《化学分析方法验证》PPT课件

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含量测定方法验证的可接受标准
准确度 各浓度下的平均回收率应在98.0%-102.0%之间，9个回收率
数据的相对标准差（RSD）应不大于2.0%。 中药一般应满足以下规定：回收率计算值在95%-105%范围，
相对标准偏差（RSD%）薄层扫描法<5%
精密度 1.重复性：6份供试液含量的相对标准差应不大于2.0% 2.中间精密度：相对标准差应不大于2.0%
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方法在验证
在某些情况下，如原料药合成工艺的改变，制 剂处方改变，分析方法发生改变等，均有必要 对分析方法再次进行全面或部分指标的验证， 以保证分析方法可靠，这一过程称为方法在验 证。
在验证原则：根据改变的程度进行相应的 在验证。
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方法在验证
当合成工艺发生改变时 当制剂的处方组成改变，辅料变更时 当原料产地来源发生变更时 当质量标准中某一项目分析方法发生改变时。
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专属性
含量测定和杂志测定
色谱法和其他方法：附带表性图谱说明专属性 表明各组分的位置，分离度是否符合要求
杂质或辅料可获得的情况下，试样中可加入杂志或辅料，考察测 试结果是否受干扰
对于杂质测定也可相试样中加入一定量的杂质，考察杂质间是否 得到分离
色谱峰纯度试验（二极管阵列，其他检测器，质 谱）
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范围
范围是指达到一定精密度，准确度和线性条件下，测 试方法是用的高，低限量浓度或量的区间。
范围应根据分析方法的具体应用和线性，准确度，精 密度结果和要求确定。
原料药和制剂含量测定范围为80%-120% 制剂含量均匀度范围为70%-130% 杂质测定应为被测杂质限度的-20%到+20% 溶出度应为测定范围的-20%到+20%，释放度因规定
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需要验证的检测项目
2.杂质检查 主要用于控制住成分以外的杂质，如有机杂
质，无机杂质。 限度检查 定量检查
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需要验证的检测项目
限度检查 各种无机离子检查等
定量检查 定量测定： 干燥失重，水分，有关物质， 残留溶剂及其他特定检测项目 等。
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需要验证的检测项目
3.含量测定 除主成分外，也包括检查项下的防腐剂，溶
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专属性
通常是通过分析含有加了杂质，降解产物，有 关化学物质或安慰剂成分的样品，将所获的分 析结果与未加前述成分之样品的测试结果进行 比较，两组测试结果只差即为专属性。
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专属性
鉴别反应 应能与可能共存的物质或结构相似化合物区别 不含被分析的样品，以及结构相似或组分 中的有关化合物均应呈负反应
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存在问题
主要表现在： 方法设计不科学 方法没有充分的研究，优化 验证的目的性不明确，验证不充分 实验过程不规范，验证通不过的处理方法错误 验证数据不合理 忽视方法在验证
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什么时候分析方法需验证
符合下列情形之一的，应对检验方法进行验证： 1.建立或采用新的检验方法
2.分析对象或检验方法变更了
了限度范围，应为下限的-20%到上线的+20%，例如 缓释片1h<20%，7h>70%，则验证范围定为0-90%
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耐用性
耐用性又称粗放度，是指测试条件稍有变动时，结果 不受影响的承受程度。失衡连试验室和工作人员之间 的正常情况下试验结果重现性的尺度，如方法易受分 析条件的影响，或要求苛刻，应注明
出度等的含量测定等。
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验证内容
准确度 精密度（重复性，中检精密度和重现性） 专属性 检测线（LOD） 定量限（LOQ） 线性 范围 耐用性
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准确度
定量方法
测定的结果与真实值或参考值接近的程度，用回收
率%表示。
原料药
已知纯度的对照品或供试品
已知准确度的另一种方法比较
制剂
信噪比法
用于能显示基线噪音的分析方法（仪器分析方法），是把已知低浓 度试样测出的信号与空白样品的信号进行比较，算出能被可靠的检测出 的最低浓度或量，一般以信噪比3：1或2：1时的相应浓度或注入仪器的 量确定检测
标准差法
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定量限
被测定物质能被定量测定的最低量，结果仍具 有一定准确度和精密度的要求。
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含量测定方法验证的可接受标准
专属性 空白对照应无干扰，主成分与各有关物质
应能完全分离，分离度不得小于2.0 检测限
定量限
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含量测定方法验证的可接受标准
线性
回归线的相关系数（R）不得小于0.998，Y轴 截距应在100%响应值的2%以内，响应因子的 相对标准差应不大于2.0%。
耐用性
化学分析方法验证
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化学分许方法验证成功的前提
能够研究建立一个有水准的分析方法的能力
有化学分析方法验证的知识和水平
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化学分许方法验证成功的前提
有水平，经过培训的实施人员 仪器性能已经得到确认（校准，验证，校准在
有效期内） 可靠的对照品（法定机构提供的或有水平自己
建立的） 质量可靠的实验试剂
3.采用中国药典未收载的检验方法
4.法规规定的其他需要验证的检验方法
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什么时候分析方法需验证（续）
对不需要进行验证的的检验方法，应进行方法 确认，以保证检验数据准确可靠。
2005版药典中分析方法验证指导原则（附录 XIX A）只规定了项目和基本方法而没有合格 标准，ICH和USP类似。
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方法学验证
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线性
线性是指再设计范围内，测试结果与试样中被 测物浓度直接呈正比例关系的程度。
线性应在分析需要的范围内进行评价
一般以最小二乘法处理数据求的回归曲线的斜 率来表示，必要时可对响应信号进行数字转换。
数据要求：至少需要五个浓度考察线性，需提 供相关系数，Y截距，应列出回归方程数和线 性图。
以往老产品的检验方法，原厂无力或无法进行 方法传递。
方法确认一般应进行准确度，重复性，专 属性测试。
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分析方法传递
分析方法传递（转移）是指一方将已经验 证的方法传送（转移）给另一方的过程。
方法传递主要进行在不同的实验室在一定 时限内对同一份样品的重现性测试的结果比对。
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系统适用性试验
对一些仪器的测试方法，在进行方法验证 时，有必要将分析设备，电子仪器与实验操作， 被测试样品等一起当做完整的系统进行评估。 系统适用性便是对整个系统进行评估的指标。
中间精密度：同一实验室，不同时间有不同的分析人 员用不同设备所得结果的精密度（三人三机）
重现性：不同实验室，不同分析人员测定结果的精密 度。以SD，RSD表示。
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专属性
专属性只有其他成分（杂质，降解物，辅 料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定 出被测物的特性，能反映该方法在有共存物时 对供试液准确而专属的测定能力，是指该法用 于复杂样品分析时是否受相互干扰程度的度量。
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专属性
破坏性试验
高温，高湿，光照，酸破坏，碱破坏，氧化破坏
注意观察降解产物生成情况，分离度是否符合 要求
注意掌握破坏条件，应使主成分峰保留大约 90%
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检测限
在确定的实验条件下，被测物能被检测出的最低浓度 或含量
目视法（直观评价，非仪器分析）
可用于非仪器分析方法，也可用于仪器分析方法，用已知浓度的被 测物，试验出能被可靠的检测出的最低浓度或量
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专属性
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检测限
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定量限
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线性
耐用性
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分析方法验证注意要点
空白样
空白样是指根据样品的特性，配方和工艺 过程，制备除了不含被测物外其他组成与样品 完全一致的模拟样品
预验证
预验证是指在正式验证前进行的试验，目 的是收集证据，已初步证实该检验方法可达到 预期要求，同时确定各个项目单位可接受标准。
M-空白
回收率：R= A 100% 加样回收试验：测定值（M），背景值（P）
，已知量的加入的对照品（或标准品）的值
（A） 回收率：R= M-P （M,P为均值） A
100%
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准确度
试验方法：规定的范围内，至少用九次测 定结果评价，如制备高，中，低三个不同浓度 样品各测三次。
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准确度
试验方法（中药） 同一样品，制备相同浓度的6份供试品（样品 取样量减半，以1：1比例加入对照品） 同一样品，制备三个浓度的供试品，每个浓度 分别制备三份供试液，对照品的加入方式有三 种方式。
对分析方法的科学性，准确性和可行性进行验 证，充分表明分析方法符合测试项目的目的和求。
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方法验证的目的 目的是判断采用的分析方法是否科学，合
理，是否有效控制产品的内在质量。
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需要验证的检测项目
1.鉴别 目的在与判定被分析物是目标化合物而非
其他物质。 共存，相似的化合物要分开。要考察其他
成分和辅料的干扰，空白试验一定要成阴性。
目测法（直观评价，非仪器分析） 用已知浓度的被测物，试验出能被可靠的检测出符合准确度
和精密度要求的最低浓度或量 信噪比法 一般以信噪比（S/N）为10：1时相应的浓度或注入仪器的量进
行确定。
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检测线和定量限试验时应注意
A： 应以实验中得到的浓度分析，而不能靠推 算。 B:应以定量浓度限为依据确定对照溶液浓度 （一般扩大20—50倍）
典型的变动包括：
1.分析溶液的稳定性
用不同时间段的样品和标准品溶液与新制的标准 品溶液的对比结果来分析溶液的稳定性
2.提取方法，溶剂，次数，时间等
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耐用性
3.液相色谱的典型变动： 流动相PH（-0.5+0.5） 流动相组成（有机相-0.5至+0.5） 色谱柱(同一厂家三个批号，或两个不同厂家（同固定相和填充物，尺 寸）) 温度（20-25摄氏度）和流速（-10%至+10%） 检测波长（-5nm至+5nm）
偏差（d）
之差
d=xi-x
测量值与平均值
标准偏差（SD） SD
n
2
(xi x)
i 1
n 1
相对标准偏差（RSD）
RSD= SD 100% x
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精密度
重复性：在相同条件下，有同一个分析人员测定所得 结果的精密度
在规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备 不同浓度样 品各测三次 把被测浓度当做100%，至少测6次进行评价
配置回收试验法
加样回收试验法
已知准确度的另一方法比较
14 杂质
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准确度
对于中药 a. 以经典方法的测定值作为真值，建立方法的
测定数据与之比较（该法适用于化学单体药物） b. 以加入对照品测定的回收率表示，一般有空
白回收（制剂空白）和加样回收的测定方法（中药 材，复方制剂等）
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准确度
回收试验：测定值（M），空白，已知量A 的 对照品测定
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对照品的加入方式
取相同量样品9份（一般为样品取样量的一半），设计三个浓度， 按不同比例加入对照品。中间浓度一般按1；1比例加入，低，高 浓度可选0.5：1，1.5：1的比例，加入对照品的量要适当，保证 供试品溶液的浓度（或量）在考察的线性范围内。
取3种不同量的样品个三份，每个取样量分别按1：1比例加入对 照品，中间浓度已选定正常浓度，其他两个浓度可以结合范围测 定项目选择低，高浓度。
4.气象色谱的典型变动： 色谱住(同一厂家三个批号，或两个不同厂家（同固定相和填充物，尺 寸）) 温度 流速
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耐用性
如果测试条件要求苛刻，则建议在方法中予以 写明。
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检测项目和验证内容总结 中国药典
鉴别 杂质测定 杂志限度测定 含量 溶出度等
准确度
-
+
精密度--重复性
-
+
精密度—中间精密度
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系统适用性试验参数的设置需根据被验证 方法类型而定。
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系统适用性试验
含量测定方法可接受的标准 主峰的峰面积的相对标准差应不大于2.0%，主 峰保留时间的相对标准差应不大于1.0%。另 外，主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰与杂 质峰必须达到基线分离，主峰的理论塔板数应 符合质量标准的规定。
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按表示量计算得组分，可参订化学药品测定方法，取9份样品， 按0.8：1，1：1，1：1.2的比例加入对照品（样品取样量减半）
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精密度
精密度是指在规定条件下，同一个均
匀样品，经多次取样测定所得结果 之间的接近程度。用偏差（d），标 准偏差（SD），相对标准偏差 （RSD）（变异系数CV）表示。
主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰的杂质峰 必须达到基线分离，各条件下的含量数据 （n=6）的相对标准差应不大于2.0%
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分析方法的确认
方法确认是一种简化了的方法验证，目的 是为了确认药典方法或其它已经验证的方法是 否适用于实际使用的环境。
各国药典和行业法规收载的检验方法
从外部引入的已经检验的检验方法