原核表达总结

原核表达之目的基因克隆
1.了解实验课题对目的蛋白的要求，包括：目的蛋白分子量有多大，表达目的（是蛋白结
晶、药剂结合还是制备抗体，不同目的对蛋白要求不同）；是否要其可溶；是胞内表达还是分泌表达，是组成型表达还是诱导型表达；另外，还要了解蛋白表达后需要采用什么样的方式进行纯化，纯化标签有多大，蛋白纯化后是否需要将标签去除（即标签的存在是否会影响蛋白的活性）。

还要对目的蛋白进行稀有密码子（仅限于真核生物基因通过原核表达系统表达时参考，注意稀有密码子的多少，位置5位或3位，稀有密码子是否成串出现等）和可溶性网上预测等。

稀有密码子预测网址：
.ru/eng/scripts/01_11.html
/~mmaduro/codonusage/usage.htm
/RACC/
/~sumchan/caltor.html
原核表达蛋白可溶性预测网址：
/
综合以上，选取合适的表达载体及宿主菌（做原核表达前对各种载体及宿主菌的充分了解是必须的，建议首先应阅读《默克原核表达宝典》）。

注意：不是所有的标签都是用来纯化蛋白的，有的标签有促进蛋白溶解的作用，有的则是二硫键形成或利于表达后蛋白的检测。

一般我们最常用的是胞内诱导型表达（即蛋白翻译后是存在于细胞内，通过加诱导物的方法来控制表达水平）。

2.搜索要表达的目的基因的序列，根据其编码区序列来设计引物；
注意：要注意在引物上加入限制性内切酶识别位点（首先应分析蛋白编码区内是否含有相同的内切酶识别位点），并通过查阅资料看两种酶（上下游引物分别加入酶切位点）是否可以在同一反应体系中起作用，并注意标签序列是在N端还是在C端，若要在C 端保留标签，则需要将下游引物的终止密码子替换掉；若要在引物上引入标签序列，则引物上应加入标签序列碱基（即在上游引物或下游引物处引入His的密码子）；另外，还要注意引物不能造成蛋白的编码框发生改变；
1，2步的分析至关重要，只有在完成前两步的工作后才可以进行后续的实验操作。

3.摇菌，进行RNA抽提（注意选取不同表现型的菌株），摇菌的时间一定不要太长，太长
的话RNA活性不高；
4.mRNA反转成cDNA（此步应在第三步完成后立即操作，RNA存放时间长易降解）；
5.以cDNA为模板，利于设计好的引物进行PCR扩增；
6.通过胶回收试剂盒回收目的DNA片段。

蛋白质表达载体构建步骤08.4.20（08.11.10日修改）
微管蛋白的可溶性表达及纯化（08.11.4日修改）
1.将重组质粒（BL21-2β2或Rossatta-2β2）的表达菌37℃摇培过夜后，1：20
扩配（约需1h15m）；
2.至OD600=0.5~0.7时（约1h15min~1h45min），在15-（0.5-24，0.8-12）；20-
（0.5-12，0.8-8）；28、25-（0.8-8）进行蛋白诱导表达，具体条件根据摇床使用情况而定；
3.对诱导后的菌液4℃，4000g，20min，彻底去上清；离心前取2ml以备用于
总蛋白电泳分析S1；
4.细菌沉淀用BindingBuffer （无尿素，20mM咪唑）悬浮，100ml用5～10ml
缓冲液（约当2~5ml每克菌量），视悬浮后的菌液浓度而定；
5.反复冻融法破碎细胞：做到14步时由于时间原因不能立即继续后面的操作，
可将菌悬液放于－70℃冰箱中冷冻；也可用反复冻融的方法来破碎细胞，在－70℃冻融，在室温下溶解，反复冻融3～4次；
6.加Lysozyme至1mg/ml （1ml加10ul），在冰上孵育30min～1h；
7.200~300W超声破碎，2s×30次，停顿2s；若菌种较多可以增加破碎次数。

注意超声破碎时间，不可太长，否则温度升高易导致蛋白变性；而时间太短则破碎不彻底，蛋白无法释放出来；
注意：第7步可选作，若经过冻融及溶菌酶处理后的菌悬液比较澄清，则可不用超声破碎。

8.4℃，10000rpm 20~30min，取上清；将沉淀用变性的BindingBuffer （8M
尿素）悬浮，然后室温摇动30min，取40ul进行电泳样制备S2；
9.4℃，10000rpm 10min，对上清再离心一次，取40ul进行电泳样制备S3；
10.上清通过0.45um的细菌过滤器，取40ul进行电泳样制备S4；
11.用HisTrap纯化：
a)洗柱：用5倍柱床体积（5ml）纯水洗柱，避免产生气泡。

b)平衡：至少5ml BindingBuffer （20mM咪唑），一般10ml，流速在
1ml/min。

c)上样：流速要慢要，控制在1ml/min，并收集流出的蛋白液，取40ul进
行电泳样制备S5；
d)重新上样：对第一次上样流出的蛋白液再进行过柱一次，取40ul进行电
泳样制备S6；
e)平衡：用10ml BindingBuffer （20mM咪唑），收集第一管及最后一管，
各取40ul进行电泳样制备S7，S8。

f)洗脱：用5ml ElutionBuffer （500mM咪唑）洗脱，每1ml一管，一般第
一二管中蛋白多。

g)平衡：用5ml的BindingBuffer （20mM咪唑）平衡柱子；
h)封闭：用20％的乙醇封闭柱子，4℃保存。

若需进行咪唑浓度优化，则纯化步骤改为：
10.4 梯度咪唑浓度洗脱：依次用20、30、40、50、75、100、150、200、300、
400、500mM的咪唑进行洗脱，每个浓度各用4ml，收集第2、3V；电泳分析后确定最佳的咪唑平衡及洗脱浓度。

12. 样品处理：吸取纯化后的蛋白液40ul，加入10ul的5×的上样缓冲液，100℃水浴5min，12,000rpm离心3min后取上清点样，每个加样孔15ul。

13. 80V电泳2h左右，取出胶用染色液染色4～5h（回收的染色液可过夜），用脱色液脱色3次，观察拍照。

附：
1.总蛋白电泳方法：700ul，12000g离心5min，弃上清，加入50μL 1×蛋白上样缓
冲液，充分悬浮，煮沸5min，12000g离心5min；
2.构建好的载体在进行蛋白诱导表达前，应选取10个左右的单克隆进行蛋白诱
导的小量试验，对诱导后的总蛋白进行电泳分析，选取表达量最大的克隆保存（甘油菌，－70℃冰箱）；
3.从－70℃冰箱中活化菌进行蛋白诱导表达试验时，活化好的表达菌在4℃冰
箱仅可存放15天左右，最多1个月，过期后必须重新划线活化。

4℃冰箱保存的宿主菌每次用过后必须用封口膜封好。

4.SDS-PAGE分析的蛋白样：总蛋白样S1，沉淀中的蛋白样S2，离心后上清中
的蛋白样S3，过细菌过滤器后的蛋白样S4，第一次上柱时流出的蛋白样S5，第二次上柱时流出的蛋白样S6，20mM Bingding buffer过柱后的第一管S7和最后一管蛋白样S8。