变性与非变性电泳对牛羊乳蛋白质差异比较研究

第３１卷　第６期 陕西科技大学学报 Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．６　２０１３年１２月 ＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｈａａｎｘｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｃ．２０１３倡　文章编号：１０００‐５８１１（２０１３）０６‐０１０９‐０５

变性与非变性电泳对牛羊乳

蛋白质差异比较研究

宋宏新，刘　静，张　歌，李红心

（陕西科技大学生命科学与工程学院，陕西西安　７１００２１）

摘　要：主要采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法（Ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ）对新鲜牛羊乳及其酪蛋白清蛋白的区别进行分析检测，对比研究两种电泳方法测定结果的差异，并用两种方法分别检测了掺入不同浓度牛乳的羊乳样品．结果显示ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ法对牛羊乳酪白质的分离效果好，该条件下牛羊乳的区别主要是酪蛋白αｓ２‐ＣＮ和αｓ１‐ＣＮ，而ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ法则是对清蛋白分离效果较好，该条件下的主要区别是牛乳较羊乳多两条β‐乳球蛋白．两种电泳方法对掺入不同浓度的羊乳样品的检测阈值均为５％，但ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ效果更明显．

关键词：ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ；Ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ；乳蛋白质；羊乳牛乳蛋白质差别

中图法分类号：ＴＳ２５２．４ 文献标识码：Ａ

Ｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｂｅｔｗｅｅｎｃｏｗａｎｄｇｏａｔｍｉｌｋ

ｐｒｏｔｅｉｎｓｂｙＳＤＳ‐ＰＡＧＥａｎｄｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ

ＳＯＮＧＨｏｎｇ‐ｘｉｎ，ＬＩＵＪｉｎｇ，ＺＨＡＮＧＧｅ，ＬＩＨｏｎｇ‐ｘｉｎ

（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＳｈａａｎｘｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉ′ａｎ７１００２１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｆｒｅｓｈｃｏｗａｎｄｇｏａｔｍｉｌｋａｎｄｃａｓｅｉｎｐｒｏｔｅｉｎ，ａｌｂｕｍｉｎｐｒｏｔｅｉｎｂｙｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｐｈａｔｅｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）ａｎｄｎａｔｉｖｅｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ），ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｄｉｆｆｅｒ‐ｅｎｃｅｓｏｆｔｗｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｍｅｔｈｏｄｓ．Ａｎｄｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｔｈｅｇｏａｔｍｉｌｋｓａｍｐｌｅｓｄｏｐｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｃｏｗｍｉｌｋｂｙｂｏｔｈｍｅｔｈｏｄｓ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｂｙＳＤＳ‐ＰＡＧＥｃａｓｅｉｎｐｒｏｔｅｉｎａｒｅｓｅｐａｒａｔｅｄｂｅｔｔｅｒ，ａｎｄｔｈｅｍａｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓａｒｅαｓ２‐ＣＮａｎｄαｓ１‐ＣＮ，ｗｈｉｌｅｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥｓｅｐａｒａｔｅａｌｂｕｍｉｎｐｒｏｔｅｉｎｂｅｔｔｅｒ，ａｎｄｔｈｅｍａｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｓｔｈａｔｃｏｗｍｉｌｋｈａｓｔｗｏβ‐ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ，ｂｕｔｇｏａｔｍｉｌｋｈａｓｎ′ｔ．Ａｎｄｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｈｒｅｓｈｏｌｄｏｆｔｈｏｓｅｔｗｏｋｉｎｄｓｏｆｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｍｅｔｈｏｄｓｏｆｄｅｔｅｃｔｅｄｔｈｅｇｏａｔｍｉｌｋｓａｍｐｌｅｓｄｏｐｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａ‐ｔｉｏｎｓｏｆｃｏｗｍｉｌｋｉｓ５％．Ｂｕｔｔｈｅｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥｉｓｍｏｒｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ；Ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ；ｍｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎ；ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｂｅｔｗｅｅｎｃｏｗａｎｄｇｏａｔｍｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎ

倡收稿日期：２０１３‐１０‐１４

基金项目：陕西省教育厅科研计划项目（２０１３ＪＣ０３）

作者简介：：宋宏新（１９５９－），男，陕西咸阳人，教授，研究方向：生物化学与分子生物学

陕西科技大学学报第３１卷

０　引言

乳与乳制品含有丰富的蛋白质、脂肪、乳糖、矿物质及多种维生素［１］，是一类营养丰富的理想食

品，牛乳和羊乳是两类重要的乳品工业原料．羊乳

的营养物质易于吸收、风味独特［２］，但羊乳资源相

对匮缺，致使其市场价高量少，在利益驱动下不法

商贩将牛乳掺入羊乳中降低成本，这种掺假不仅存

在于羊乳及其制品中，更多地会出现在原料乳的收

购过程．国际贸易对羊乳制品纯度要求高（大于

９５％），羊乳制品企业在生产经营过程对原料及产

品的保真性检验是一个急待解决的问题，基于牛羊

乳成分的差异比较研究是解决羊乳中掺入牛乳成

分的技术关键．

羊乳与牛乳的外观和主要化学成分相似，其差

别主要是在脂肪酸、蛋白质种类等微观组成上．乳

蛋白质是乳制品的重要营养质量指标之一，乳蛋白

质主要包括酪蛋白和乳清蛋白两大类［３］，乳脂肪球

膜蛋白的含量相对较少．蛋白质的电荷和分子质量

特性的聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）是蛋白质分

离分析的良好方法，ＰＡＧＥ分为变性聚丙烯酰胺凝

胶电泳（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）和非变性聚丙烯酰胺凝胶电

泳（ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ），两种电泳系统的主要差别是ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ添加ＳＤＳ和疏基乙醇变性剂，并在加热条件下将聚合蛋白质充分变性为亚基进行分离，

而ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ不含变性剂，多在低温条件下对天然构象的蛋白质（寡聚或单体）进行分离．ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ是乳品蛋白质研究应用最广泛的方法［４］，ｎａｔｉｖｅ‐ＰＡＧＥ的研究报道较少，本实验通过对牛羊乳在变性及非变性条件下的电泳分析，建立分析牛羊乳蛋白质的方法，通过比较牛羊乳的蛋白质差异为羊乳中掺入牛乳成分的分析检验提供依据．

１　材料与方法

１．１　实验仪器

分析天平（万分之一克），北京赛多利斯仪器系

统公司；Ｔ‐１０００型电子天平，江苏常熟双杰测试仪

器厂；ＨＣ‐３０１８Ｒ高速冷冻离心机；ＷＨ‐３微型旋

涡混合仪，上海泸西分析仪器厂；移液枪，德国艾尔

德股份有限公司；１０１‐２Ａ型电热鼓风干燥箱，天津

市泰斯特仪器有限公司；ＰＢ‐１０型酸度计，北京赛

多利斯仪器系统公司；恒温水浴锅，国华电器有限

公司；ＴＳ‐２型脱色摇床、恒温器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；ＨｏｅｆｅｒｍｉｎｉＶＥ型电泳槽，美国ＧＥ公司；ＢＧ‐Ｐｏｗｅｒ６００型电泳仪，北京百晶生物技术有限公司；ＪＤ‐８０１型捷达图像分析系统，江苏省捷达软件工程有限公司．

１．２　实验药品及材料

主要试剂：丙烯酰胺、Ｎ，Ｎ‐甲叉双丙烯酰胺，优级纯，美国Ａｍｅｒｓｃｏ公司；十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ），优级纯，美国ＵＳＢ公司；过硫酸铵，分析纯，北京化学试剂厂；四甲基乙二胺（ＴＥＭＥＤ），优级纯，北京化学试剂厂；α‐乳白蛋白、β‐乳球蛋白：美国Ｓｉｇｍａ公司；分子量标准蛋白Ｍａｋｅｒ，科昊生物工程有限责任公司；硫酸铜、硫酸钾、Ｔｒｉｓ‐Ｂａｓｅ、巯基乙醇、考马斯亮兰Ｒ‐２５０、甘油、溴酚蓝、盐酸、甲醇、冰乙酸等其它常用试剂为分析纯级．

１．３　样品及处理

牛乳：西安未央区韩家湾奶牛场当天产的鲜乳．奶牛健康状况良好，无乳房炎、消化道疾病等．羊乳：西安市北郊夏家堡某农户家关中奶山羊当天产的鲜乳．

脱脂牛、羊乳：取新鲜牛、羊乳在４℃５０００ｒ／ｍｉｎ下离心３０ｍｉｎ，弃去上层脂肪即得．

牛、羊乳酪蛋白：酪蛋白的制备方法采用的是等电点沉淀法［５］，脱脂乳加热３７℃，用０．１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ调ｐＨ（牛乳调至ｐＨ４．６，羊乳调至ｐＨ４．１），４０℃保温３０ｍｉｎ沉淀酪蛋白，５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，下层沉淀干燥即为酪蛋白．保留上清液用于清蛋白制备．

牛、羊乳清蛋白：上步保留的离心上清过滤除去残留酪蛋白颗粒即为清蛋白液．

羊乳中掺入不同比例牛乳样品的制备：分别取脱脂乳按脱脂羊乳和脱脂牛乳体积比（Ｖ∶Ｖ）９５∶５、９０∶１０、８０∶２０、７０∶３０、６０∶４０、５０∶５０分别混匀，即制得掺入５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％脱脂牛乳的脱脂羊乳样品．

α‐乳白蛋白：准确称量０．０１ｇα‐乳白蛋白标准品溶于１ｍＬ纯净水中．

β‐乳球蛋白：准确称量０．０１ｇβ‐乳球蛋白标准品溶于１ｍＬ纯净水中．

１．４　电泳方法

１．４．１　ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ

（１）样品处理：２×变性样品缓冲液（ｐＨ８．０：０．１２５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ‐ＨＣｌ，２％ＳＤＳ，１０％甘油，０．１％溴酚蓝，５％巯基乙醇，调完ｐＨ后再加巯基乙醇）．

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