原核表达步骤总结

原核表达步骤

原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到

JM109或BL21等菌株中，诱导表达蛋白，然后进行蛋白纯化。本实验方案的前提是，目的基因已克隆到载体，并已转进入JM109菌株中。

1．鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌JM109或BL21中大量表达

（1）制样

1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ul LB培养基，加入0.7ul Amp（100mg/mL），37o C200r/min摇床培养，过夜活化。

2. 以1：50比例（200ul），将活化的过夜培养物加入10mL LB液体培养基中，加入10uLAmp（100mg/ml），37o C200r/min摇床扩大培养2h-3h，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液OD600在0.6-1.0之间，以使大肠杆菌处于最适合表达外源蛋白的生长状态。(一般3h时，菌液浓度及达到标准，但是不同的基因对菌的影响不同，所以第一次实验时需要确定这个最佳时间)

3. 从10ml扩大培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空白对照（CK），其余7ml菌液加入7ul IPTG（储存浓度为0.5mol/l），使IPTG 终浓度达到0.5mmol/l。以200r/min的转速，37o C摇床培养3h。

4. 以5000r/min离心2min收集菌体，倾倒上清，每个离心管收集3ml培养物。

5. 加入1ml dH2O，将管底沉淀用振荡器打散以充分洗涤，8000r/min 离心2min，倾倒上清。

6. 重复步骤5。将离心管中的水倒干净。

（二）菌落SDS-PAGE

1. 在收集的菌体中加入200ul 1×SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀的量增加或减少loading buffer的量，一般200ul比较合适)。用漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散。

2. 将样品于100℃恒温加热器上开盖加热10min（Marker也要加热）。样品凉后，12000r/min离心3min，取每管的上清点样。上样量一般30ul—40ul，marker 20ul。

（3）SDS-PAGE分析

1. 根据目的片段的大小，制作不同浓度的分离胶

蛋白分子量 (kDa)凝胶浓度 (%)

4-4020

12-4515

10-7012

15-10010

25-2008

分离胶（两块）配方

15%12%8% ddH2O 3.4ml 4.9ml 6.9ml 30% Acr-Bis (29:1)7.5ml 6.0ml 4.0ml

1.5M Tris-HCl（ pH8.8） 3.8ml 3.8ml 3.8ml

10%SDS150ul150ul150ul

10%过硫酸铵150ul150ul150ul

TEMED20ul20ul20ul

总体积15ml15ml15ml

按表中所列顺序从上到下加试剂，加完TEMED后，轻轻摇匀液体，一块胶加7ml溶液。加完后， 用1mLddH2O封住分离胶液面，在室温（37℃）凝结30min，至分离胶与水之间出现一条清亮的分界线，倾倒水层，用滤纸条将残余的水吸干。

2.制作浓缩胶

浓缩胶（两块）配方

5%

ddH2O 3.4 mL

30% Acr-Bis (29:1)0.85 mL

1M Tris-HCl（ pH6.8）0.63 mL

10%SDS50 uL

10%过硫酸铵50 uL

TEMED20 uL

总体积5ml

胶配好后混匀，灌胶2ml，插梳子时根据点样量和浓缩胶长短调整

梳子插入的深度，于室温(37℃)凝胶30min。

3.胶凝好后，拔梳子，将胶放入电泳槽中，加入1×Tris-Gly电泳缓冲液没过点样孔，胶外侧缓冲液界面应完全没过电极

4.Marker点5uL，用10uL小枪点样，以防样品冲出点样孔与旁边样品混杂。

电压打到70V，保证电流在20mA-30mA之间，当样品跑入浓缩胶时可适当调高电压，但不宜多次调整电压，否则条带会跑歪。

5.当溴酚蓝电泳至胶槽底部时,一般需要2.5h，停止电泳，剥胶，将浓缩胶部分切除后，加入考马斯亮蓝染色液，40r/min染色3h，可以过夜染色。

6.用移液器回收考马斯亮蓝染色液，再用蒸馏水将浮色冲洗干净后，倒入考马斯亮蓝脱色液，40r/min脱色至胶背景透明，期间可每2h更换一次脱色夜。

根据菌落SDS-PAGE的结果，可以看到目的蛋白是否大量表达。

2． 鉴定目的蛋白形成的是包涵体还是可溶性蛋白

1. 从冻存的菌液中取10ul，接种于5ml的LB培养基中，加入5ul

Amp(100 mg/ml),过夜活化菌株。

2. 按照1：50的比例，从活化的菌株中，取1ml菌液接种于50ml

LB培养基中，加入50ul Amp(100 mg/ml)，扩大培养3 h。

3. 扩大培养后的菌液,取出10ml，不加IPTG，作为空白对照。

剩余的40ml菌液中加入40ul IPTG（0.5mol/l）,诱导蛋白表

达。两者在37℃，200rpm的条件下培养3h。

4. 用50ml 离心管收集菌体，8000rpm，离心3min。注意配平。

5. 倒掉上清，加入40ml左右的dH2O洗菌体一遍，12000 rpm，

离心2min。注意要将菌体充分打散。

6. 倒掉上清，用枪头将上清吸干净。根据菌体的浓度，加入适

量的PBS buffe r 悬浮菌体。

7. 用大功率的超声波将菌体破碎，其间超声波每工作2min，停

止1min。菌体要始终保持在冰水混合物上，以保证低温，蛋

白不易变性。如此反复6-10遍，直至菌液清澈。

8. 12000rpm， 离心3min，分离上清和沉淀。

9. 在沉淀中加入250ul 1×SDS Loading buffer,取200u l 上清，

加入50ul 5×SDS Loading buffer，在恒温加热器上100℃加热

10min。

10.加热后的样品冷却到室温后，12000rpm，离心2min。

11.取上清40u l 点样，按照一中的方法进行SDS-PAGE检测。点样顺