地中海贫血相关知识

1.β—珠蛋白基因有多少个外显子？mRNA序列与编码序列之间有何关系？答：（1）人血红蛋白β珠蛋白基因有3个外显子和2个内含子,全长约1700个碱基对,编码146个氨基酸。

（2）DNA双连中按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链，称为模版链，相对的另一股单链是编码链。

转录产物若是mRNA,,则可用作翻译模版，按遗传密码决定氨基酸的序列，因此，模版链既与编码链互补，又与mRNA互补，mRNA的碱基序列除用U代替T以外，与编码链是一致的。

2.β—地中海贫血的分子基础是什么？中国人群中有哪5种最常见的突变？这些突变对该基因的表达有何影响？答：绝大多数的β地中海贫血是由于β基因突变所造成的。

至今为止只发现十几种缺失型的β型地中海贫血。

β珠蛋白基因的突变可能发生在基因中的编码序列，也可能发生在基因5’端转录调控序列、内含子碱基信号序列、3’端多聚腺苷酸附加信号序列等非编码序列。

β地中海贫血至今已发现170多种突变类型，其中10多种为缺失型，其余均为点突变。

我国发现报道27种。

1）点突变绝大多数β地中海贫血是由于β基因发生点突变所致，突变涉及基因内及侧翼表达序列的各个环节。

主要类型有5种。

A．编码区的无义突变、移码突变和起始密码突变这些突变使生成的mRNA的稳定性降低或形成无功能的mRNA，从而不能合成正常的β珠蛋白链，多数产生β0地贫；少数为β+地贫。

例如：无义突变密码子17（A→T）、43（G →T）都产生β0地贫。

移码突变密码子41|42（-TCCTT），密码子71|72（+A）产生的β0地贫；以及起始密码子突变ATG→AGG导致的β0都属于这类，见于中国人。

B．非编码区 IVS-1和IVS-2突变影响前mRNA剪接等加工过程不能准确进行，形成异常的mRNA，导致β0或β+地贫。

例如IVS-1的1位G→T为RNA 拼接处改变；中国人中常见的IVS-2的654位，为内含子中由于碱基置换形成了一个新的裂解信号，影响正常位点的剪接，产生异常的mR2NA；还有一种是内含子中剪接位点的通用顺序上的同义突变，从而激活内含子或外显子中隐藏裂解位点（CSS），如IVS-1的5位（G→C）。

CSS即DNA的一段顺序在点突变后可形成剪切识别顺序（CCTATTGGT 的第七个碱基G变成A，则产生新的切点，CCTATTAG↓T）C．影响转录的突变这类突变主要集中于起始位点上游的启动子TATA框，使转录效率降低mRNA生成量减少而产生β+地贫。

中国人中的-29A→C、-28A →C都属于这一类。

D．R NA裂解部位缺陷这类突变是由于异常的RNA加帽部位和多聚腺苷酸化信号的突变，从而影响在RNA转录后不能准确裂解，产生不稳定的mRNA，使得正常β链生成减少，导致β+地贫。

例如，在mRNA加帽部位发生A→C颠换，引起β+地贫，又如，多聚腺苷酸化信号AATAAA→AACAAA，引起β+地贫。

E．编码区的外显子突变引起剪接作用的改变这类突变是由于编码区的单碱基突变激活邻近的隐藏裂解信号，影响IVS正常位点的剪接，产生异常的mRNA。

如东南亚常见的Hb E，是一种轻型的β地贫，其原因是当β链26位密码子发生G→A错义突变时，其相邻的裂解信号被激活，生成异常mRNA，产生Hb E2)类p珠蛋白基因缺失按类p珠蛋白基因簇缺失长短大致可分为5种，即β0、δβ、γδβ地中海贫血、HPFH及融合基因，单纯由于p基因缺失引起的β0地中海贫血是罕见的。

3.如何检测β—地中海贫血？寡核苷酸探针杂交、反向点杂交、等位基因特异聚合酶链反应，限制性内切酶分析检测方法的生化基础分别是什么？答：四种检测方法，即反向点杂交，限制酶酶谱分析，寡核苷酸探针杂交，等位基因特异聚合酶链反应。

(1)反向点杂交又称DNA点杂交，把患者DNA直接点加在硝酸纤维膜上，与同位素标记的珠蛋白基因探针作分子杂交。

根据杂交斑点的放射性强度，即能鉴定出珠蛋白基因是否缺失。

本法由作者实验室建立，具有快速简便而灵敏的优点，已成为血红蛋白病诊断的重要技术。

（2）限制酶酶谱分析(restriction map analysis)s患者DNA先经限制性内切酶消化，电泳分离，再与珠蛋白基因探针作Southern 7杂交和放射自显影，即可得限制性内切酶酶谱。

根据酶谱上是否存在特异的DNA区带和DNA区带的长短，可以诊断出珠蛋白基因是否缺失和缺失多少。

（3)寡核苷酸探针杂交：用人工合成和突变基因互补的寡核苷酸(oligonucleotide)作探针与患者DNA杂交，根据杂交与否，便能测知是否存在相应的β地贫突变基因或异常血红蛋白基因，这是80年代中期开始应用的一种遗传病基因诊断技术，由于本法灵敏、简便，能直接检测出基因突变类型，具有重要价值。

（4）等位基因特异聚合酶链反应等位基因特异性PCR等位基因特异性PCR(allelespecificPCR，ASPCR)也称为3‘碱基特异PCR或称扩增不应突变系统(amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)。

它的原理是由于PCR过程中引物延长是从3+端开始的，所以3’末端的碱基对引物的延长处于至关重要的位置。

如果这个碱基与模板互补，则引物能从3+端延伸，PCR得以正常进行，反之则不行。

就是说当用3+碱基为突变碱基的引物进行PCR时，如果有特异长度扩增带，表明模板DNA有该种突变；如果没有特异扩增带，则表明没有这种突变。

因此根据已知点突变设计一对引物，其3’端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。

现我们已建立了中国人常见5种突变的等位基因特异性PCR诊断方法。

4.目前有哪些先进的诊断方法？答：血红蛋白病的诊断和防治皿红蛋白病的诊断血红蛋白病可以表现溶血性贫血、紫绀等症状，也有些没有任何临床症状。

故本组疾病的确诊往往依赖实验室诊断C25)。

1．血液学检查由于血红蛋白合成速度降低可表现为低色素性贫血血象。

由于肽链合成不平衡而导致多余肽链在红细胞内沉淀，以及由于异常血红蛋白的不稳定性沉淀而产生的包涵体，所以可进行细胞学检查或作变性珠蛋白小体生成试验。

2理化分析对于等电点改变的异常血红蛋白，可通过电泳分离出异常成分，或者应用血红蛋白不稳定性检查(异丙醇试验和热不稳定试验)鉴定不稳定血红蛋白，或者通过血红蛋白溶解度测定，检出溶解度改变的异常血红蛋白，进一步可进行化学结构分析，确定结构的变化，最终鉴定出血红蛋白的异常c26)。

对于地中海贫血，可以通过测定患者血中HbA。

和F的含量作临床实验室诊断，进一步可应用。

H标记的亮氨酸孵育患者的网织红细胞，通过体外生物合成试验来测定珠蛋白链合成速率，从而作出明确的诊断。

3．基因诊断目前常用的有以下五种方法：DNA点杂交，限制酶酶谱分析，寡核苷酸杂交详见第四题。

RFLP连锁分析：由于基因中性突变所致的DNA限制性内切酶片段长度多态性(res[ric[ionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)具有民族和地理分布的特点，它可用作“遗传标志”，通过RFlP连锁分析对遗传病进行基因诊断csl，32)(参阅第十五章)。

在人类的尽珠蛋白基因簇已发现了许多多态性切点C20)。

作者发现中国人的这些切点多态性发生频率和其它种族存在一定的差异(表17—6)C9)。

可以选择有切点多态性的限制性内切酶对6地中海贫血患者及其家庭成员进行DNA酶谱检查，测出这些多态性位点与正常的犀珠蛋白基因和后地贫基因的连锁关系，根据受检查的DNA酶谱便可以诊断出是否携带尽地贫基因。

基因体外扩增法：此法又称聚合酶链反应(polymerasechainreac“On，PCR)(参阅第十五章)。

用此法可使目的基因DNA顺序扩增数百万倍。

然后进行寡·核苷酸杂交或内切酶酶谱分析，即能检测出突变基因C35)。

应用PCR体外扩增基因方法作基因诊断仅需<0．1／Jg的原基因组DNA，不需DNA酶解和电泳分离，整个基因诊断过程只需1天的时间。

这种简便、快速、灵敏方法的出现，把地中海贫血及镰形细。

胞贫血的基因诊断提高到崭新的水平5.为什么患者Hb A2增高？答4.课外补充。

产前诊断血红蛋白病迄今尚无有效的根治方法，产前诊断具有特别重要的价值，它成为当前预防本病的最有效措施。

目前采用的血红蛋白病产前诊断方法有。

(1)胎儿血检查‘3∞t于妊娠18---,20周，用胎盘吸引术或胎儿镜技术采集胎儿血，通过生物合成试验检查珠蛋白链合成速率以及是否有异常肽链合成以诊断地中海贫血和异常血红蛋白病。

·9)DNA点杂交“”：于妊娠8—10周采集胎儿绒毛或妊娠17周左右采集羊水，提取胎儿DNA，进行快速DNA点杂交，以诊断缺失型口地中海贫血。

酶谱分析和RFlP连锁分析诊断胎儿是否患血红蛋白病。

(4)寡核苷酸杂交C403t选择特异的寡核苷酸探针和胎儿DNA杂交，直接检出胎儿是否携带地中海贫血突变基因或异常血红蛋白基因。

㈤限制酶酶谱分析，制作胎儿DNA的限制酶酶谱，通过作者应用这种技术完成了多例β地中海贫血胎儿的产前诊断。

基因体外扩增法：胎儿细胞DNA或胎儿细胞破碎液经聚合酶链反应(PCR)扩增目的基因，再通过寡核苷酸杂交或电泳分析对突变基因进行鉴定，国内巳完成了a地中海贫血和β地中海贫血的产前诊断。

2．治疗目前尚未有根治办法，但仍可以根据本病的特点，在不同的水平土采取各种治疗措施。

(1)对症治疗：为减少异常红细胞在脾中破坏，对地中海贫血和不稳定血红蛋白病患者可考虑脾切除，由于血红蛋白异常所致的溶血性贫血症状应用输血可得到改善；为了避免长期反复输血引起的铁质沉着，可同时使用铁螯合剂。

（2）基因治疗：既然血红蛋白病是由于血红蛋白肽链基因缺失或异常所致，通过基因工程矫正基因缺陷，有可能根治此病。

这项工作已经取得一些令人鼓舞的研究成果。

1)用化学药物启动了珠蛋白基因：瘴地中海贫．血是由于犀珠蛋白基因缺陷，日链合成速率降低，导致口和非口链的合成不平衡。

因此可以通过增加丫链合成的办法，使珠蛋白链的合成达到平衡，矫正珠蛋白基因的缺陷。

由于成人时期的r珠蛋白基因处于抑制状态，即DNA被甲基化。

有一种化学药物5氮胞苷，能有效地抑制DNA甲基化酶的活力，从而激活关闭的基因。

据此，Ley等C423用5氮胞苷治疗了3名声地中海贫血病人，连续给药7天后，病人的了珠蛋白基因的DNA片段表现非甲基化，了mRNA数量增加7倍以上，丫链合成显著增加，口和非口链合成量几乎相等。

HbF从1．0％上升到21％，Hb从6．3g％上升到10．8g％。

但疗效不能持久，故未见进一步报告。

也有人应用5糖胞苷、羟基脲、马利兰等取得一定疗效。

2)用人工制造的tRNA基因矫正无义突变：中国人中有一种β-地中海贫血是由于编码犀基因第17位赖氨酸的密码子突变为终止(无义)密码子(UAG)，这种廖地贫基因能够转录并加工为6mRNA，但后链合成提前终止，致使合成的廖链过短而无效。