烟草青枯病菌生防菌的筛选和鉴定

烟草青枯病菌生防菌的筛选和鉴定
作者：毕涛刘群王晓强李向东陈晓红温亮苏建东杨举田
来源：《山东农业科学》2014年第11期
摘要：采用纸碟片法筛选到4株对烟草青枯病菌（Ralstonia solanacearum）有抑菌作用的生防菌C2c、C1a、Tsb和Ch1b，抑菌圈直径分别为51.50、25.95、24.40 mm和20.05 mm。

通过16S rDNA序列分析，C2c、C1a和Tsb为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa），Ch1b 为成团泛菌（Pantoea agglomerans）。

这4株生防菌对烟草赤星病菌（Alternaria alternate）、烟草根黑腐病菌（Thielaviopsis basicola）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、苹果霉心病菌（Trichothecium roseum）等病原真菌也有较好的抑制作用。

关键词：烟草青枯病菌；生防菌；纸碟片法
中图分类号：S435.72+S476 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）11-0068-04
由青枯劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的青枯病是烟草上最具毁灭性的细菌性病害，已经成为我国烟叶生产的主要制约因素。

烟草青枯病的生物防治越来越引起重视。

孔凡明等（1999）[1]认为生防菌可以减轻发病程度，在接种青枯菌前喷施生防菌防病效果更好。

罗宽等（2002）[2]筛选到3株青枯菌拮抗菌，并通过大田试验验证其防效。

尹华群等（2004）[3]筛选到1株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）及2株短芽孢杆菌（Bacillus brevis）。

张伏军等（2007）[4]、胡军华等（2009）[5]分离到1株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），盆栽试验表明，先施用生防菌菌液或活性物质的防治效果要高于农用链霉素，后施菌液或活性物质也有一定的防治效果。

段燕平等（2012）[6]分离得到1株枯草芽孢杆菌（B. subtilis），防治效果达66.70%。

本研究希望筛选更多的生防菌，鉴定其种属地位并测定其抑菌谱，为烟草青枯病的生物防治提供理论指导。

1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 供试病菌烟草青枯病菌、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、苹果霉心病菌（Trichothecium roseum）、玉米弯孢霉叶斑病菌（Curvularia lunata）和玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）由本实验室分离保存；白地霉（Geotrichum candidum）由密西西比州立大学吕士恩老师提供；烟草赤星病菌（Alternaria alternate）、烟草根黑腐病菌（Thielaviopsis basicola）和苹果炭疽病菌（Gleosporium fructigenum）由山东农业大学张广民老师提供。

1.1.2 菌株、载体和生化试剂大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α菌株由本实验室保存。

克隆载体pMD18-T购自TaKaRa公司。

细菌全基因组DNA提取试剂盒购自天根公司。

PCR产物回收试剂盒、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、dNTPs、DNA Marker（Trans 2K Plus，Trans 15K Plus）等购自全式金公司。

其它生化试剂及普通化学试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 试验方法
1.2.1 烟草青枯病菌生防菌筛选将灭菌的150 mL NA 固体培养基加热溶化完全，冷却至55℃左右，倒入直径为90 mm的培养皿内，每皿15 mL，凝固后备用。

根据袁从阳（2010）[7]的方法筛选生防菌株。

采集小麦和烟草根际土壤，制备菌悬液，
均匀涂布在NA培养基平板上，28℃培养24 h。

将孢子浓度为1.0×105个/mL的白地霉（Geotrichum candidum）孢子悬液均匀喷布在长出细菌菌落的NA平板上，28℃培养24 h。

选取周围出现明显抑菌圈的菌落，划线法纯化生防菌株。

采用纸碟片法验证生防菌株对烟草青枯病菌的生防活性。

在NA培养基平板中央放置直径为7 mm的无菌纸碟片，用微量移液器在纸碟片上滴加浓度为1.0×108 cfu/mL的生防菌菌悬液10 μL，以无菌水为对照，待培养基充分吸收后，倒置于28℃恒温培养箱24 h。

将平板转移至通风橱，用浓度为1.0×108 cfu/mL的烟草青枯病菌菌悬液均匀喷洒在平板表面，使雾化菌悬液自然散落于药剂平板上。

待平板充分吸收菌悬液后封口，倒置于28℃恒温培养箱内培养，分别在24、48 h后检查抑菌效果，十字交叉法测量抑菌圈直径，记录抑菌圈透明度，筛选抑菌
效果突出的生防菌株。

试验重复3次，每个菌株每次3个培养皿。

1.2.2 生防菌16S rDNA序列测定和分析利用天根细菌全基因组DNA提取试剂盒提取对烟草青枯病菌有明显抑制作用的生防菌株的全基因组DNA。

利用引物16S-8-F（5′-CAC GGA TCC AGA GTT TGA TYM TGG CTC AG-3′）和16S-1510-R（5′-CCG GGT TTC CCC ATT CGG-3′）扩增菌株的16S rDNA基因。

扩增体系为：10× PCR Buffer 2.5 μL，dNTP （2.5 mmol/ L）1.0 μL，16S-8-F （10 moL/L）1.0 μL，16S-1510-R （10 moL/L）1.0 μL，模板DNA 1.0
μL，Taq DNA 聚合酶0.125 μL，加ddH2O至终体积25.0 μL。

以ddH2O替代模板的体系作为阴性对照。

扩增程序为94℃ 3 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 1 min 50 s，30个循环；72℃10 min。

反应结束后，将PCR 产物置于0.8% 琼脂糖凝胶进行电泳分析，然后在凝胶成像仪中观察并记录结果。

切胶回收目的片段，连接到pMD18-T载体，转化大肠杆菌，提取重组质粒，送测序公司测序。

将序列在NCBI上BLAST，并将其与GenBank序列比对并构建系统发育树。

1.2.3 生防菌对病原真菌的抑菌作用将灭菌的150 mL PDA 固体培养基加热溶化完全，冷却至55℃左右，倒入培养皿内，每皿15 mL，凝固后备用。

采用纸碟法，在预先准备的直径为90 mm的PDA平板上均匀对称放置直径为7 mm的纸碟片，在纸碟片上滴加浓度为1.0×108 cfu/mL的生防菌菌悬液10 μL，待培养基将生防菌充分
吸收后，倒置于28℃培养箱培养24 h，将平板转移到通风橱内喷施浓度1.0×105个/mL供试病原真菌（见表1）孢子悬浮液，密封并将其转移到28℃恒温培养箱培养，7 d后十字交叉法测量抑菌圈直径。

以不加生防菌液的纸碟为对照。

每菌株重复3皿。

2 结果与分析
2.1 烟草青枯病菌生防菌筛选
通过初筛，从100多个样品中得到24株有拮抗作用的菌株，利用纸碟法筛选到4株对烟草青枯病菌有良好抑制作用的拮抗菌株。

接种烟草青枯病菌24 h后，生防菌株C2c的抑菌圈直径达到51.50 mm，抑菌圈半透明； C1a、Tsb和Ch1b抑菌圈直径分别为25.95、24.40 mm 和20.05 mm，抑菌圈透明。

接种烟草青枯病菌48 h后，生防菌株Tsb和C1a对青枯菌的抑菌圈直径没有变化，但透明度变为半透明；生防菌株C2c和Ch1b的抑菌圈大小和透明度都没有变化。

2.2 生防菌16S rDNA序列测定和分析
通过PCR，扩增到C2c、C1a、Tsb和Ch1b的16S rDNA目的片段，大小约为1 500 bp。

测序后发现：C2c、C1a和Tsb的16S rDNA序列为1 517 nt，BLAST结果显示，其与多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）16S rDNA序列一致率最高；Ch1b的16S rDNA序列为1 504 nt，与成团泛菌（Pantoea agglomerans）序列一致率最高。

从系统发育树上可以发现，生防菌C2c、C1a和Tsb 与多粘类芽孢杆菌（P. polymyxa）聚类到一支（图1），Ch1b与成团泛菌（P. agglomerans）聚类到一支（图2）。

2.3 生防菌对病原真菌的抑菌作用
Tsb对玉米小斑病菌和玉米弯孢霉病菌抑菌效果最好，抑菌圈直径分别为33.70 mm和30.05 mm，对烟草赤星病菌和烟草根黑腐病菌也有很好的抑菌效果，抑菌圈直径分别为29.40 mm和27.50 mm；C1a对玉米弯孢霉病菌抑菌效果最好，抑菌圈直径为32.75 mm，其次为烟草根黑腐病菌和烟草赤星病菌，抑菌圈直径分别为28.05 mm和27.75 mm；C2c对玉米弯孢霉病菌的抑菌圈直径为30.05 mm，对烟草根黑腐病菌和烟草赤星病菌的抑菌圈直径分别达28.40 mm和24.75 mm，另外，其对苹果霉心病菌和玉米小斑病菌也有很好的抑菌效果；Ch1b 对玉米弯孢霉病菌抑菌效果最好，抑菌圈直径为24.00 mm，对其他病原菌有一定的抑菌效果，对烟草赤星病菌和烟草根黑腐病菌的抑菌圈直径分别为16.40 mm和12.00 mm。

3 讨论
多粘类芽孢杆菌（P. polymyxa）在多种作物上有促生及抑菌抗病作用，我国农业部已将多粘类芽孢杆菌属（Paenibacillus）列为免做安全鉴定的一级菌种[8]。

Egamberdiyeva（2007）[9]证实多粘类芽孢杆菌（P. polymyxa）可促进玉米对氮、磷、钾等营养物质的吸收从而起到促生作用。

已有报道称，多粘类芽孢杆菌（P. polymyxa）对包括黄瓜枯萎病和番茄枯萎病[10]、油
菜腐烂病[11]和番茄青枯病[12]在内的多种病害有防治作用。

本研究从小麦和烟草根际土壤中
分离到3株多粘类芽孢杆菌（P. polymyxa），室内试验证明其对烟草青枯病菌（R. solanacearum）有很好的抑制作用，对包括烟草赤星病菌（A. alternate）、苹果霉心病菌（T. roseum）和棉花枯萎病菌（F. oxysporum）在内的多种病原真菌都有很好的抑制作用。

沈德龙等（2000）[13]鉴定1株对水稻有很好促生效果的水稻内生优势菌为成团泛菌（P. agglomerans）。

洪永聪等（2001）[14]从稻谷上分离得到2株水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae）拮抗菌，1株成团泛菌（P. agglomerans）和1株分散泛菌（Pantoea dispersa）。

薛梦
林（2006）[15]筛选到1株冬枣采后病菌细交链格孢（Alternaria alternata）的拮抗菌，鉴定为
成团泛菌（P. agglomerans），它可明显降低枣果采后发病率，且与药剂扑海因混用后，防病
效果更好。

本研究首次报道了成团泛菌（P. agglomerans）对烟草青枯病菌（R. solanacearum）的抑菌作用。

参考文献：
[1] 孔凡明，丁云水，周茂宏，等. 烟草青枯病颉颃细菌的筛选及其防病效果研究[J]. 中
国烟草学报， 1999， 5（4）：16-19.
[2] 罗宽，何昆，匡传富，等. 三株拮抗细菌对烟青枯病的抑制效果[J]. 中国生物防治，2002， 18（4）：185-187.
[3] 尹华群，易有金，罗宽，等. 烟草青枯病内生拮抗细菌的鉴定及小区防效的初步测定[J]. 中国生物防治， 2004， 20（3）：219-220.
[4] 张伏军，林立鹏，唐婧，等. 一株烟草青枯菌拮抗细菌的筛选及鉴定[J]. 西南大学学报：自然科学版， 2007， 29（9）：91-94.
[5] 胡军华，张伏军，蓝希钳，等. 烟草根际细菌铜绿假单胞菌 swu31-2 的定殖能力及其对烟草青枯病的防治作用[J]. 植物保护， 2009， 35（5）：89-94.
[6] 段燕平，杨金广，杨继洪，等. 抗烟草青枯病菌的枯草芽孢杆菌 SH7 的筛选与鉴定[J]. 吉林农业大学学报， 2012， 34（1）：52-57.
[7] 袁从阳. 利用植物根际促生菌防治烟草花叶病毒[D]. 泰安：山东农业大学， 2010.
[8] 杨少波，刘训理. 多粘类芽孢杆菌及其产生的生物活性物质研究进展[J]. 微生物学通报， 2008， 35 （10）：1621-1625.
[9] Egamberdiyeva D. The effect of plant growth promoting bacteria on growth and nutrient uptake of maize in two different soils[J]. Applied Soil Ecology， 2007， 36 （2）：184-189.
[10] 陈雪丽，王光华，金剑，等. 多粘类芽孢杆菌 BRF-1 和枯草芽孢杆菌 BRF-2 对黄瓜和番茄枯萎病的防治效果[J]. 中国生态农业学报， 2008， 16 （2）：446-450.
[11] Landa B B， Navas-Cortés J A， Hervás A，et al. Influence of temperature and inoculum density of Fusarium oxysporum f. sp. ciceris on suppression of Fusarium wilt of chickpea by rhizosphere bacteria[J]. Phytopathology， 2001， 91 （8）：807-816.
[12] 徐玲，王伟，魏鸿刚，等. 多粘类芽孢杆菌 HY96-2 对番茄青枯病的防治作用[J]. 中国生物防治， 2006， 22 （3）：216-220.
[13] 沈德龙，东秀珠. 水稻内生优势菌——成团肠杆菌的鉴定及其系统发育学分析[J]. 自然科学进展：国家重点实验室通讯， 2000， 10 （10）：949-952.
[14] 洪永聪，陈庆河. 从稻谷上分离、筛选用于拮抗水稻白叶枯病的泛菌[J]. 福建农业科技， 2001（4）：1-3.
[15] 薛梦林. 拮抗菌对冬枣采后病害的生物防治 [D]. 杨凌：西北农林科技大学， 2006.。