASTOURI F.Induced systemic resistance and plant responses to fungal biocontrol agents[J].Annu RevPhytopathol,2010,48(1)：21-43.[6]谢安娜，徐浩飞，张志林，等•致病镰刀菌的研究进展[J].湖北工程学院学报,2020,40(6)：3741.[7]BAAYEN R P,O'DONNELL K,BONANTS P J,et al.Gene genealogies and AFLP analyses in the Fusarium oxysporum complex identifymonophyletic and nonmonophyletic formae speciales causing wilt and rot disease[J].Phytopathology,2000,90(8)：891-900.[8]首I^I A,BAANOVI J,FINCKH M R.Endophytic Fusarium eguiseti stimulates plant growth and reduces root rot disease of pea(Pisum sativumL.)caused by Fusarium avenaceum and PeyroneZZaea pinodeZZa[J].Eur J Plant 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the most precious plant among herbs.Endophytic fungus is an interesting microorganism,and it forms a mutually beneficial relationship with plants.Many endophytes brought benefits to their host plants.Due to the different host and the ecological environment in which they depended,various endophytes can produce different metabolites.In addition,endophytes can benefit their host in different ways, such as promoting germination and boosting their growth,inducing host plants to tolerate biotic or abiotic stress.In this experiment,samples were taken from7locations and a total of107strains of ginseng endophytes were isolated.Fusarium and Frichoderma were idetified as dominant endophytic fungi based on morphological traits and ITS sequences from29strains of endophytes.In addition to these two kinds of fungi,the ITS sequence alignment also revealed that MucorhiemaZis and Falaromycesamestolkiae exist in our interested fungus.Plate confrontation experiment shows that Frichoderma.viride can inhibit the growth of Fusarium avenaceum and Arthrobacter reedi/ormis.The results suggested that ginseng harbors diversified endophytic fungi that would provide a basis for the identification of new bioactive compounds,and for effective biocontrol of ginseng root rot.Key words：ginseng；endophytic fungi；biological control（责任编辑：林险峰）。
生防菌的分离.
药物传导实验
① 供试作物：番茄（品种：早丰） ② 步骤：将标记的Ｂ-51菌悬液用涂抹法接于番茄最
上端叶片，按不同时间不同部位取样，经升汞表 面消毒后用NYDA药板分离，统计分离结果。 （接种部位和分离部位示意图)
将催芽至2cm于两个无菌培养皿中一皿倒入于两个无菌培养皿中一皿倒入10ml一皿倒入一皿倒入10ml10ml无菌水作对照轻摇混匀静置无菌水作对照轻摇混匀静置10分崐钟后分别选萌发一致的种芽等距离播于无分崐钟后分别选萌发一致的种芽等距离播于无菌生长容器的网架上每瓶播菌生长容器的网架上每瓶播17置温度置温度2828光暗各光暗各1212小时的光照培养箱中培小时的光照培养箱中培养待苗子长出3对真叶时养待苗子长出3对真叶时66周0116小时
③ 分离方法：
A:分部位压印分离：按无菌操作条件，分别剪取处 理和对照地上部苗和地上部分别剪取３对真叶和 茎段，一对真叶分正反两面(一片取正面，一片取 反面)，放在培养基平板上，盖一层无菌滤纸， 用 镊子轻压使样品与崐培养基紧密接触，然后取出 滤纸和样品，置30℃温箱培养48h观察。
B:表面消毒后分离：分别选取不同茎段、叶片，剪 成小块(约2mm)，•接崐常规无菌操作于NYDA培 养基上分离，置于30℃温箱培养48h检测供试菌分 布。
对番茄早疫病的防效
① 供试菌株浓度分别为 1×10標拝6个/ｍｌ。② 供试化学农 药：70％甲基托布津ＷＰ800×液，杀毒矾Ｍ８ 400×液。 ③ 供试番茄品种：利春。④试验地点：咸阳市秦都区沣西 乡伍家堡。生态环境为塑料大棚（总面积约300平方米）。 ⑤ 试验小区设计：各供试药剂及空白对照各自为一个处理， 共９个处理，重复三次，小区面积为5×0.7米，按随机区 组排列。⑥ 田间喷雾及病情调查：在4月8日（现蕾期）和 4月19•日（开花期）两崐次喷雾，每次均在傍晚进行，空 白对照喷清水；喷药前调查一次发病基数，每次喷药以后， 大致在第五、十、十五天以小叶为单位调查发病情况，分 别崐记载病叶数和严重度。
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b 9ml灭菌水＋ 1ml土壤悬浮 液，充分混匀，即1/100浓度。
c 依次配制，1/1000浓度。 d 同上，即1/10000浓度。 e 同上，即1/100000浓度。
在稀释时，可在盛有无菌水 的试管中加入1滴100g/L的石炭 酸溶液，用以抑制细菌生长。
细菌 真菌 数量 数量
放线菌/总菌落数
3. 每克土样中的菌落数的计算（间接法）
每克土样中的菌落数＝（每皿菌落平均数×稀释倍数）/干土的百分数 注：干土的百分数即土壤干重％，本次实验烘干土样的百分数按100% 计。
*认真填写每次实验报告，完成实验记录、计算、绘图等，实 验报告成绩占30%
实验结果的观察与记录方法
已融化好的高氏一号培养基中加入K2Cr7O4溶 液(每300ml加入100ppm 1ml)调至pH 7.2～7.4，待 温度降至40℃时倒皿，皿/40毫升培养基。
其它分离培养基
玉米粉琼脂、黄豆粉琼脂、Waksman 、Bennett 培养基均用 于分离放线菌。
几丁质培养基是分离放线菌的最有用的培养基之一，只有放 线菌够利用几丁质，所分离的放线菌菌落较小，呈白色， 再转接到适于产生可溶性色素的适当培养基上来加以区 别。
青霉菌落
乳酸菌Lactobacillus
Bordetella pertussis
芽孢杆菌的分离鉴定和活性测定
1．生长适温测定 将供试枯草芽孢杆菌单胞菌系接于牛肉膏蛋白胨
培养液中(pH7.2)，置于25℃，30℃，35℃，40℃ 四个温度等级下培养，每日用血球计数崐板检测 菌液的浓度。 2．适宜碳源测定 ① 培养基的制作：在无葡萄糖的营养洋菜中分别加 入可溶性淀粉、葡萄糖、麦芽糖、木糖、果糖、 蔗糖、甘露醇和桔粉(由广州糖果厂生产)，浓度为 2％(W/V)，灭菌备用。 ② 培养测定：将供试单胞菌分别接于上述各培养基 平板上，30℃下恒温培养72h后，测定菌落直径。
细菌 连片 连片
42 连片
25 19 连片
6%酵母膏+0.05%SDS CK1
5 10 0(CK2) 5 10
67
16
72
13
8
连片
21 连片
29
45
真菌 连片
2 0 8 1 0 连片
0 0 连片
2 1
2. 培养基与平板的制作：
高氏1号培养基： 改良高氏无机一号琼脂培养基：
淀粉 20g
淀粉 20g
HV 培养基是以土壤腐殖质为唯一的碳源和氮源的培养基， 只有放线菌能利用腐殖质，所以它能够选择性分离包括 稀有放线菌在内的多种放线菌。但是，HV 培养基的颜 色较深，而且此培养基上长出的放线菌菌落一般比较小， 不易辨认和挑菌。
3. 接种方法：
（1） 稀释平板法 A. 土壤悬浮液制备： a 称取研细的土样1g,倒入试管
算浓度，用无水配成不同浓度梯度的药液，加到NYDA培 养基中，配制成合乎设计浓度要求的含药平板，然后按逐 级梯度筛选法，从低浓度到高浓度逐级锻炼培养，直至获 得抗适宜利福平浓度的标记菌株。
药物传导实验
① 供试作物：番茄（品种：早丰） ② 步骤：将标记的Ｂ-51菌悬液用涂抹法接于番茄最
上端叶片，按不同时间不同部位取样，经升汞表 面消毒后用NYDA药板分离，统计分离结果。 （接种部位和分离部位示意图)
（4）拮抗菌株的筛选（体外平板初筛） 涂抹法或混菌法接种
（5）发酵培养
（5）化合物鉴定 农抗的下游加工工艺
（6）提取总化合物
（7）化合物分离 （5）盆栽试验（抗菌谱） 作用机理
理化性质 生物学性质
四、实验操作
1.土样准备：
采集土样应该尽快进行土样预处理与分离工作，放置时间过 长会影响分菌的准确性。
不同浓度对放线菌分离的影响
放线菌的菌落特征 A：诺尔斯氏链霉菌 C：酒红指孢囊菌 E：小单胞菌
B：皮疽诺卡氏菌 D：游动放线菌 F：皱双孢马杜拉放线菌
细菌
假单胞菌PseudomonaEsnterobacter cloacae aeruginosa
葡萄球菌Staphylococcus 链球菌Streptococcus sobrinus 葡萄球菌Staphylococcus 螺原体Spirillum Borrelia burgdorferi
Ca(NO3)2 0.938 (NH4)2SO4 0.0924 KH2PO4 0.313 MgSO4.7H2O 0.567 FeSO4.7H2O 5.5mg H3BO3 0.57mg MnSO4.4H2O 0.57mg ZnSO4.7H2O 0.57mg 〔可用EDTA-Fe代替FeSO4〕
实验操作步骤
2. 用品与仪器：三角瓶、刻度试管、灭菌水、称
量纸、玻璃吸管、电子天平、超净工作台、微波炉。
3. 培养基：
（1）高氏一号：培养放线菌。 （2）PDA：分离真菌; （3）KB：培养细菌。
生防微生物的筛选程序
（1）样品的采集
（2）生防菌的分离（分离培养基）
原始菌种保存
（3）纯化与培养 （单菌落稀释后划线、单孢分离纯化）
杂菌抑制剂：多菌灵(1×10-3 g/l)、放线菌酮 (5×10-6 g/l)、制霉素(4×10-6 g/l) 、重铬酸钾(5×10-6 g/l)。
土样预处理的分菌效果
处理 预处理剂
6%酵母膏
0.05%SDS
风干(d) 0 5 10 0 5 10 0
放线菌 27 78 76 30 69 65 28
B. 接种方法： d或e土壤溶液，每皿加入20～30µl，用吸管吸
0.1ml(2滴)，取用无菌三角玻璃棒涂抹接种。
（2） 弹土法 每皿弹入约0.2毫克土壤样品粉末。
4. 培养：
放线菌28℃培养7-14 天 细菌3－5天 真菌5－7天 观察、调查菌落数、计数。
5．放线菌计数方法
采用平板菌落计数方法。
芽胞杆菌Bacillus subtilis 大肠杆菌Escherichia coli 棒状杆菌Corynebacterium
乳酸菌Lactobacillus
Bordetella pertussis
单细胞真菌形态
酵母菌出芽繁殖
新生隐球菌
酵母型菌落 C. albicans菌落 曲霉属
(类酵母型)
放线菌的分离计数用培养基（淀粉铵盐培养基）：
可溶性淀粉 10g, (NH4)2SO4 2g, K2HPO4 1g , MgSO4·7H2O 0.5g, KCl 0.5g, FeSO4·7H2O 0.01g , 琼脂 18g, 水 1000ml , pH7.6～7.8。
实验方法
<1>熔化培养基倒皿，每皿12ml左右。设三个皿为 对照(CK)，每个土样处理3个皿。培养基冷凝后， 放入80℃的烘箱中，除去表面的冷凝水，一般烘 10～15分钟。
田间防治效果测定
对柑桔炭疽病的防效 ① 药剂品种：广谱增产菌（北农大生防室）；高脂
膜（沙城）；70％甲基托布津可湿性粉剂（日 本）；Bacillus sp.菌悬液；Trichoderma sp.•菌悬液。 ②方法：对桔园新生春叶进行不同药剂处理，喷药 后对•Bacillus •和 Trichoderma套塑料袋保湿24小时， 每处理４个重复。喷药三天后统一接种炭疽菌 （浓度1.2×106个孢子/ml）。同时设立两个对照， ＣＫ1仅接炭疽菌而不任何药剂，ＣＫ2是仅喷水， 作原始校正。11Ｄ后采叶片保湿培养，5Ｄ后统计 病叶率及防效。
K2HPO4 0.5g K2HPO4 0.5g
NaCl 0.5g
NaCl 0.5g
KNO3 1g
KNO3 1g
MgSO4 0.5g
MgSO4·7H2O 0.5g
FeSO4 0.01g 琼脂 10g 水1000ml。
FeSO4·7H2 O 0.01g 琼脂 18-20g 水 1000ml，pH 7.2～7.4。
土样25℃恒温箱中干燥3天，干燥后的土样与 CaCO3 10:1混 合，26℃下保温4天。
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土壤预处理方法: 为了提高土壤中放线菌的分离效率，采集的 土样应立即于28℃风干10d，用6%酵母膏和0.05%SDS（5mmol/L 磷酸缓冲液配置）对其悬浮液进行预处理，再采用接种至添加重 铬酸钾（250mg/L）的培养基中分离放线菌，加入抗真菌试剂和 抗细菌抗生素抑制细菌和真菌的生长增加放线菌的分出率。
对番茄早疫病的防效
① 供试菌株浓度分别为 1×10標拝6个/ｍｌ。② 供试化学农 药：70％甲基托布津ＷＰ800×液，杀毒矾Ｍ８ 400×液。 ③ 供试番茄品种：利春。④试验地点：咸阳市秦都区沣西 乡伍家堡。生态环境为塑料大棚（总面积约300平方米）。 ⑤ 试验小区设计：各供试药剂及空白对照各自为一个处理， 共９个处理，重复三次，小区面积为5×0.7米，按随机区 组排列。⑥ 田间喷雾及病情调查：在4月8日（现蕾期）和 4月19•日（开花期）两崐次喷雾，每次均在傍晚进行，空 白对照喷清水；喷药前调查一次发病基数，每次喷药以后， 大致在第五、十、十五天以小叶为单位调查发病情况，分 别崐记载病叶数和严重度。
4．定植、转移的研究 无菌条件下的定植、转移(无菌液培法) 供试作物：辣椒 (8819线辣子) 供试菌：Ｂ4-110，Ｂ-54两个菌系 生长容器：标本瓶(210×300mm) [产地：武汉] 瓶内放一特制网架(直径16.5cm，高8cm)，瓶口用
5cm厚的脱脂棉和一层纱窗网封严。(15磅下蒸气 灭菌20分钟，备用。) 培养液成分：Shive和Robbins营养液Ⅰ(1942) g／l
自然条件下的传导实验
生防菌的标记实验
① 抗生素：利福平（有效成份甲哌力复霉素：150mg/片；陕 西省医药工业研究所制造）