第二章-菌种选育、保藏与复壮
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第二章 酒精生产所用的微生物菌种
4
2-1-2 酒精发酵菌种
二、糖蜜原料生产酒精常用酵母菌 F396（台湾396）、As.2.1189（古巴Ⅰ） As.2.1189（古巴 Ⅱ）Rasse
5
2-1-3 菌种培养基的制备
米曲汁培养基的制备（霉菌、酵母）
大米→浸泡→蒸米→冷却→接种→培养→米曲
→加水→保温糖化→过滤 →米曲汁 麦芽汁培养基的制备（霉菌、酵母） 麦芽粉→加水→保温糖化→过滤→麦芽汁
10
第二章 酒精生产所用的微生物菌种
第一节 常用菌种及其培养特性 第二节 生产菌种的选育、保藏与复壮1Βιβλιοθήκη 2-1 常用菌种及其培养特性
2-1-1 淀粉糖化菌种 一、曲霉 1.黑曲霉 UV-11(As.3.4309),萌发期较 长;UV11-48,萌发期较短 2.乌沙米曲霉 东酒一号的出发菌株、含丹 宁酶、耐酸 3.黄曲霉 4.米曲霉 As3.951（沪酿3042） 蛋白酶活性较强，常用于制造酱油及制备米曲汁
2
2-1-1 淀粉糖化菌种
二、根霉 黑根霉 米根霉 华根霉 三、细菌 枯草杆菌BF7658主要生产α-淀粉酶 发酵运动单胞菌-通过ED途径发酵葡萄糖、 蔗糖生产乙醇 耐热纤梭菌-直接利用纤维素、半纤维素产 乙醇 耐热糖梭菌-利用五碳糖产乙醇
3
2-1-2 酒精发酵菌种
一、淀粉质原料常用的酵母菌 1.拉斯2号（RasseⅡ）发酵玉米，有泡沫 2.拉斯12号（Rasse Ⅻ） 3.K字酵母 多用于薯干、高粱等原料 4. 1300（南阳5号酵母） 5. 1308（南阳混合酵母）适于含丹宁的原料 6.H5-2 耐高温酵母，达40度，发酵速度快 7.耐高温活性干酵母（Angel 安琪-湖北宜昌）
6
2-1-3 菌种培养基的制备
察氏合成培养基的制备 （霉菌) 蔗糖3.0 NaNO30.3 K2HPO40.1 KCL0.05 MgSO40.05 FeSO40.001 小米试管培养基的制备 （霉菌)
2-1-2 酒精发酵菌种
二、糖蜜原料生产酒精常用酵母菌 F396（台湾396）、As.2.1189（古巴Ⅰ） As.2.1189（古巴 Ⅱ）Rasse
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2-1-3 菌种培养基的制备
米曲汁培养基的制备（霉菌、酵母）
大米→浸泡→蒸米→冷却→接种→培养→米曲
→加水→保温糖化→过滤 →米曲汁 麦芽汁培养基的制备（霉菌、酵母） 麦芽粉→加水→保温糖化→过滤→麦芽汁
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第二章 酒精生产所用的微生物菌种
第一节 常用菌种及其培养特性 第二节 生产菌种的选育、保藏与复壮1Βιβλιοθήκη 2-1 常用菌种及其培养特性
2-1-1 淀粉糖化菌种 一、曲霉 1.黑曲霉 UV-11(As.3.4309),萌发期较 长;UV11-48,萌发期较短 2.乌沙米曲霉 东酒一号的出发菌株、含丹 宁酶、耐酸 3.黄曲霉 4.米曲霉 As3.951（沪酿3042） 蛋白酶活性较强，常用于制造酱油及制备米曲汁
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2-1-1 淀粉糖化菌种
二、根霉 黑根霉 米根霉 华根霉 三、细菌 枯草杆菌BF7658主要生产α-淀粉酶 发酵运动单胞菌-通过ED途径发酵葡萄糖、 蔗糖生产乙醇 耐热纤梭菌-直接利用纤维素、半纤维素产 乙醇 耐热糖梭菌-利用五碳糖产乙醇
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2-1-2 酒精发酵菌种
一、淀粉质原料常用的酵母菌 1.拉斯2号（RasseⅡ）发酵玉米，有泡沫 2.拉斯12号（Rasse Ⅻ） 3.K字酵母 多用于薯干、高粱等原料 4. 1300（南阳5号酵母） 5. 1308（南阳混合酵母）适于含丹宁的原料 6.H5-2 耐高温酵母，达40度，发酵速度快 7.耐高温活性干酵母（Angel 安琪-湖北宜昌）
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2-1-3 菌种培养基的制备
察氏合成培养基的制备 （霉菌) 蔗糖3.0 NaNO30.3 K2HPO40.1 KCL0.05 MgSO40.05 FeSO40.001 小米试管培养基的制备 （霉菌)
菌种的保藏与复壮
噬菌体（phage）是病毒的 一种。 噬菌体在寄主细胞中的生 长繁殖过程可分为吸附、浸入 、增殖、成熟和释放。
C：藻类（algaቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ： 培养螺旋藻，每公顷可收获60吨，而种植大豆每公顷才 可获4吨；从蛋白质产率来看，螺旋藻是大豆28倍。
还可通过藻类将CO２转变为石油，培养单胞藻或其他藻
类而获得的石油，可占细胞干重得5%-50%，合成的油与重 油相同，加工后可转变汽油、煤油等产品。还可减轻因工业 生产而大量排放CO２造成的温室效应。 国外还有人从“藻类农场”获取氢能的报道，大量培养 藻类，利用其光合放氢作用来取得氢能。
红酵母
面包酵母
3、霉菌
• 曲霉属
• 应用：生产有机酸、生产淀粉酶、果胶酶、 葡萄糖氧化酶
• 应用：酱油、酱类（淀粉酶）
• 米曲霉 • 应用：产糖化酶和蛋白 酶、主要用于酿酒制曲 和酱油制曲
应用：生产甲义丁二 酸
毛
霉
• 应用：可以产生蛋白酶，我国多用于豆腐 乳、豆豉等的制作
• 根霉
• 种类：米根霉、华根霉、少根根霉、爪哇根霉 • 应用：酿酒
• 微生物主要来自土壤。
• 寻找已经适应苛刻环境压力的微生物类群
• 例如：从盐场分离嗜盐链霉菌，从污泥中 分离甲烷菌，从酒糟中分离酵母菌等。
2、微生物样品富集培养
• 含有目的菌较多的土样不需要富集培养 • 如果原有样品中目的菌含量低，可以人为地添加相应的 基质，培养使之以较其它微生物更快的速度生长繁殖， 从而提高它们在样品中的比例，便于分离。 • 富集培养的一般方法：采用有利于目的菌种而不利于无 关微生物的营养和培养条件，以达到使目的菌种在群体 中比例上升的目的。 • 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或 者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这 一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可 能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。 • 一些有特定物质产生能力的菌种，不容易富集，只有通 过大量艰苦的工作筛选取得。
第二章 菌种的筛选、选育和保藏
1、能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高 效地合成产物。 2、有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌 种改造的可操作性要强。 3、遗传性能要相对稳定。 4、不易感染它种微生物或噬菌体。 5、产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上 最好与致病菌无关）。 6、生产特性要符合工艺要求。
菌种的筛选、选育和保藏
造成变异的原因是有： 长期保藏，频繁的传代，菌体在代谢过程中产生具有诱变 作用的物质，诱发DNA结构的改变。DNA中存在的增变基因 也可能诱发自然突变等。 由于引起变异的因素一般不很剧烈，而且变异了的基因要 通过繁殖时DNA复制传给子代，使突变基因在数量上增加 到占优势时，才能使群体表现出性状的变异来，可以看出 这是一个缓慢渐变的过程。
发酵工业菌种的分离、筛选 二、菌种获得的途径
1、从菌种保存机构直接购买 2、从自然界中筛选 3、在生产过程中发酵分离筛选的步骤
定方案--样品采集--样品预处理--目的菌富集培养-菌种分离--菌种初筛--菌种复筛--菌种发酵性能鉴定
菌种的筛选、选育和保藏
发酵工业菌种的分离、筛选 定方案
菌种的筛选、选育和保藏
菌种的选育 （一）、诱变剂和诱变处理（见书P38） 物理诱变剂：射线如紫外线、X—射线、γ—射线，
快中子； 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。 许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、 中小型工厂都适用，也很安全。 其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一 般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险 性。
目的:经过富集的微生物虽然在数量上占优势,但是得到的 培养物还是多种微生物的混合物,所以需要进行菌种的分 离。 常用的分离方法有： 1、平板划线分离法 2、稀释分离法 3、简单平板分离法 4、涂布分离法 5、毛细管分离法 6、小滴分离法
菌种的筛选、选育和保藏
造成变异的原因是有： 长期保藏，频繁的传代，菌体在代谢过程中产生具有诱变 作用的物质，诱发DNA结构的改变。DNA中存在的增变基因 也可能诱发自然突变等。 由于引起变异的因素一般不很剧烈，而且变异了的基因要 通过繁殖时DNA复制传给子代，使突变基因在数量上增加 到占优势时，才能使群体表现出性状的变异来，可以看出 这是一个缓慢渐变的过程。
发酵工业菌种的分离、筛选 二、菌种获得的途径
1、从菌种保存机构直接购买 2、从自然界中筛选 3、在生产过程中发酵分离筛选的步骤
定方案--样品采集--样品预处理--目的菌富集培养-菌种分离--菌种初筛--菌种复筛--菌种发酵性能鉴定
菌种的筛选、选育和保藏
发酵工业菌种的分离、筛选 定方案
菌种的筛选、选育和保藏
菌种的选育 （一）、诱变剂和诱变处理（见书P38） 物理诱变剂：射线如紫外线、X—射线、γ—射线，
快中子； 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。 许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、 中小型工厂都适用，也很安全。 其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一 般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险 性。
目的:经过富集的微生物虽然在数量上占优势,但是得到的 培养物还是多种微生物的混合物,所以需要进行菌种的分 离。 常用的分离方法有： 1、平板划线分离法 2、稀释分离法 3、简单平板分离法 4、涂布分离法 5、毛细管分离法 6、小滴分离法
d2 菌种的保藏与复壮
第二章 菌种选育、保藏与复壮
• 菌种是发酵与酿造必不可少的，其活性和纯度是发酵
工作的顺利进行的保证。在发酵与酿造工业中必须
选择适宜的菌种
选育生产性能良好的菌株
做好菌种的保藏。 • 菌种经长期使用和保存会发生变异造成退化，导致其 形状和生产能力的下降。 发酵和酿造还要进行菌种的纯化与复壮。
1
第一节 菌种选育
1.5cm)—→橡皮塞封口—→-4～４℃保藏
• 适应对象：不产孢子，不以石蜡为碳源的菌种
• 优点：保存时间较长，1～2年
• 缺点：有的菌种对石蜡敏感，不适合用此法
9
（三）干燥保藏
• 干燥饱藏法：使菌处于干燥条件下停止生长及处于 休眠状态，达到较长期保藏的目的。
• 适应对象：细菌芽孢或产分生孢子的菌种（在发酵
0.5ml液体培养基——悬液——斜面或液体培
养基进行培养。
20
冷冻干燥保护剂
分类 名称
酸性化合物
中性化合物 碱性化合物
谷氨酸、天冬氨酸、苹果酸、乳糖酸
葡萄糖、乳糖、蔗糖、鼠李糖、山梨醇、木 糖醇、肌醇、DL-苏氨酸 赖氨酸、苏氨酸
高分子化合物 白蛋白、明胶、蛋白胨、肉膏、酵母膏、可
及其分解产物 溶性淀粉、糊精、葡聚糖、羧甲基纤维素、
恢复其生产性能？
32
工业中常用）。
为了转接方便，控制接种量以及对菌种的保护，
常将菌种的分生孢子、芽孢、菌丝体吸附于一些 载体表面，放至干燥容器里进行干燥，所用载体
有沙土、滤纸、硅胶及大(小)米等。
• 特点：保存时间长
10
1.沙土管法
• 方法： 河(海)沙，过0.78mm(24目)筛，用10％盐酸浸泡24h，清水 冲洗至pH呈中性，烘干。 菜园或果园土粉碎过筛，烘干。 烘 干 的 沙 土 按 3:2 或 1:1 混 合 装 入 指 形 管 或 小 试 管
• 菌种是发酵与酿造必不可少的，其活性和纯度是发酵
工作的顺利进行的保证。在发酵与酿造工业中必须
选择适宜的菌种
选育生产性能良好的菌株
做好菌种的保藏。 • 菌种经长期使用和保存会发生变异造成退化，导致其 形状和生产能力的下降。 发酵和酿造还要进行菌种的纯化与复壮。
1
第一节 菌种选育
1.5cm)—→橡皮塞封口—→-4～４℃保藏
• 适应对象：不产孢子，不以石蜡为碳源的菌种
• 优点：保存时间较长，1～2年
• 缺点：有的菌种对石蜡敏感，不适合用此法
9
（三）干燥保藏
• 干燥饱藏法：使菌处于干燥条件下停止生长及处于 休眠状态，达到较长期保藏的目的。
• 适应对象：细菌芽孢或产分生孢子的菌种（在发酵
0.5ml液体培养基——悬液——斜面或液体培
养基进行培养。
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冷冻干燥保护剂
分类 名称
酸性化合物
中性化合物 碱性化合物
谷氨酸、天冬氨酸、苹果酸、乳糖酸
葡萄糖、乳糖、蔗糖、鼠李糖、山梨醇、木 糖醇、肌醇、DL-苏氨酸 赖氨酸、苏氨酸
高分子化合物 白蛋白、明胶、蛋白胨、肉膏、酵母膏、可
及其分解产物 溶性淀粉、糊精、葡聚糖、羧甲基纤维素、
恢复其生产性能？
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工业中常用）。
为了转接方便，控制接种量以及对菌种的保护，
常将菌种的分生孢子、芽孢、菌丝体吸附于一些 载体表面，放至干燥容器里进行干燥，所用载体
有沙土、滤纸、硅胶及大(小)米等。
• 特点：保存时间长
10
1.沙土管法
• 方法： 河(海)沙，过0.78mm(24目)筛，用10％盐酸浸泡24h，清水 冲洗至pH呈中性，烘干。 菜园或果园土粉碎过筛，烘干。 烘 干 的 沙 土 按 3:2 或 1:1 混 合 装 入 指 形 管 或 小 试 管
《发酵食品工艺学》复习提纲2020
第二章菌种选育、保藏与复壮（一）复习思考题1、什么是菌种选育？优良菌种选育的方法主要有哪些？3、微生物菌种保藏的目的（3个）、原理（2点）及常用的保藏方法（7种）。
4、造成菌种退化的原因是什么？生产中如何防止菌种的退化？（二）生产工艺流程第三章微生物的代谢调控理论及其在食品发酵中的应用（一）复习思考题1、什么是微生物代谢？微生物代谢过程的自我调节主要表现在哪些环节上？3、微生物代谢的反馈调节作用主要有哪些类型？在发酵生产中如何克服微生物代谢的反馈调节作用？（1）类型：反馈抑制和反馈阻遏（2）措施：1.改变微生物的遗传特性；2. 控制发酵的工艺条件；3.改变细胞膜的渗透性4、什么是代谢控制发酵？在发酵生产中改变微生物遗传特性来调控代谢的方法有哪些？5、通过控制细胞膜渗透性来提高发酵产物产量的原理是什么？（二）生产工艺流程第四章发酵工程学基础（一）复习思考题6、根据你所学的发酵工艺学知识，简述补料分批发酵的主要应用领域有哪些？7、发酵过程中引起发酵液温度变化的因素有哪些？对发酵过程有何影响？生产上发酵温度选择的依据是什么？（1）因素：生物热、搅拌热、辐射热、蒸发热（2）影响：温度影响细胞酶的活性、发酵液的性质、代谢产物的合成方向。
（3）依据：综合考虑微生物最适生长温度、发酵产物生成、通气条件等因素。
8、发酵液中溶解氧浓度对发酵过程有何影响？生产上如何控制发酵液溶解氧浓度？（1）影响：溶氧过高会引起能量过度消耗并对细胞产生危害、抑制代谢产物的合成、影响培养基的电位；溶氧过低影响微生物的呼吸，造成代谢异常。
（2）措施：配置搅拌叶和挡板，分散气体；改变通气量和搅拌速度，控制溶氧速率；控制发酵液黏度，改变传质阻力。
9、发酵过程中引起发酵液pH变化的因素有哪些？对发酵过程有何影响？生产上如何控制发酵液pH？（1）因素：①引起发酵液pH下降的因素—碳源过多、消泡油加多、生理酸性物质过多；②引起发酵液pH上升的因素—氮源过多、生理碱性物质过多、中间补料时，碱性物质添加过多。
第二章-菌种选育、保藏与复壮
第二章
菌种选育、保藏与复壮
Contents
第一节 食品发酵与酿造工业菌种 第二节 菌种选育 第三节 菌种保藏与复壮 第四节 国内外主要菌种保藏机构
第一节 食品发酵与酿造工业菌种
一、现代发酵工业对菌种的要求
（1）非病源菌，不产生有害活性物或毒素；
（2）发酵周期短，发酵产物的产生能力强；
（3）高转化，易分离纯化，低成本，高质量；
冷冻真 空干燥
低温(-20℃以 下)、干燥、 缺氧
除少数不产孢 子只产菌丝体 的丝状真菌外 均可
5-10年
保藏期长，成活 率高
需特定设备、 操作繁琐,要求 严格
液氮超低 温
2024/7/17
超低温 (-150～196℃)
各类微生物
10年以上
保存时间长
需特殊设备， 操作复杂
51
第四节 国内外主要菌种保藏机构
❖ 广义—— 是指在菌种的生产性状尚未衰退前， 就经常有意识的进行纯种分离和生产性能的 测定，从而使菌种的生产性能逐步提高的一 种措施。
❖ 狭义—— 指菌种已经发生衰退后，再通过纯 种分离和性能测定的办法从衰退的群体中找 出尚未衰退的个体，以达到保持该菌种原有 典型性状的一种措施。
❖ 复壮的方法
（一）纯种分离
❖ 菌种退化的主要表现 ① 产量下降，目的代谢产物减少，原料转化率下降； ② 生长速度缓慢，目的代谢产物合成能力下降，发酵周期延长； ③ 产孢子能力变弱，孢子形成数量减少； ④ 抗逆性减弱； ⑤ 形态畸形等。
（一）引起菌种退化变异的因素
❖ 遗传基因型的分离
丝状真菌、多细胞组成、有的单核、有的多核，遗传物质基础有多样性的复 杂性，为群体繁殖，往往出现遗传基因型的分离---数量遗传的自体调节现象。
菌种选育、保藏与复壮
Contents
第一节 食品发酵与酿造工业菌种 第二节 菌种选育 第三节 菌种保藏与复壮 第四节 国内外主要菌种保藏机构
第一节 食品发酵与酿造工业菌种
一、现代发酵工业对菌种的要求
（1）非病源菌，不产生有害活性物或毒素；
（2）发酵周期短，发酵产物的产生能力强；
（3）高转化，易分离纯化，低成本，高质量；
冷冻真 空干燥
低温(-20℃以 下)、干燥、 缺氧
除少数不产孢 子只产菌丝体 的丝状真菌外 均可
5-10年
保藏期长，成活 率高
需特定设备、 操作繁琐,要求 严格
液氮超低 温
2024/7/17
超低温 (-150～196℃)
各类微生物
10年以上
保存时间长
需特殊设备， 操作复杂
51
第四节 国内外主要菌种保藏机构
❖ 广义—— 是指在菌种的生产性状尚未衰退前， 就经常有意识的进行纯种分离和生产性能的 测定，从而使菌种的生产性能逐步提高的一 种措施。
❖ 狭义—— 指菌种已经发生衰退后，再通过纯 种分离和性能测定的办法从衰退的群体中找 出尚未衰退的个体，以达到保持该菌种原有 典型性状的一种措施。
❖ 复壮的方法
（一）纯种分离
❖ 菌种退化的主要表现 ① 产量下降，目的代谢产物减少，原料转化率下降； ② 生长速度缓慢，目的代谢产物合成能力下降，发酵周期延长； ③ 产孢子能力变弱，孢子形成数量减少； ④ 抗逆性减弱； ⑤ 形态畸形等。
（一）引起菌种退化变异的因素
❖ 遗传基因型的分离
丝状真菌、多细胞组成、有的单核、有的多核，遗传物质基础有多样性的复 杂性，为群体繁殖，往往出现遗传基因型的分离---数量遗传的自体调节现象。
2菌种选育、保藏与复壮
六、基因工程技术
▪ DNA重组技术 ▪ DNA重组技术的基本程序 ▪ DNA重组的操作
基因的剪刀——限制性内切酶
基因的针线——DNA连接酶
▪ 黏性末端：被限制酶切开的DNA两条单链的切口， 带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对， 这样的切口叫做黏性末端。
▪ DNA连接酶：两种来源不同的DNA用同一种限制 酶来切割，然后让两者的黏性末端通过互补的碱 基黏合起来，DNA连接酶在断口处把两条DNA末 端之间的缝隙“缝合“起来——形成共价键。
孟德尔（G. J. Mendel 1822-1884 ）
（2）摩尔根 果蝇试验
美国的生物学家与遗 传学家，发现染色体的 遗传机制，创立染色体 遗传理论，现代实验生 物学奠基人。 1933年，摩尔根获得 诺贝尔生理医学奖。
J. H. Morgan(1866-1945)
（3）1868年，年轻的瑞 士化学家、医生米歇尔 （Miesher,F.1844～ 1895）从细胞核中分离 出核酸。
第二章 菌种选育、保藏与复壮
▪ 菌种选育 ▪ 菌种保藏与复壮 ▪ 国内外主要的菌种保藏机构
第一节 菌种选育
▪ 一、微生物菌种选育的理论基础 ▪ （一）微生物的遗传性和变异性 ▪ 遗传 ▪ 变异 ▪ 微生物的遗传性和变异性的特点
（二）遗传变异的物质基础
1.研究的历史 （1）孟德尔 豌豆试验
奧地利 遗传学 家、修 道士孟 德尔
（一）突变： 自发突变 诱发突变 定向育种
（二）诱变的基本原理 ▪ 1.诱变剂
物理诱变剂 诱变剂 化学诱变剂
生物诱变剂
2. 诱变剂作用机理
（1）物理诱变因子诱变机理 （2）化学诱变剂诱变机理 （3）生物诱变剂诱变机理
菌种保藏与复壮
学习情景2-4
菌种保藏与复壮
一、菌种保藏
（一）保藏目的及原理 （二）常用保藏法 （三）保藏注意
二、菌种复壮
(一）菌种的衰退 （二）复壮方法 （三）防衰措施
返回本章
一、菌种保藏
（一）保藏目的及原理 目的 不死亡 不生长 不污染 使菌种 不降低或不丧失其优良性 原理
以尽量延长使用时间
创造不利于菌种生长的一切条件， 使其代谢处于休眠状态。
返回本节
返回本章
口堵胶塞 淹没斜面约1cm
用时转管再转管
返回本节
返回本节
3.自然基质保藏法
麦粒浸透、煮熟 基质的处理 麸皮拌湿 装管
灭菌
接种
培养
干燥器去水
防衰老 特点 保藏时间长 转接后生长旺 易污染，灭菌要彻底
返回本节
（三）保藏注意
用保种培养基
及时保藏（菌丝占斜面2/3）
最好换胶塞 用时活化
严防棉塞受潮
返回本节
二、菌种的复壮
概念 确保或恢复菌种优良性能的措施
（一）菌种的衰退 表现 形态改变、生长慢、 抗逆性差、产量及质量下降 内因 菌种的遗传物质发生了负变 外因 传代过多，条件不适宜
返回本节
根源
（二）复壮法 组织分离 母种 孢子分离
1.繁殖交替法
再生 母种
栽培
子实体
2. 经常改变培养条件 3.转管时只取Leabharlann 端菌丝返回本节低温
缺营养
不利 条件
干燥
无氧
返回本节
（二）常用保藏法 以母种形式保藏 1.斜面低温法 斜面菌种置4~6℃冰箱中（3~6个月） 简便 保藏时间短 易污染及退化 不适于草菇等菌类
特点
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菌种保藏与复壮
一、菌种保藏
（一）保藏目的及原理 （二）常用保藏法 （三）保藏注意
二、菌种复壮
(一）菌种的衰退 （二）复壮方法 （三）防衰措施
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一、菌种保藏
（一）保藏目的及原理 目的 不死亡 不生长 不污染 使菌种 不降低或不丧失其优良性 原理
以尽量延长使用时间
创造不利于菌种生长的一切条件， 使其代谢处于休眠状态。
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口堵胶塞 淹没斜面约1cm
用时转管再转管
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3.自然基质保藏法
麦粒浸透、煮熟 基质的处理 麸皮拌湿 装管
灭菌
接种
培养
干燥器去水
防衰老 特点 保藏时间长 转接后生长旺 易污染，灭菌要彻底
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（三）保藏注意
用保种培养基
及时保藏（菌丝占斜面2/3）
最好换胶塞 用时活化
严防棉塞受潮
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二、菌种的复壮
概念 确保或恢复菌种优良性能的措施
（一）菌种的衰退 表现 形态改变、生长慢、 抗逆性差、产量及质量下降 内因 菌种的遗传物质发生了负变 外因 传代过多，条件不适宜
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根源
（二）复壮法 组织分离 母种 孢子分离
1.繁殖交替法
再生 母种
栽培
子实体
2. 经常改变培养条件 3.转管时只取Leabharlann 端菌丝返回本节低温
缺营养
不利 条件
干燥
无氧
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（二）常用保藏法 以母种形式保藏 1.斜面低温法 斜面菌种置4~6℃冰箱中（3~6个月） 简便 保藏时间短 易污染及退化 不适于草菇等菌类
特点
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自 然 选 育
05年江南大学微生物(发酵)考研试题
资料显示，某些芽孢杆菌具有分解和利 用葡聚糖的能力，请设计方案从自然界中筛选 一产葡聚糖酶的菌株，并简要分析各主要步骤 的依据。
三、诱变育种
诱变育种：指人为地、有意识地将对象生物置于诱变因子中， 使该生物体发生突变，从这些突变体中筛选具有优良性状的 突变株的过程。 提高了菌种发生突变的频率和变异幅度，提高获优机率。
由葡萄糖制造果糖
医药、食用 酵母菌体蛋白 食品工业 食用、医药
柑橘罐头脱除苦味
分解单宁、酶精制、酒精发酵工业 同枯草杆菌蛋白酶 葡萄糖制造、酒精厂糖化、医药 腐乳生产 蛋白除葡萄糖、脱氧、食品罐头贮存 淀粉和食品加工、饲料 食用、化工 葡萄糖制造、酒精厂糖化、调色剂
枯草芽孢杆菌
戊糖片球菌
植物乳杆菌
菌种种属的鉴定
• 鉴定工作的内容
（1）测定一系列必要的鉴定指标； （2）查找权威鉴定手册，确定菌种类型。
• 鉴定方法
（1）经典的分类鉴定方法：形态学特征；生理生化特征； 血清学试验与噬菌体分型；氨基酸顺序和蛋白质分析
（2）现代分类鉴定方法：微生物遗传型；细胞化学成分； 数值分类法
二、自然选育
自然选育的定义
（4）生长繁殖力强，速度快，较强产孢能力；
（5）原料广，价廉，易被微生物利用、转化；
（6）对添加的前体物质有耐受能力；
（7）菌种纯，遗传特性稳定，抗噬菌体能力强。
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二、现代发酵工业常见菌种
类别
细菌 酵母菌
霉菌
微生物名称 短杆菌 短杆菌 枯草杆菌 枯草杆菌 巨大芽孢杆
菌 酒精酵母 假丝酵母 脆壁酵母 黑曲霉
第二节 菌种选育
一、新菌种的分离与筛选
样品 采集
富集 培养
分离 纯化
性能 鉴定
样品来源越 广泛，获得 新菌种的可 能性越大。
利用人工环 境，使样品 中目标微生 物成为优势 菌。
纯种分离的 常用方法有 平板划线分 离法、稀释 分离法和涂 布分离法。
一般生产性 能的测定通 过初筛和复 筛的方法来 确定。
（一）样品采集
① 原则
样品来源越广泛，获得新菌种的可能性越大。
② 土壤采样方法
土壤的细有菌机、质放线含菌量：和耕通地风、状菜园况和（近5～郊土25壤cm；深度） 土壤的酵p母H和菌植：果被园状树况根的土壤中；
•pH＜7.0 ：霉菌、酵母菌居多 地理条霉件 菌：动植物残体及霉腐土层中； 季•p节H7条.0黑件～曲7.霉5：：细稻菌场、、谷放物线堆菌积丰处富。
黑曲霉
黑曲霉 栖土曲霉 根霉 毛霉 青霉菌 木霉菌 黄曲霉菌 红曲霉
产物 谷氨酸 肌苷酸 淀粉酶 蛋白酶
葡萄糖异构酶
酒精 单细胞蛋白 乳糖酶 柠檬酸 柚苷酶、酸性蛋白
酶 单宁酶、糖化酶 蛋白酶 糖化酶、甾体激素 蛋白酶 葡萄糖氧化酶 纤维素酶 淀粉酶 糖化酶、红曲色素
用途 食用、医药 食用、医药 葡萄糖、糊精、酒精发酵、啤酒酿造 酱油速酿、饲料
突变：在自然状况下发生的突变—自然突变（10-6~10-9） 诱变：人为地利用物理或化学因素诱发的突变（10-4~10-5） 诱变剂：能够显著提高突变频率的物理或化学因素。
（一）常见诱变剂及作用基本原理
物理诱变因子 紫外线、X射线、快中子等
化学诱变因子 硫酸二乙酯（DES）、亚硝酸、 吖啶橙
利用微生物在一定条件下产生自发变异，通过分离、筛选，排除劣质性 状的菌株，选择出维持原有生产水平或具有更优良生产性能的高产菌株， 达到纯化与复壮菌种、保持稳定生产性能的目的。其主要原理是微生物 群体分离。
自然选育的方法
（1）通过表现形态淘汰不良菌株； （2）考察目的代谢产物产量； （3）进行遗传基因型纯度试验，考察菌种纯度； （4）传代稳定性试验：斜面传3-5代。
生物诱变因子 噬菌体、转座子等
（二）诱变基本方法及影响因素
诱变剂的选择：作用机理；突变谱 诱变剂量选择：最适剂量（致死率70-80%时） 增效（变）剂：氯化锂（0.5%） 外部环境条件：如温度、氧气、pH、水分 出发菌株的选择：生产菌株、野生菌株 出发菌株的生理状态：细菌--对数生长期；幼年孢子；营养体；湿态敏
感（真菌：106 cfu/mL孢子悬浮液；细菌：108 cfu/mL的菌液） 诱变效应的测定：直接法和浓缩法，培养后测定目的产物量 诱变方法：单因子、复合诱变 优良突变株的筛选方法：随机筛选或半理性化筛选
多粘类芽孢杆菌
酿酒酵母
粉状毕赤酵母
红葡萄浓缩汁中的酵母菌形态
产朊假丝酵母
黑曲霉
黑曲霉
青霉
米曲霉
蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等
根霉
绿色木霉
产生微晶纤维素酶，羧甲基纤维素酶、纤维二糖酶，可完全水解纤维素。
拟康氏木霉
产生纤维素酶，羧甲基纤维素酶、纤维二糖酶，可完全水解纤维素。
第二章
菌种选育、保藏与复壮
Contents
第一节 食品发酵与酿造工业菌种 第二节 菌种选育 第三节 菌种保藏与复壮 第四节 国内外主要菌种保藏机构
第一节 食品发酵与酿造工业菌种
一、现代发酵工业对菌种的要求
（1）非病源菌，不产生有害活性物或毒素；
（2）发酵周期短，发酵产物的产生能力强；
（3）高转化，易分离纯化，低成本，高质量；
（三）纯种分离
（1）平板划线分离法 （2）稀释分离法 （3）涂布分离法 （4）毛细管分离法 （5）小滴分离法
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初筛和复筛
（1）初筛（定性——粗放！） ① 平板筛选 （变色圈、透明圈、生长圈、抑菌圈 ） ② 摇瓶发酵筛选
（2）复筛（定量——精确！） 1个菌株重复3～5瓶，精确分析 如酶活力单位、耐酒精程度等。
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溶磷细菌的平板筛选(5d)
高效溶磷的真菌菌株
青霉菌溶磷实验
（四）性能鉴定
生产性能测定
通常使用初筛和复筛的方法确定。直接从自然界分离
得到的菌株为野生型菌株。我们常将这些自然界中直
接获得的新菌株称为进一步育种工作的原始菌株或出
发菌株。 毒性试验
若毒性大而且无法排除者应予以淘汰。
（二）富集培养
① 富集培养的目的 利用人工环境，使样品中目标微
③ 富集培养的方式 分批培养（Batch culture ） 连续培养（Continuous culture ） 分批补料培养（Fed-batch culture ）