亲和层析法纯化尿胰蛋白酶抑制剂及部分性质研究
胰蛋白酶或抑制剂分离、纯化综合分析
实验胰蛋白酶或抑制剂分离、纯化在动物胰脏中，胰蛋白酶是以无活性的酶原状态存在的。
在生理条件下，胰蛋白酶原随胰液分泌至十二指肠后，在小肠上腔有Ca2+的环境中，为肠激酶或胰蛋白酶所激活，其肽链N -端的赖氨酸与异亮氨酸之间的一个肽键被水解，失去一个酸性6肽，其分子构象发生一定的改变后转变为具有催化蛋白质水解活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原分子量约为24 000，其等电点为pH8.9；胰蛋白酶的分子量约为23 400，其等电点为pH 10.8。
胰蛋白酶在pH3.0时最稳定，其浓溶液可贮存于冰箱（0℃以下）数周而活性无显著丧失。
pH＜3时，胰蛋白酶易变性。
PH＞５时，胰蛋白酶易自溶。
胰蛋白酶催化活性的最适pH为7.6～7.8。
重金属离子、有机磷化合物和反应产物都能抑制胰蛋白酶的活性。
胰脏、卵清和大豆中也含有一些蛋白质对胰蛋白酶活性具有抑制作用。
实验（一）胰蛋白酶活性测定[原理]胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的肽键具有高度的专一性。
此外，胰蛋白酶也能催化由碱性氨基酸的羧基所形成的酰胺键和酯键，有高度的专一性仍表现为对碱性氨基酸羧基一侧的选择对此等化学键的催化水解活性的敏感度为：酯键＞酰胺键＞肽键。
因此，可以利用含有这些化学键中任一种键型的底物来研究胰蛋白酶的专一催化活性。
本实验方法一采用N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯[（BAEE），N-benzoyl-L-arginine ethyl ester]作为底物，水解反应如下：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）在波长253nm下的紫外光吸收远远弱于N-苯甲酰-L-精氨酸[（BA），benzoyl-L-arginine]的紫外光吸收。
在胰蛋白酶的催化下，BAEE随着酯键的水解，水解产物BA逐渐增多，反应体系的紫外光吸收亦随之相应增加，以△A253nm计算胰蛋白酶的活性。
胰蛋白酶的BAEE单位定义为：以BAEE为底物，在一定反应条件下，每分钟使△A253nm 增加0.001的酶量为一个BAEE单位。
酶工程技术的研究及其在医药领域的应用
酶工程技术的研究及其在医药领域的应用一、本文概述随着生物技术的飞速发展，酶工程技术作为其中的重要组成部分，已经在医药领域展现出广阔的应用前景。
酶，作为生物体内的一类特殊蛋白质，具有高效、专一和温和的催化特性，因此被广泛用于医药、化工、食品等多个领域。
本文旨在探讨酶工程技术的最新研究进展，并重点分析其在医药领域的应用现状和发展趋势。
本文将对酶工程技术的基本原理和方法进行简要介绍，包括酶的来源、分离纯化、固定化以及酶反应器的设计等。
在此基础上，文章将重点论述酶工程技术在医药领域的多个应用方面，如药物合成、药物转化、药物分析和疾病诊断等。
通过具体案例和数据分析，展示酶工程技术在提高药物生产效率、降低药物成本、改善药物质量和提高疾病诊疗准确性等方面的积极作用。
本文还将对酶工程技术在医药领域面临的挑战和未来发展方向进行深入探讨。
随着生物技术的不断进步，酶工程技术的研究和应用将更加深入和广泛。
例如，新型酶的发现与改造、酶固定化技术的创新、酶反应器的优化以及酶工程技术在基因治疗和细胞治疗等新兴领域的应用等，都将成为未来研究的热点和方向。
酶工程技术在医药领域的应用已经取得了显著成果，并展现出广阔的发展前景。
本文将从多个角度全面分析酶工程技术在医药领域的应用现状和发展趋势，以期为相关领域的研究和实践提供有益的参考和借鉴。
二、酶工程技术的基础理论酶工程技术，作为一门应用生物技术的分支，其基础理论主要涵盖酶学基本原理、酶反应动力学、酶分子设计和改造以及酶固定化技术等方面。
酶学基本原理是酶工程技术的基石。
酶是生物体内具有催化功能的蛋白质，具有高度专一性和高效性。
酶通过降低反应的活化能来加速生物化学反应，使得原本难以进行的反应在温和条件下也能迅速进行。
了解酶的结构、催化机制以及影响因素，对于酶工程技术的应用至关重要。
酶反应动力学是研究酶催化反应速率与反应物浓度关系的科学。
通过对酶反应动力学的研究，可以了解酶催化反应的速度控制步骤、反应速率常数以及反应机制等，为酶工程技术的优化提供理论依据。
蛋白质亲和层析
蛋白质亲和层析蛋白质亲和层析是一种高效分离方法，它利用生物大分子之间的特异性作用来选择性地分离目标蛋白质。
该方法具有分离效率高、操作简单易行、适用性强、损失小等优点，被广泛应用于生物化学、生物医学和生物工程等研究领域。
以下针对蛋白质亲和层析的基本概念、方法流程、实验注意事项等进行详细介绍。
一、蛋白质亲和层析基本概念蛋白质亲和层析是利用配体固定于某一介质孔隙中，通过生物大分子之间的特异性作用，选择性地分离目标蛋白质的一种纯化方法。
通常用于分离蛋白质与其结合分子的复合物，例如酶与底物、抗体与抗原等。
常用的配体有亲和素、金属离子、抗体及蛋白质等。
二、蛋白质亲和层析方法流程1. 设计实验流程：确定目标蛋白质及其结合配体，选择适当的分离介质、操作条件及检测方法。
2. 制备分离介质：将选择的配体固定于固相载体（如琼脂糖、琼脂糖-硫酸盐、硅胶等）上。
3. 样品制备：采用适当的方法，“开裂”细胞，释放所需的目标蛋白质。
去除细胞碎片后，可进行酶、抗体等前处理。
4. 样品加载：将制备好的样品加入到分离介质中，充分混合。
5. 洗脱：将非特异性蛋白质等杂质彻底洗脱，最终目标蛋白质作为复合物结合态定向脱附。
6. 脱附和再生：可用特定的洗脱剂或酸碱条件等方法对结合蛋白质进行脱附，目的是复合物的释放以及再生与维护分离介质的性质和活性。
三、蛋白质亲和层析实验注意事项1. 选择适当的配体：根据目标蛋白质特异性、结构、物理化学性质等因素，选择有特异性和较高亲和力的配体。
2. 制备良好的分离介质：要求固相载体颗粒粒径均匀、孔隙适当，配体固定稳定。
3. 样品质量要好：可通过细胞全裂方案、适当的培养培养、存储方式、冻干等方法保证目标蛋白质的活性、纯度和稳定性等。
4. 洗脱过程控制：要严格控制洗脱条件，防止目标蛋白质异常脱失或浓度降低之外，同时要特别关注分离介质稳定性，以维护肯定柱介质活性和再生可能性。
蛋白质亲和层析是一种高效、通用的纯化方法，适用于从复杂基质中分离出目标蛋白质及其复合物。
分离纯化一种酶的方法
分离纯化一种酶的方法分离纯化一种酶是生物工程领域的一个重要研究课题，有多种方法可以用来实现这一目标。
下面将介绍几种常用的分离纯化酶的方法。
1.固定相吸附色谱法固定相吸附色谱法是最常用的酶纯化方法之一。
在这种方法中，通过对酶进行吸附，然后使用缓冲溶液洗脱的方式分离纯化酶。
为了实现这一目标，可以选择一种适合酶吸附的固定相，例如亲和树脂、离子交换树脂或凝胶等。
通过在不同的条件下洗脱，可以逐步去除非目标蛋白质，最终得到纯化的酶。
2.亲和层析法亲和层析法是常用的可以选择性地与酶相互作用的方法。
在亲和层析法中，可以通过与酶相互作用的特定亲和剂将酶从复杂混合物中分离出来。
例如，可以根据酶与金属离子的亲和性，使用金属离子柱进行层析。
亲和层析法通常需要先对亲和剂进行固定，然后通过加载样品和适当的洗脱剂来纯化酶。
3.凝胶过滤法凝胶过滤法是一种基于酶的大小差异来分离纯化的方法。
这是一种较为简单的方法，适用于分离不同分子量的酶。
在凝胶过滤法中，通过将混合物通过一系列的凝胶分离层来分离不同大小的分子。
酶分子会在凝胶中被阻止，而较小的分子可以通过凝胶透析孔隙。
通过控制凝胶的孔隙大小，可以选择性地纯化酶。
4.电泳法电泳法是一种常用的酶分离纯化方法，尤其适用于具有不同电荷的酶。
在电泳法中，通过在电场中施加电压，根据不同酶的迁移速度将酶分离出来。
根据酶的等电点和电荷性质，可以选择凝胶电泳或者等电聚焦电泳来分离纯化酶。
电泳法的一个重要应用是SDS-PAGE，它从凝胶中获得酶的纯化和分析。
5.超滤法超滤法是一种可以根据酶的分子量选择性地分离纯化酶的方法。
在超滤法中，通过将混合物通过一系列合适孔径的滤膜，可以将酶与其他较小分子分离开来。
较大分子（包括酶）会被限制在滤膜上方，而较小分子则可以通过滤膜，从而实现分离纯化酶的目的。
综上所述，分离纯化酶的方法有很多种。
选择适用的方法取决于酶的性质、目标和需求。
常用的方法包括固定相吸附色谱法、亲和层析法、凝胶过滤法、电泳法和超滤法。
尿激酶的亲和层析分离研究
华南理工大学硕士学位论文尿激酶的亲和层析分离研究姓名：叶峰申请学位级别：硕士专业：生物化工指导教师：阮复昌20040301摘要摘要尿激酶（Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）是体内纤溶酶原激活剂。
自从在尿液中发现尿激酶以来，人们对它的研究也日益深入和全面。
尿激酶参与纤溶过程，因而常用作治疗脑血栓、急性心肌梗塞和静脉栓塞等疾病。
尿激酶是一种糖蛋白，属丝氨酸蛋白酶类，等电点在８．４～９．７之间。
尿激酶的活性检测方法主要有直接法与间接法，采用间接法较为快捷，如荧光分光光度法和可见光分光光度法是使用较广泛的测定方法。
高纯度的药用尿激酶价格昂贵。
通常是从成年健康男性尿液中提取，制得粗酶后早期采用沉淀和传统层析相结合的多步分离法，后来发展用亲和层析纯化尿激酶。
本文采用Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ为基质，对氨基苯甲脒（Ｐ—ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ，ｐ－ＡＢＺ）年［Ｉ肌酸为亲和配基，制备亲和层析柱分离尿激酶。
在前人的研究工作基础上，本文选择对氨基苯甲脒层析柱在最优的条件下分离尿激酶：合成配基密度４８１．ｔｍｏｌ・ｇ。
１的亲和载体，最大吸附量达２．１７×１０５Ｉｕｇ。
载体以上；选择ｐＨ７．５含Ｏ．５ｍｏｌ・Ｌ。
ＮａＣＩ的０．０５ｍｏｌ・Ｌ‘１Ｎａ２ＨＰ０４～ＮａＨ２Ｐ０４缓冲液为吸附条件，选择ｐＨ４．０含０．５ｍｏｌ・Ｌ‘１ＮａＣｌ的０．１ｍ０１．Ｌ～ＮａＡｃ～ＨＡｃ缓冲液洗脱条件：将尿激酶粗酶纯化５０．２倍，活性回收率为７９％。
首次将肌酸应用于分离尿激酶，并取得较好的效果：合成配基为５３１．ｔｍｏｌ・ｇ。
的亲和载体，最大吸附量为１．２８×１０５ＩＵ・ｇ。
载体；选择ｐＨ４．５含０．５ｍｏｌ－Ｌ１ＮａＣｌ，０．１ｔ００１．Ｌ～ＡＩＣｌ，的０．１ｍ０１．Ｌ～ＮａＡｃ—ＨＡｃ缓冲液为吸附条件，选择ｐＨ７．０含０．５ｍ０１．Ｌ。
１ＮａＣｌ的Ｏ．０５ｍ０１．Ｌ～Ｎａ２ＨＰ０４～ＮａＨ２Ｐ０４缓冲液为最终洗脱条件；将尿激酶粗酶纯化６３．７倍，活性回收率为８ｌ％。
亲和层析原理和步骤
亲和层析原理和步骤亲和层析（affinity chromatography）是一种常用的分离和纯化靶标蛋白的方法。
它利用配体与目标蛋白的高亲和力来实现目标蛋白的选择性结合和纯化。
亲和层析的原理和步骤如下。
一、亲和层析的原理亲和层析的原理基于配体与目标蛋白之间的特异性结合。
配体是一种具有特异性反应性的化合物，可以和目标蛋白的结构域或位点发生特异性作用。
在亲和层析中，配体被固定在固定相上，也可以被连接到大分子载体上，形成亲和层析介质。
当样品通过亲和层析柱时，目标蛋白会与配体发生选择性结合，而其他非目标蛋白则不结合或弱结合，从而实现了目标蛋白的分离和纯化。
亲和层析的步骤通常包括以下几个方面：2.固定配体：将配体固定在固定相上是亲和层析的关键一步。
固定相可以是固定在柱子内壁的小分子配体，也可以是连接在大分子载体上的配体。
常用的固定剂包括琼脂糖、丙烯酰胺凝胶、硅胶等。
3.样品准备：在进行亲和层析之前，需要对样品进行准备。
通常包括细胞裂解、蛋白质提取、预处理等步骤。
样品中的废物和干扰物需要被去除，以便目标蛋白的有效分离和纯化。
4. 亲和层析操作：样品通过亲和层析柱时，目标蛋白与配体发生特异性结合。
通常需要选择适当的Buffer、pH值和盐浓度等条件来提高结合效率。
非目标蛋白会通过柱子流失，而目标蛋白则留在柱子中。
目标蛋白可以通过洗脱步骤从柱子中进行脱附。
5.洗脱与纯化：在洗脱过程中，目标蛋白从亲和层析柱中脱附。
洗脱条件需要根据结合强度和目标蛋白的特性来选择。
常用的洗脱方法包括pH值的调节、离子浓度的变化、配体浓度的变化等。
洗脱后的目标蛋白可以通过浓缩和纯化步骤得到纯品。
二、亲和层析的优缺点亲和层析作为一种分离和纯化方法，具有以下优点：1.特异性：亲和层析可以选择性地结合目标蛋白，从而实现与其他非目标蛋白的分离。
2.高纯度：亲和层析可以显著提高目标蛋白的纯度，使其达到实验或工业应用的要求。
3.选择性：亲和层析可以基于不同的配体，实现对不同蛋白的选择性结合和纯化。
亲和层析法离纯化蛋白质的方法
亲和层析法离纯化蛋白质的方法亲和层析法是一种利用特定配体与目标蛋白质间的亲和作用来分离和纯化目标蛋白质的方法。
该方法简单、高效、选择性强，并且适用于分离和纯化各种规模和属性的蛋白质，因此被广泛应用于生物化学、分子生物学等领域。
亲和层析法的实验步骤如下：1. 配制亲和柱：将特定的配体化合物固定到柱载体上，例如：Ni2+、Protein A/G、抗体等。
固定过程要注意化合物与柱载体的适应性、配位化合物的浓度和固定条件的优化。
2. 样品制备：将待纯化蛋白质与适当的缓冲液混合，如含有余量目标蛋白质竞争配位位点的化合物、pH、离子强度和结构安定剂等。
3. 样品加载：将样品加入亲和柱顶部，让其通过固定的配体和柱内质子、离子等的相互作用与目标蛋白质结合。
样品通过后，用缓冲液淋洗一段时间以去除无关的物质，并测定逐步洗出的蛋白质含量。
4. 洗脱蛋白质：通过改变洗脱缓冲液的pH值，鸟嘌呤核苷酸、纳米微粒、配体等离子强度和竞争配位位点的化合物，剥离蛋白质与配体的相互作用，释放出目标蛋白质。
蛋白质最终会在柱底部被洗出，收集洗脱后的纯化蛋白质即可。
亲和层析法具有一些优点：1. 选择性强，可用于纯化特定蛋白质。
2. 纯化步骤简单，样品不需预备过多。
3. 取得的蛋白质纯度高。
4. 在蛋白质分子中较不会引起构象或孔洞变化，使分离后蛋白质结构相对完整。
1. 需要合适的配体化合物，且有些化合物不易制备或使用方便性较差。
2. 某些特殊的蛋白质可能无相应亲和层析柱，或需要进行配体修饰。
3. 无法分离某些蛋白质互作产物，因为这些产物与配体的亲和性可能相同或更好。
亲和层析法纯化胰蛋白酶
3鸡卵粘蛋白的分离纯化 鸡卵粘蛋白的分离纯化 3.1 Sephadex G-25 柱脱盐 (1)溶胀 溶胀： 溶胀 称取15g Sephadex G-25放入500ml的烧杯中, 加入200ml 蒸馏水，在室温下溶胀24小时或在沸水浴中溶胀2小时。 (2)装柱 装柱： 装柱 取一支30×3cm 的层析柱，将溶胀好的Sephadex G-25 装柱，自然沉降。 (3) 处理 处理： 用2倍柱床体积的0.5mol/L NaCl 溶液洗柱，2倍体积的 蒸馏水洗去残留的NaCl。
1.1环氧氯丙烷活化载体与蛋白质配基的偶联
↓活化
↓偶联
↓亲和结合
↓洗脱
1.2溴化氰活化载体 与蛋白质配基的偶联
2亲和介质合成 亲和介质合成 2.1琼脂糖凝胶层析介质(Sepharose 4B)的活化 2.1.1 琼脂糖凝胶层析介质的处理 称取10克琼脂糖凝胶层析介质，置于G-3玻璃烧结漏斗内， 用100ml 1.0mol/L NaCl溶液抽洗（少量多次），100ml 蒸 馏水抽洗，抽干后转移到100ml三角瓶中备用。
图2，鸡卵粘蛋白在 ，鸡卵粘蛋白在DEAE-Cellulose柱的分离 柱的分离
3.3透析及丙酮沉淀 透析及丙酮沉淀 (1) 透析： 透析： 将经DEAE-Cellulose柱分离的鸡卵粘蛋白转入透析袋内， 对蒸馏水透析，隔一段时间换一次水，直到渗出液经 BaCl2溶液检查无氯离子存在，即可。 (2) 调pH值： 值 将透析好的鸡卵粘蛋白溶液，用0.1mol/L HCl 精确调 至pH4.0（最好一次调成功），量体积。 (3)丙酮沉淀： 丙酮沉淀： 丙酮沉淀 加入3倍体积的预冷丙酮，搅匀，用塑料薄膜封严，在 冰箱内静止4小时以上或过夜。
本实验以亲和层析方法分离纯化猪胰蛋白酶为目的， 从猪胰脏提取液中分离纯化胰蛋白酶，最终得到纯度较高 的胰蛋白酶。围绕亲和层析实验所涉及的蛋白质和酶基本 性质及相关技术进行综合训练。其中主要包括亲和层析介 质配基的制备，亲和介质的合成，蛋白质和酶的分离纯化， 酶活性的测定等内容。 通过综合训练，能够系统掌握蛋白质制备的基本原理 和操作，学习如何进行实验设计，掌握实验过程中的关键 环节，对实验中出现的问题进行科学的分析。使学生在学 习实验技术的同时，自觉培养分析问题和解决问题能力。
亲和层析蛋白纯化
亲和层析蛋白纯化
亲和层析蛋白纯化是一种常用的蛋白质纯化方法，利用目标蛋白与具有亲和作用的亲和基团结合，将目标蛋白从复杂的混合物中分离出来。
亲和基团通常是与目标蛋白有特异结合的小分子，如金属离子、抗体、亲和标签等。
在亲和层析过程中，将这种具有亲和基团的亲和剂固定在某种固相材料上，如琼脂糖或磁珠等。
将混合物加入亲和剂固定的层析柱中，目标蛋白与亲和基团结合，其他非特异结合的成分则通过柱子流过。
随后，通过改变缓冲条件或添加竞争性亲和剂，将目标蛋白从亲和基团上进行洗脱，最终得到纯化后的目标蛋白。
亲和层析蛋白纯化方法简单易行，纯化效果好，但也有一些局限性，如亲和基团的选择对纯化效果有很大影响，目标蛋白与亲和基团的结合力可能不够牢固，而且纯化过程中可能会有非特异结合的蛋白质被误纯化。
因此，在选择亲和层析方法时需要根据目标蛋白的特性及需求进行合理选择。
绿豆中胰蛋白酶抑制子的纯化及部分性质的研究
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绿豆 中胰蛋 白酶抑制子 的纯化及部分性质 的研 究
游 勇来 ’ 中 ，陈
过硫酸铵 Ｐ ， Ｎ， ， ． 甲基 乙二胺ｆ ａ Ｄ ， Ａ ） Ｎ， Ｎ’Ｎ’ 四 ｒ Ｍｅ ）
Ｎａ・ ｎ ｏ ｌ ・ ｒ ｉ ｉｅ ４ ｎ ｔ ａ ｉ ｄ ｈ ｄ ｏ ｈ ｏ ｉｅ ・ ｚ ｙ － ・ ｇｎ ｎ － ｉ ｏ ｎｌ ｅ ｙ ｒ ｃ ｌｒ Ｂｅ ＤＬ ａ ｒ ｉ ｄ
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仪器 与设备：粉碎机 ，７ １ ２ 分光光度计 ，电泳仪 ， 台式 冷 冻 高速 离 心机 ，蛋 白质 纯 化 系统 ，Ｗａ ｒａ ｔｓ ｅ ￣
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１ 材料 与方法
（ Ａ Ｎ ，Ｄ ＡＥＳ ｐ ａ ｓ Ｌ６ Ｂ Ｐ Ａ） Ｅ —ｅｈ ｒ ｅＣ 一Ｂ，Ｓ ｐ ａｒｌ －０ ｏ ｅｈｃｙ ２ ０ Ｓ Ｈ ｇ ｅｏｕｉ ，胰 蛋 白酶 （ ｒｐｉ ）（ ｉｈ Ｒ ｓｌｔ ｎ ｏ Ｔｙ ｓ ｎ 活力为 ５ ０ ００
胰蛋白酶的纯化实验报告
一、实验目的1. 学习和掌握胰蛋白酶的纯化方法。
2. 了解胰蛋白酶的理化性质和生物学功能。
3. 培养实验操作技能和数据分析能力。
二、实验原理胰蛋白酶是一种广泛存在于胰腺中的丝氨酸蛋白酶，具有水解蛋白质的能力。
本实验采用硫酸铵盐析法对胰蛋白酶进行纯化，该方法具有操作简便、成本低廉、纯度较高等优点。
三、实验材料1. 胰蛋白酶粗品：由动物胰腺提取。
2. 硫酸铵：分析纯。
3. 氯化钠：分析纯。
4. 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）：0.1 mol/L。
5. 其他试剂：三氯乙酸、硫酸、氢氧化钠等。
四、实验方法1. 胰蛋白酶粗品预处理：将胰蛋白酶粗品溶解于磷酸盐缓冲液（pH 7.0），搅拌使其充分溶解。
2. 盐析：向胰蛋白酶溶液中加入硫酸铵，使其饱和，充分搅拌，室温静置过夜。
3. 沉淀收集：用布氏漏斗抽滤，收集沉淀，并用磷酸盐缓冲液（pH 7.0）洗涤沉淀。
4. 脱盐：将沉淀溶于适量的水，加入适量的三氯乙酸，使蛋白质变性，去除杂质。
5. 纯化：将变性后的蛋白质溶液透析，去除三氯乙酸和硫酸铵。
6. 蛋白质复性：将透析后的蛋白质溶液加入适量的磷酸盐缓冲液（pH7.0），使蛋白质复性。
7. 检测：采用SDS-PAGE方法检测纯化后的胰蛋白酶。
五、实验结果与分析1. 盐析：在胰蛋白酶溶液中加入硫酸铵后，溶液出现白色沉淀，说明胰蛋白酶已经盐析。
2. 沉淀收集：通过抽滤，收集到白色沉淀，表明胰蛋白酶已经沉淀。
3. 脱盐：加入三氯乙酸后，沉淀溶解，表明蛋白质已经变性。
4. 纯化：透析后的蛋白质溶液中，SDS-PAGE电泳结果显示，只有一个明显的条带，说明胰蛋白酶已经纯化。
5. 蛋白质复性：复性后的胰蛋白酶溶液中，SDS-PAGE电泳结果显示，蛋白条带清晰，说明蛋白质已经复性。
六、实验结论本实验采用硫酸铵盐析法对胰蛋白酶进行纯化，成功地将胰蛋白酶从粗品中分离出来，并通过SDS-PAGE电泳检测，证明纯化后的胰蛋白酶具有较高的纯度。
蛋白酶抑制剂的研究进展
蛋白酶抑制剂的研究进展郭川微生物专业，200326031摘要：自然界共发现四大类蛋白酶抑制剂:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和酸性蛋白酶抑制剂，本文就各大类蛋白酶抑制剂的结构特点，活性部位的研究概况及其在各领域应用的原理及进展。
关键词：蛋白酶抑制剂；结构；应用天然的蛋白酶抑制剂(ＰＩ)是对蛋白水解酶有抑制活性的一种小分子蛋白质,由于其分子量较小,所以在生物中普遍存在。
它能与蛋白酶的活性部位和变构部位结合,抑制酶的催化活性或阻止酶原转化有活性的酶。
在一系列重要的生理、病理过程中:如凝血、纤溶、补体活化、感染、细胞迁移等，PI发挥着关键性的调控作用,是生物体内免疫系统的重要组成部分。
从Ｋｕｎｉｔｚ等最早分离纯化出一种ＰＩ至今,已有多种ＰＩ被发现,根据其作用的蛋白酶主要分以下几类:抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等的丝氨酸蛋白酶抑制剂,抑制木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等的巯基蛋白酶抑制剂,抑制胃蛋白酶、组织蛋白酶Ｄ等的羧基蛋白酶抑制剂、抑制胶原酶、氨肽酶等的金属蛋白酶抑制剂等。
而根据作用于酶的活性基团不同及其氨基酸序列的同源性,可将自然界发现的PI分为四大类:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂(半胱氨酸蛋白酶抑制剂)、金属蛋白酶抑制剂和酸性蛋白酶抑制剂[1]。
1 结构与功能1.1丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serine Protease Inhibitor,Serpin）丝氨酸蛋白酶抑制剂是一族由古代抑制剂趋异进化5亿年演变而来的结构序列同源的蛋白酶抑制剂。
Sepin为单一肽链蛋白质。
各种serpin大约有30％的同源序列，疏水区同源性高达70％。
血浆中的serpin多被糖基化，糖链经天东酰胺的酰胺基与主链相连。
位于抑制性serpin表面、距C端30～40个氨基酸处的环状结构区RSL（reactive site loop）中，存在能被靶酶的底物识别位点识别的氨基酸P1[2]；近C端与P1相邻的氨基酸为P1’，依此类推，即肽链结构表示为N端-P15～P9～P1-P1’～P9’～P15’-C端。
蛋白质分离纯化实验论文样板
胰蛋白酶的分离纯化及动力学研究摘要胰蛋白酶的分离纯化及动力学研究，包括胰蛋白酶亲和配基CHOM的制备，胰蛋白酶的亲和层析分离纯化，凝胶电泳鉴定及分子量测定，胰蛋白酶的动力学研究等。
分离纯化蛋白质是研究蛋白质结构、化学组成和生物功能的基础。
根据蛋白质的不同性质，分离纯化的方法也是不同的。
关键词：分离定量亲和层析凝胶电泳动力学研究目录摘要 (I)1、蛋卵粘蛋白的分离与定量 (1)1.1蛋白质沉淀法 (1)1.2高速离心法 (1)1.3蛋白质脱盐 (1)1.4蛋白质定量 (2)1.5蛋白质标准曲线制作及CHOM浓度测定 (2)2、亲和层析法分离纯化胰蛋白酶 (3)2.1亲和层析法 (3)2.1.1亲和层析法的介绍 (3)2.1.2亲和层析法的各项要素 (3)2.2胰蛋白酶活性测定 (3)2.2.1酶活力的测定 (3)2.2.2胰蛋白酶活力测定 (3)2.2.3N-苯甲酰-L-精氨酸乙脂（BAEE）法 (4)2.2.4酪蛋白法 (4)3、胰蛋白酶的凝胶电泳鉴定 (5)3.1蛋白电泳槽的组装 (5)3.2凝胶的选择和制备 (5)3.3样品的处理 (6)3.4电泳 (6)3.5染色与脱色 (6)3.6实验结果及处理 (7)4、胰蛋白酶动力学研究 (8)4.1胰蛋白酶的酶促反应的米氏常数 Km 及最大速率 V 的测定 8 4.1.1绘制时间-光吸收关系曲线法 (8)4.2终止法测定胰蛋白酶的Km、最大速率 V 及胰蛋白酶抑制剂的动力学研究 (8)5、总结............................ 错误!未定义书签。
参考文献........................... 错误!未定义书签。
谢辞 (13)1 蛋卵粘蛋白的分离与定量材料：新鲜鸡蛋，透析袋操作：1.1蛋白质沉淀法在各种分离方法中，沉淀法是常用在前面的几个步骤，尤其很多方便的沉淀方法，可以有效地将蛋白质从粗提液中分离出来。
①硫酸铵沉淀法：每个蛋白质溶液分子表面上，都分布有若干比例的非极性区域，会凝集许多水分子以便溶入水溶液中；若在此水溶液加入大量硫酸铵，则因为硫酸铵的高度水合能力，抢走聚集在蛋白质表面的水分子，使得蛋白质表面的非极性区域暴露出来，相互以疏水性引力结合，并成为聚合体而沉淀下来。
酶抑制法实验报告
一、实验目的1. 理解酶抑制法的原理和操作步骤。
2. 掌握酶抑制剂的筛选和应用。
3. 学习如何通过酶活性测定来评估抑制剂的效果。
二、实验原理酶抑制剂是一种能够降低酶催化反应速率的物质。
根据抑制剂与酶的结合方式，可分为可逆性抑制剂和不可逆性抑制剂。
可逆性抑制剂包括竞争性抑制剂和非竞争性抑制剂。
本实验主要研究竞争性抑制剂对酶活性的影响。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 纯酶样品- 底物溶液- 竞争性抑制剂溶液- 非竞争性抑制剂溶液- pH缓冲溶液- 温度控制装置- 酶活性测定仪2. 实验仪器：- 移液器- 移液管- 容量瓶- 烧杯- 恒温水浴锅- 酶活性测定仪四、实验方法与步骤1. 酶活性测定：- 将酶样品与底物溶液按一定比例混合，在适宜的pH和温度条件下进行反应。
- 使用酶活性测定仪测定反应体系中酶活性的变化。
2. 竞争性抑制剂筛选：- 在酶活性测定过程中，逐步加入竞争性抑制剂溶液，观察酶活性变化。
- 记录不同浓度抑制剂下的酶活性数据。
3. 非竞争性抑制剂筛选：- 在酶活性测定过程中，逐步加入非竞争性抑制剂溶液，观察酶活性变化。
- 记录不同浓度抑制剂下的酶活性数据。
4. 结果分析：- 根据实验数据，绘制酶活性与抑制剂浓度的关系曲线。
- 分析竞争性抑制剂和非竞争性抑制剂对酶活性的影响。
五、实验结果与分析1. 竞争性抑制剂筛选结果：- 随着竞争性抑制剂浓度的增加，酶活性逐渐降低。
- 在一定浓度范围内，酶活性与抑制剂浓度呈负相关。
2. 非竞争性抑制剂筛选结果：- 随着非竞争性抑制剂浓度的增加，酶活性逐渐降低。
- 非竞争性抑制剂对酶活性的影响与竞争性抑制剂不同，表现为酶活性与抑制剂浓度的非线性关系。
3. 结果分析：- 竞争性抑制剂通过竞争底物与酶的结合，降低酶活性。
- 非竞争性抑制剂通过与酶的其他部位结合，改变酶的结构，从而降低酶活性。
六、实验结论1. 酶抑制法是一种有效的研究酶活性调控的方法。
2. 竞争性抑制剂和非竞争性抑制剂对酶活性有显著影响。
西安大学生物工程学院2020级《生物化学》考试试卷(27)
西安大学生物工程学院2020级《生物化学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（50分，每题5分）1. 雌激素和雄激素虽然都是胆固醇的衍生物，但在机体内不能互相转变。
（）答案：错误解析：2. 组氨酸是人体的一种半必需氨基酸。
（）答案：正确解析：组氨酸和精氨酸是人体的半必需氨基酸，人体可合成一部分，但合成量甚少，不足维持正常生理，需由鱼肉供给一部分，故称半必需氨基酸。
3. D葡萄糖的对映体为L葡萄糖，后者存在于自然界。
（）答案：错误解析：4. DNA用高氯酸在100℃处理1h可得到碱基，因此常用此方法来分析测定核酸的碱基组成。
（）答案：正确解析：5. 某物质的水解产物对260nm的紫外光有强吸收，地衣酚及二苯胺试验阴性，可以断定此物质为非核酸物质。
（）答案：正确解析：6. tRNA的二级结构是倒“L”形，三级结构是三叶草形。
（）答案：错误解析：7. HIV蛋白酶与胃蛋白酶一个主要的差别是后者的活性中心位于一个单一的亚基上，而前者的活性中心由两个亚基参与构建。
（）答案：正确解析：8. 核酶只能以RNA为底物进行催化反应。
（）答案：错误解析：9. 生物体的不同组织中的DNA，其碱基组成也不同。
（）答案：错误解析：DNA的组成具有种的特异性，但无法组织和器官特异性。
10. 某酶对底物的Km＝1.0×10－6molL，当[S]＝0.1molL时，该酶催化的反应速度已达至Vmax。
（）答案：正确解析：2、名词解释题（25分，每题5分）1. 蛋白质三级结构答案：蛋白质的三级结构盘绕指多肽链在二级结构的基础上进一步是、折叠成复杂的空间布局，包括肽链中一切原子的空间排列方式，即原子在分子中的方格空间排列和组合的方式。
维系三级结构的力有布佐克作用、氢键、范德华力、离子键。
亲和层析法
第二节 操 作
一、基质的选择 理想的基质应满足下面的要求: 1．极低的非特异吸附性； 2．高度的亲水性。
亲和吸附剂要易与水溶液中的生命大分子物 质接近。 3．较好的理化稳定性。
当配体固化和各种因素(如pH、离子强度、 温度和变性剂等)变化时，基质很少甚至不受 影响；
4．大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配 体结合；
无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤 出来，并形成了第一个层析峰；
然后，恰当地改变起始缓冲液的
pH值、
或增加离子强度、
或加入抑制剂等因子，
即可把物质S从固相载体上解离下来，并形成了第 二个层析峰(见图7-2B)。
如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲 和力(其大小有差异)时,
抑制剂、 效应物、 酶的辅助因子、 类似底物、 抗体[包括半抗原(碱基、核苷、核苷酸、寡核苷酸)蛋白质复合物抗体]、 其他物质(如外源凝集素、polyA.polyU、染料和金属 离子)等。
优良的配体须具备两个条件:
1）与纯化的物质有较强亲和力
一般来说，
配体对大分子物质的亲和力越高(即Ki（抑制常数） 或Ka（解离常数）较小)，在亲和层析中应用的价值 就越大。
•
B. 剧烈的洗脱条件(蛋白质变性剂)
• 如用盐酸胍、尿素等变性试剂配制的溶液洗脱下的 蛋白质等生命大分子物质；需要经过适当的处理方可 恢复活性。
六、亲和层析柱的再生
当洗脱结束后, 应连续用大量的洗脱液或 高浓度的盐溶液彻底洗涤柱子, 接着再 用平衡缓冲液使层析柱重新平衡。
经过这样处理的柱子可再次上样, 进行第 二次亲和层析。
样品的浓度、pH值、离子强度以及上样的速度等因 子对其影响也不可轻视。 若选择得当, 则可提高固相载体对欲分离物的亲和力。