原核表达遇到瓶颈怎么办(终审稿)
原核表达遇到瓶颈怎么办
原核表达遇到瓶颈怎么办没有发觉原则性错误之后，最简单、快捷的确实是改变一下表达温度、IPTG浓度。
低温、较长时刻的表达有利于蛋白稳固、融合表达，低浓度的IPTG能够减少化学物质对细胞的损害。
培养基中的葡萄糖可能会抑制表达。
有时表达的蛋白可能比预期的有不同，要认真研究电泳结果。
假如尝试改变条件后依旧没有表达，能够试试换不同的培养基。
除了LB 外还有TB、M9等，Novagen公司还有专门的培养基出售补充各种细菌生长所需营养。
假如你成功表达出来了，第一要恭喜你，之后你仍旧可能遇到各种各样的咨询题。
那个专门正常，科研的道路是曲折的嘛。
Q1：蛋白表达出来了，然而跑SDS-PAGE时大小不符？进行SDS-PAGE的时候蛋白的净电荷会阻碍迁移率。
带电量高的蛋白会结合较少的SDS，因此阻碍了蛋白的泳动。
富含脯氨酸的蛋白会在SDS-PAGE胶中移动得专门慢。
假如蛋白的等电点在5到9之间，同时组成的氨基酸组分没有明显的偏好，那么目的蛋白迁移率与预期相差较远就专门有可能不是由于凝胶电泳造成的。
我们前面提到过，在专门专门的情形下稀有密码子的咨询题也会造成表达产物的截短。
应加以考虑。
那个时候最好利用C端或者N端的标签进行Western Blot，看是否由于蛋白被蛋白酶降解而导致多条目的条带或者比预期小专门多的条带显现。
假如排除以上因素仍是无法找出Q2：蛋白不可溶，如何办？许多外源蛋白在大肠杆菌中表达后差不多上以包涵体形式存在，包涵体是一种致密、不可溶的颗粒。
一样情形下，形成包涵体表达产率都专门高，同时容易分离，得到比较纯的太大的损害。
假如你表达蛋白的目的是为了作为抗原制备抗体，那么显现包涵体也不算太坏，能够用PBS将包涵体悬浮，使用佐剂将溶液乳化后注射进入动物体内进行免疫。
包含体的形成据分析缘故之一在于表达量过高，表达产物来不及折叠为活性形式——多数以高表达见长的表达系统都会得到包含体产物。
假如融合表达含有标签，常用的做法是将包涵体用尿素溶解后在变性的情形下进行纯化，然后复性。
原核表达
一、原理1、E . coli表达系统E . coli是重要的原核表达体系。
在重组基因转化入E . coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。
2、外源基因的诱导表达提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。
常用的有温度诱导和药物诱导。
本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。
不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。
二、材料1、诱导表达材料( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培养基酵母膏(Yeast extract) 5g 蛋白胨(Peptone) 10gNaCl 10g 琼脂(Agar) 1-2%蒸馏水(Distilled water) 1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃保存。
( 3 ) l×凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS （电泳级）0.1 ％溴酚蓝10 ％甘油2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1 ）酶溶法（1）裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaCI（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。
（3）10 mg / mL 溶菌酶。
（4）脱氧胆酸。
（5）1 mg / mL DNase I。
2 ）超声破碎法( 1 ) TE 缓冲液。
( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液：100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )100 mmol / L DTT4 %SDS0.2 ％溴酚蓝20 ％甘油三、实验方案1、外源基因的诱导表达( 1 ）用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因。
【关于优化原核表达的一些总结】
我认为，进行原核表达条件优化主要应注意以下几方面：1．密码子最优化（codon of optimization）：大肠杆菌某些核糖体蛋白质中的使用频率不同，有最佳密码子（optimal codons）或偏爱密码子（preferred codons），稀有或利用率低的密码子（rare or low-usage codons）。
大肠杆菌稀有密码子主要有ATA，CTA，CCC，ACG，CGA，CGG，AGG，GGA，GGG等。
另外，大肠杆菌偏爱的终止密码子为UAA，而哺乳动物偏爱的终止密码子为UGA。
同时，终止密码子的下游碱基对翻译有效终止有影响，大肠杆菌中UAAN，N的影响力次序为：U>G>A，C；哺乳动物中UAGN，N的影响力次序为：A，G>>C，U。
我用的pET-43.1，先用宿主菌BL21（DE3），没有目的带出现，后改用RosettaBlueTM（DE3），目的蛋白表达效率达50%以上，并且是可溶的。
2．启动子是DNA链上RNA聚合酶的识别位点和结合位点，外源基因表达的理想启动子是可以指导高效转录，保证目的基因高效表达的启动子。
乳糖启动子是最常用的启动子，但容易引起外源基因的渗漏表达，对细胞的生长产生毒害作用；其他从乳糖启动子构建而来的启动子，多用IPTG诱导，IPTG对菌体也有毒害作用。
若IPTG对宿主菌有毒，可以同时加入IPTG和乳糖诱导表达，这样可减少IPTG的浓度。
若目的蛋白有毒，可用Invitrogen公司的pLEX系统等。
3．培养基的成分：用M9ZB和NZCYM培养基培养细菌，增加细菌质粒拷贝数；用LB培养基表达外源蛋白，提高蛋白表达量。
【毒性较大蛋白表达条件优化】：１）一般发酵时高温、高浓度诱导剂（ＩＰＴＧ）有利于表达表达包涵体形成，减少毒性。
２）加大氨苄的浓度（可达400mｇ／ｍｌ）并提高培养基中葡萄糖浓度（可达0.5％）有利于稳定表达，并要及时补充葡萄糖使其浓度维持在0.5％。
原核表达条件的优化
【专题讨论】原核表达条件优化！会不会是蛋白质的表达量低，电泳并不能反映出来，典型的例子是干扰素，虽然电泳没有新生条带，但是裂解上清的活性却很高。
“疑为降解条带”会不会是宿主菌蛋白，42度发酵，可抑制宿主菌蛋白表达疑为降解条带”会不会是宿主菌蛋白?那条带也挂在亲合柱子上的，发酵的细菌蛋白却没有。
挂在亲合柱子上,也有可能是非特异性条带，如用HIS TAG亲合柱，加大米错量试一下。
胞内表达有生物活性蛋白的一些策略包涵体的形成仍然是胞内基因表达巨大障碍，考虑到易聚合蛋白质复性的艰辛以及收得率的问题,胞内直接表达有生物活性的蛋白质仍然有一定的意义，到现在为止，形成包涵体的理化因素仍然不清楚，统计分析的出的结论是六个因素与包涵体的形成有关：电荷的分布、转型氨基酸残基的含量、半胱氨酸的含量、脯氨酸的含量、亲水性和总氨基酸数量（1）。
有多种手段用于减少包涵体的形成以及促进蛋白质的折叠，如低温培养（3、4、11）、宿主菌的选择（12）、某些氨基酸残基的取代（14）、共表达分子伴侣（17）、硫氧还蛋白的融合表达或与目标蛋白共表达（18）和利用硫氧还蛋白还原酶缺陷菌株作为宿主菌（2、16）等。
胞内的氧化还原势是另外的问题，细菌的胞内蛋白质半胱氨酸残基和二硫键较少，含有大量二硫键的蛋白质则被输送到胞浆以外。
这样那些依靠二硫键来稳定蛋白质四级结构的蛋白质在细菌的胞浆内因为缺乏形成二硫键的系统如DsbA/DsbB难以正确折叠。
有人分离到允许胞内二硫键形成的突变株，这些突变株使编码硫氧还蛋白还原酶的TrxB基因失活以及造成一定的还原势。
硫氧还蛋白本身对于二硫键的形成不是必需的（16），该作者认为胞内有其他的类似于硫氧蛋白的蛋白能被硫氧还蛋白还原酶还原，在硫氧还蛋白还原酶缺陷的情况下，处于氧化状态的这类蛋白质能促进二硫键的形成。
这些硫氧还蛋白还原酶缺陷菌被证实为在大肠杆菌中生产复杂蛋白质的很有价值的工具。
Novagen公司pET宿主菌系列中的AD494（DE3）和Origami B(DE3)都是TrxB基因突变菌株。
原核蛋白可溶性表达策略及方案
原核蛋白可溶性表达策略及实验方案可溶性表达策略大肠杆菌根据表达部位的不同可将蛋白表达的形式分为3种：第1种为胞外分泌，即目的蛋白被分泌到培养基中。
这种方式表达的蛋白容易纯化，不易降解，但通常只有少量的蛋白质可以分泌到细胞外；第2种为周质空间表达，这种方式表达的蛋白存在于周质间隙中，外周质的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠，在向外周质转移的过程中，信号肽在细胞内剪切，更有可能产生目的蛋白的天然N末端；第3种为胞内表达，这种表达易形成无活性的包涵体，需要经过繁琐的变性、复性过程才能得到有活性的蛋白。
因为多数蛋白不能够进行分泌表达，且表达量较少，所以分泌蛋白表达方法很少被使用；现阶段实验科研中常用的方法是融合型蛋白表达，包括蛋白上清表达和包涵体复性，以上俩种方法均可获得大量的可溶性蛋白。
有关通过蛋白复性获得可溶性蛋白请参见《包涵体蛋白复性的方法操作》，这里主要从条件优化的角度讨论第一种方法。
降低重组蛋白合成的速率可溶性蛋白的产率取决于蛋白的合成速率，蛋白的折叠速率，以及聚集的速率。
高水平表达时，肽链聚集的速率一旦超过折叠速率，就会形成包涵体。
因此，降低重组蛋白合成的速率有利于提高重组蛋白的可溶性表达。
常用的方法有培养温度的优化、挑选合适的启动子、诱导剂和诱导条件的优化等。
密码子优化密码子的使用对外源基因的表达水平有重要的影响。
密码子优化就是根据表达系统对密码子的偏好性进行优化筛选。
经过优化的基因序列往往能提高mRNA二级结构的稳定性，有利于新生肽段的正确折叠，提高外源活性蛋白的表达。
值得注意的是，稀有密码子存在通常会对蛋白表达产生负面影响，在转录过程中稀有密码子的位置以及转录的速率都会影响密码子的翻译，但在某些基因中使用稀有密码子则能显著降低肽链的延伸速率。
启动子的选择需要从启动子强度、漏表达程度、诱导性及经济因素等方面考虑。
在胞内表达中，常采用T7、PL等强启动子，表达水平可达菌体总蛋白的70%。
若重组蛋白多以包涵体形式存在，可采用强度较弱的lac等启动子以达到一个与表达能力相匹配的翻译速率。
原核表达的详细步骤
原核表达详细步骤PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA（cDNA)序列,有几种方式寻找正确的读码顺序：①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正确的读码。
②实验方法，即得到蛋白,进行测序,然后在DNA上找到正确的读码。
③利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子.在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子(cDNA）。
2. 注意事项：①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义,也可以是mRNA上的定义,分为complete CDS 和partial CDS，是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS读码是“M、、、、、、、、、＊”,partial CDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。
二、抗原决定簇的预测1、原理:蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。
一般抗原决定簇是由6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。
变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性.只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来,如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白,可能会有假阳性.做单抗也可以,同样道理,筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。
2、选择原则：（1）、亲水性:大部分抗原决定簇是亲水性的。
(2)、处于结构表面:大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。
（3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。
所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。
3、选定抗原决定簇的步骤：（1）预测：如软件预测DNAstar（Protean)预测，Dnaman.在线网站预测(http：//www-bimas。
原核表达条件优化
原核表达条件优化E.coli中蛋白表达量的因素除载体启动子结构以外，还有质粒拷贝数、质粒稳定性、mRNA结构、密码子的偏爱性和宿主菌的生长状态等因素[58]。
由于V ector NTI suitor7.0软件模拟表达，可知mRNA结构和密码子的偏爱性两个影响因素不会造成表达困难，所以本实验的工作主要针对载体拷贝数、载体稳定和宿主菌的生长状态。
本实验中重组表达质粒PrP-pET-32a（+）不稳定的原因可能是PrP对E.coli BL21（DE3）具有细胞毒性。
pET-32a（+）来源于pBR-322，pBR-322源于ColE1。
ColE1、pBR-322 、pET-32a（+）都失去了分配功能区par。
而天然质粒具有功能区par，可以保证质粒在每次细胞周期中准确的进行分离，并均等的分配到子代细胞中去。
功能区par对质粒PrP-pET-32a（+）的稳定性是不可缺少的[4]。
缺少功能区par的pET-32a （+）质粒在每次细胞周期中随机分配到子代细胞中去，无细胞毒性时约98% E.coli BL21（DE3）会带有质粒（见《pET System Manual》34页）。
表达有细胞毒性蛋白的E.coli BL21（DE3）不具有生长优势，而且随细菌培养时间的增加β-内酰氨酶将逐渐释放到溶液中去，破坏溶液中的AMP。
【β-内酰氨酶功能强大，细菌培养稀释1000倍以后还能破坏几乎所有的AMP（见《pET System Manual》33页）】。
这样本不具有生长优势的表达菌又失去了选择压力，造成大部分新生细菌无质粒，表现为表达困难。
本实验证实约60%以上的细菌无质粒。
鉴于以上原因，本实验将融合蛋白Trx-PrP C27-30表达分成两个阶段，前一个阶段为质粒生长阶段，主要保证质粒的稳定性和提高质粒的拷贝数；后一个阶段为融合蛋白表达阶段，待细菌生长达饱和以后，诱导融合蛋白Trx-PrP C27-30的表达。
原核蛋白表达常见问题解析
原核蛋白表达常见问题解析原核蛋白表达常见问题解析1、为什么目的蛋白总是以包涵体的形式出现？在原核蛋白表达纯化中目的蛋白经常发生错误的折叠，并聚集成为包涵体。
经过诱导，目的蛋白通常可达细胞总蛋白的50%以上。
虽然有一定比例的蛋白以可溶的单体形式存在，而多达95%（甚至更多）的蛋白则在包涵体中。
实验过程中，可以采取降低诱导温度，例如25–30°C，或降低IPTG浓度(0.01–0.1mM)并延长诱导时间，还有采用特别的培养基等方法获得更多的可溶蛋白。
2、跨膜蛋白为什么很难表达？跨膜蛋白的表达成功率相对较低是一个实验结果，究其原理，目前众说纷纭很多种理论。
以我们浅薄的理解层面来看，主要有以下几个原因：跨膜蛋白一般都是强疏水性的氨基酸分子和亲水性的分子跳跃式的连接，形成的亲水疏水的一个最简单的跨膜化学结构，这种结构与信号肽结构相似，对于原核细胞来说，简单的细胞器很难像真核细胞一样完成信号肽识别及切除、引导内质网、高尔基体重新包装及分泌这一复杂过程，有些蛋白是多次跨膜，对于原核细胞来说几乎是不可能完成的任务。
另外，对于疏水性的片段，在原核细胞中极易形成包涵体，疏水性多肽会抑制翻译过程，甚至与原核膜结构融合形成毒性，出于自我保护的本能，所有的细胞器都会停止合成蛋白的过程。
3、如何选择蛋白表达宿主菌？4、我们有哪些原核蛋白纯化方式？如何选择不同的纯化方式？答：我们公司的蛋白纯化方法大致分为亲和纯化、离子交换、切回收三类。
1、常规情况下，一般携带融合标签（His标签，GST标签，sumo标签，Fc标签），我们可以通过Ni柱、GST柱、Protein A等进行亲和纯化获得融合蛋白，用亲和纯化的方法一般可以获得85%以上纯度的蛋白，亲和纯化的方便快捷。
2、如果需要目的蛋白不含有任何标签，怎么选择纯化方式？。
（1）可表达融合蛋白，用蛋白工具酶切割融合蛋白，再进行纯化除去工具酶。
此方法能快速得到蛋白。
（2）可表达不含标签的蛋白，进行离子、分子筛、疏水等纯化，通过AKATA纯化设备获得蛋白。
【原创】原核表达的心得
如下：（我的目的蛋白是
，信心十足往下做，
SDS-PAGE
然目的蛋白也是很少，但是至少
PAGE图如下：
数真的影响表达啊，没有加
，SDS-PAGE
抗，哈哈，老天
是沉淀表达，我是按照分子克隆指南上面的做法，
，沉淀和上清分
很开心，今天时间
上清的目的蛋白会更多一点。
等我
多了，但是杂
未过柱裂解液是菌体裂解后上清的液体（应该算阳性对照吧这个），看出来250mM处蛋白挺多的，这样应该就没有问题了吧，我这个是50ml菌液摇的，5ml裂解上清，上样为10μl，祝大家实验顺利哈。
以后会用lc-ms研究这个蛋白和受体的作用，有什么新的进展我会更新的。
原核表达——精选推荐
原核表达--表达前的分析比什么都重要表达不同于其它一些实验，比如：提取质粒、PCR、电镜切片，这些人为控制的因素比较多，出问题相对来说也比较好分析。
表达呢，你把质粒克隆好啦，交给细胞，然后有些事情就不全是你要怎样就怎样了。
原核表达在表达当中来说还是比较简单，细菌培养条件简单、生长速度快，需要的仪器和培养基都比较便宜。
当然，它也存在一些缺乏高级修饰、细胞内部还原性过高等缺点。
原核表达从一开始的设计就非常重要，所谓好的开始是成功的一半。
做足准备功夫，可是省去很多将来后悔的事情。
首先，我们要根据是否要求可溶将载体分成两大类，如果希望可以同时尝试多种表达系统，也有许多商业化的系统供选择。
前面已经介绍过许多公司的商业化载体、菌株和多系统表达体系，现在我想先从自己的蛋白分析讲起。
同样的载体、同样的系统，很可能表达这个蛋白表达量奇高，但是另外一个就是做不出来，所以没有万能的载体，只有永恒的分析。
当然如果你的蛋白曾经在原核系统中成功表达出来那是最好的，选择同样的载体表达成功率会高很多。
如果没有也最好尝试找一些曾经表达过和你的蛋白拥有相类似结构的文献。
比如大部分含有哺乳动物src同源的SH2蛋白相互作用域的蛋白都是用pGEX系列载体表达出来的。
根据经验而言，含有较少半胱氨酸和脯氨酸的、平均大小为60kD的单体蛋白较容易表达。
在下面将列出几个影响表达的因素，大家可以在表达前根据这几个因素自己分析一下：翻译起始位点现在大部分的表达载体都提供起始位点，所以它已经把起始密码子与核糖体结合位点的距离进行优化了，一般情况下不需要自己再加，不过还是要留意载体图谱上是否注明有起始密码子和终止密码子GC含量表达序列中的GC含量超过70％的时候可能会降低蛋白在大肠杆菌中的表达水平。
GC含量可以利用DNA STAR、V ector NTI Suite等软件进行预测。
二级结构在起始密码子附近的mRNA二级结构可能会抑制翻译的起始或者造成翻译暂停从而产生不完全的蛋白。
原核表达系统三大要素的选择及优化
原核表达系统三大要素的选择及优化(总4页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--原核表达系统是目前使用最广泛、最完善的重组蛋白表达系统，具有遗传背景清晰、表达周期快、表达量高、成本低等优势，缺点是无法进行蛋白的翻译后修饰，得到具有生物活性蛋白的几率较小。
原核表达系统适用于表达原核来源的蛋白或不需要翻译后修饰的真核来源蛋白。
在原核蛋白表达过程中，需要综合考虑表达菌株、质粒载体、表达条件三大因素，以获得最满意的表达效果。
下面为大家一一介绍这三大因素的选择和优化。
1. 表达菌株菌株的选择往往是大家最容易忽视的，大多数人会选择使用自己实验室有的或用过的表达菌株。
当蛋白表达效果不佳时，大多会在质粒载体或表达条件上找原因，而不会考虑菌株的选择是否合适。
但作为表达宿主，菌株一定会对外源基因表达蛋白产生影响。
图1 大肠杆菌原核表达系统常用的菌株包括大肠杆菌、芽孢杆菌和链霉菌。
其中运用最为广泛的就是大肠杆菌表达系统。
以下为大家列出了一些常用的大肠杆菌表达菌株，可根据不同的需求进行选择。
2. 质粒载体质粒表达载体上的重要元件包括启动子，多克隆位点，终止子，复制子，信号肽，融合标签，筛选标记等。
根据载体上这些元件的特性，有多种质粒可供选择。
图2 大肠杆菌表达质粒pET-22b(+)图谱启动子：根据启动子的强弱考虑，强启动子可以提高蛋白表达量；弱启动子可以降低本底表达、增加可溶表达、表达小量伴侣蛋白等。
根据启动子的作用方式考虑，组成型启动子使宿主不停的表达重组蛋白；诱导型启动子使宿主在特定诱导条件下表达重组蛋白。
终止子：终止子的作用在于保护mRNA在核外不被降解，延长mRNA的寿命，以提高重组蛋白表达量。
对于T7系统来说，由于T7 RNA聚合酶效率非常高，保证一直有充足的mRNA提供翻译，所以终止子对其影响不大，只有一些自身带有起始密码子的外源基因需要终止子。
复制子：复制子决定质粒载体拷贝数，拷贝数越高，重组蛋白表达量就越高。
做原核表达的教训和体会
最近在做原核表达，包涵体。
以前也做过，但经验不多。
从园子里也学到不少。
一点失败的教训以及纯化过程中的体会，贴出来与大家共享，同时希望得到同行们的指正。
1. 首先介绍一下背景。
载体是novagen公司的pET22b，Amp 抗性。
菌株是Invitrogen的BL21 star DE3，是一个蛋白降解酶突变菌株，也就是说是一种优化表达菌株。
2. 第一次失败。
第一次做诱导的时候，重复了很多次，但总是诱导不出来。
PCR、酶切都正确。
但没等测序结果出来就开始做了。
失败了，曾在园子求助。
后来证明是引物错误。
我们实验室合成引物都要先发给purchasing office，然后才由他们与公司交涉。
这个office的老太太把引物弄掉了一个碱基。
教训：在实验过程中，再仔细都是不为过的。
引物来了后管壁上贴有序列，但我忽略了。
3. 第二次失败。
后来重新构建、转化、诱导。
第一次诱导时根本就没带。
见附图（图片质量太差了，下面几个帖会逐渐好转）然后开始闷头找原因。
周一下午5点我就接了DE3菌，由于那天人非常不舒服，去看医生了，等了很久，到第二天中午11点才转接！而且是按1:50转接的！也就是菌在转接之前培养了18 h！Amp产生抗性的机制和其他抗生素的情况是不同的（具体可以翻看分子克隆）。
到菌体生长到足够浓度的时候，培养基的Amp就会慢慢减少。
一旦细菌失去选择压力，就可能造成质粒丢失。
当Amp降到很低，不足以抑制细菌生长时，未携带质粒的菌就会长得比带质粒的快。
所以当培养时间足够长后，培养基中的B－内酰胺酶就会积累到很高的浓度。
转接时（我是1:50转的），高浓度的酶可能破坏新鲜培养基中的Amp（而且我用的浓度是50 ug/ml）。
这样，就造成最后收集的菌中，大部分都是没有带质粒的菌了。
当然还有一个可能的原因就是死亡的菌体分泌一些降解酶，使得表达检测失败。
这两种推测都只是推测，但我觉得第一种情况应该引起我们的重视。
在使用Amp抗性的时候要格外注意。
原核表达操作步骤及注意事项
原核表达操作步骤及注意事项时间：2010-03-03 14:05:01 来源：作者：点击：1046次将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中，μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
原核表达系统三大要素的选择及优化
原核表达系统是目前使用最广泛、最完善的重组蛋白表达系统，具有遗传背景清晰、表达周期快、表达量高、成本低等优势，缺点是无法进行蛋白的翻译后修饰，得到具有生物活性蛋白的几率较小。
原核表达系统适用于表达原核来源的蛋白或不需要翻译后修饰的真核来源蛋白。
在原核蛋白表达过程中，需要综合考虑表达菌株、质粒载体、表达条件三大因素，以获得最满意的表达效果。
下面为大家一一介绍这三大因素的选择和优化。
1. 表达菌株菌株的选择往往是大家最容易忽视的，大多数人会选择使用自己实验室有的或用过的表达菌株。
当蛋白表达效果不佳时，大多会在质粒载体或表达条件上找原因，而不会考虑菌株的选择是否合适。
但作为表达宿主，菌株一定会对外源基因表达蛋白产生影响。
图1 大肠杆菌原核表达系统常用的菌株包括大肠杆菌、芽孢杆菌和链霉菌。
其中运用最为广泛的就是大肠杆菌表达系统。
以下为大家列出了一些常用的大肠杆菌表达菌株，可根据不同的需求进行选择。
2. 质粒载体质粒表达载体上的重要元件包括启动子，多克隆位点，终止子，复制子，信号肽，融合标签，筛选标记等。
根据载体上这些元件的特性，有多种质粒可供选择。
图2 大肠杆菌表达质粒pET-22b(+)图谱启动子：根据启动子的强弱考虑，强启动子可以提高蛋白表达量；弱启动子可以降低本底表达、增加可溶表达、表达小量伴侣蛋白等。
根据启动子的作用方式考虑，组成型启动子使宿主不停的表达重组蛋白；诱导型启动子使宿主在特定诱导条件下表达重组蛋白。
终止子：终止子的作用在于保护mRNA在核外不被降解，延长mRNA的寿命，以提高重组蛋白表达量。
对于T7系统来说，由于T7 RNA聚合酶效率非常高，保证一直有充足的mRNA 提供翻译，所以终止子对其影响不大，只有一些自身带有起始密码子的外源基因需要终止子。
~复制子：复制子决定质粒载体拷贝数，拷贝数越高，重组蛋白表达量就越高。
表达载体通常会选用高拷贝的复制子，但过高的拷贝数会影响质粒稳定性和宿主生长。
原核蛋白表达 问题解析
原核蛋白表达问题解析
原核蛋白表达是一种人工实验技术，用于在原核生物（如细菌）中表达特定的
蛋白质。
它是研究生物学、药物开发和生物工程领域中常用的工具之一。
在原核蛋白表达中，研究者通常通过将目标基因转移到表达载体中来实现蛋白
表达。
表达载体是一种特殊的DNA分子，其中包含目标基因的编码序列和其他必
要的调控元件。
通过将表达载体导入到适合的宿主细胞中，目标基因可以被转录和翻译为蛋白质。
原核蛋白表达有许多优点，其中包括高表达水平、简单和经济等。
原核生物的
生长速度通常很快，所以可以在短时间内大量表达目标蛋白质。
此外，原核蛋白表达体系相对较简单，无需特殊的培养条件或复杂的培养基，这降低了实验的成本和难度。
然而，原核蛋白表达也存在一些挑战和限制。
由于原核生物的细胞环境与真核
生物不同，某些复杂的蛋白质可能无法正确地折叠或修饰。
此外，某些蛋白质可能对原核表达系统的毒性有较高的敏感性，从而降低了表达效率。
为了克服这些问题，研究者通常采用各种策略来优化原核蛋白表达。
例如，他
们可以通过优化转化条件、选择适当的宿主细胞或使用辅助蛋白质来提高表达效率。
此外，关于蛋白质折叠和修饰的研究也可以提供有价值的信息。
在总结一下，原核蛋白表达是一项重要的实验技术，可用于快速高效地表达目
标蛋白质。
尽管存在一些挑战，但通过优化实验条件和相关研究的进行，原核蛋白表达仍然是生物学和生物工程领域中广泛使用的工具之一。
蛋白质表达过程中的多个环节可能会成为生物技术发展的瓶颈
蛋白质表达过程中的多个环节可能会成为生物技术发展的瓶颈蛋白质是生物体内最重要的分子之一，它们在细胞的生命活动中发挥着重要的作用。
蛋白质表达是指通过基因转录和翻译过程，将基因中所编码的蛋白质合成出来。
然而，蛋白质表达过程中存在着多个环节，这些环节可能会成为生物技术发展的瓶颈。
本文将探讨这些可能存在的瓶颈，并提出相应的解决方案。
1.基因转录的瓶颈基因转录是蛋白质表达的第一步，它是将DNA序列转录成RNA序列的过程。
然而，不同基因的表达水平存在差异，有些基因很难被有效地转录。
这可能是由于DNA序列的结构或一些调控元件的缺失导致的。
因此，如何提高基因转录的效率成为一个重要的问题。
解决方案：- 优化启动子序列：通过优化启动子序列的结构和序列，可以提高基因的转录效率。
例如，使用人工合成的启动子可以增强基因的表达水平。
- 引入启动子增强子：启动子增强子可以增强启动子的活性，从而提高基因的表达水平。
这种方法可以通过基因工程技术引入适当的增强子序列来实现。
2. mRNA稳定性的瓶颈mRNA是通过基因转录产生的，它在细胞中负责将基因信息转移到蛋白质合成机器中。
然而，mRNA在细胞内往往非常不稳定，容易被降解。
这可能会导致蛋白质表达的效率低下。
解决方案：- 引入稳定性增强元件：将稳定性增强元件引入mRNA序列中，可以增加mRNA的稳定性。
这些元件可以包括结构域、RNA结合蛋白等，可以通过基因工程技术加入到mRNA中。
- 使用特殊的翻译系统：一些特殊的翻译系统具有较高的mRNA稳定性。
例如，使用核糖体识别序列进行翻译，可以提高mRNA的稳定性，从而增加蛋白质表达的效率。
3.蛋白质折叠和修饰的瓶颈蛋白质折叠和修饰是蛋白质表达过程中非常重要的环节。
蛋白质的折叠能力和修饰水平直接影响其功能。
然而，由于生物体内复杂的环境和条件，蛋白质的折叠和修饰往往不完全，可能会影响蛋白质的功能。
解决方案：- 优化表达条件：提供适合蛋白质折叠和修饰的条件，例如适当的温度、pH值等，可以提高蛋白质折叠和修饰的效率。
原核表达步骤
原核表达步骤原核表达步骤Chi I原核表达基本试验步骤将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列（转录终止子，核糖体结合位点）；（4）一个多限制酶切位点接头；I_______________________________________________________________ ____________ I（5）宿主体内自主复制的序列。
.I I 原核表达一般程序如下：获得目的基因-准备表达载体-将目的基因插入表达载体中（测序验证）-转化表达宿主菌-诱导靶蛋白的表达—表达蛋白的分析—扩增、纯化、进一步检测，其中包括：一、试剂准备（1）LB培养基。
（2）1MIPTG（异丙基硫代-B -D-半乳糖苷）:2.38g IPTG溶于10ml ddHHO 中,0.22匕m滤膜抽滤，-20 C保存。
CCY的IPTG是1M的，用时进行1000倍稀释。
二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR 循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCF方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA 以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
原核表达遇到瓶颈怎么办
原核表达遇到瓶颈怎么办在做过Western Blot仍没有检测到表达带，那么就要开始进行下一步的分析了。
第一，看看载体的多克隆位点和片断插入的序列，是否有因为酶切连接而意外引入了转录终止信号。
有时载体几经多个实验人员的周转，反复插入片断，或者是粘端相同的不同酶切片断之间的连接，会意外在启动子后面带入终止位点，专门是用到XbaI之类的酶要小心。
然后要对测序结果进行确定，确定插入的每个碱基差不多上正确的，没有意外终止的情形。
还有个大伙儿容易忽略的问题：确实是要看基因中有没有细菌不常用的密码子——假如有，需要考虑换表达菌株。
每种菌株都有自己专门的设计，或者是同的载体要配合一定的菌株使用，像pET系列就一定需要有T7 RNA聚合酶片段整合在细菌中的菌株才可用于表达。
采纳不同调控机制会使用不同的表达菌株，因此换菌株一定要认真看过载体的调控方式再换。
以Novagen为例，假如使用BL21(DE3)表达不成功的话能够换Rosetta系列菌株，它能够由一种氯霉素抗性的、与pET 相容的质粒提供AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA 的tRNA。
因此这类菌株能够明显改善大肠杆菌中由于稀有密码子造成的表达限制。
有时不明缘故的表达蛋白截短（比预期的分子量要小专门多）也可能是由于稀有密码子造成的。
另外一种可能是不严谨的本底表达产物抑制。
没有发觉原则性错误之后，最简单、快捷的确实是改变一下表达温度、IPTG浓度。
低温、较长时刻的表达有利于蛋白稳固、融合表达，低浓度的IPTG能够减少化学物质对细胞的损害。
培养基中的葡萄糖可能会抑制表达。
有时表达的蛋白可能比预期的有不同，要认真研究电泳结果。
假如尝试改变条件后依旧没有表达，能够试试换不同的培养基。
除了LB 外还有TB、M9等，Novagen公司还有专门的培养基出售补充各种细菌生长所需营养。
假如依旧不行，考虑那么就剩下换换载体或者表达系统了。
在换过不同载体，不同菌株之后仍是表达不出来的话，笔者的建议是：舍弃吧。
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原核表达遇到瓶颈怎么
办
TPMK standardization office【 TPMK5AB- TPMK08- TPMK2C- TPMK18】
我想表达遇到的第一个瓶颈估计就是为什么我的外源片段插到载体里面，PCR鉴定没问题，双酶切也OK，可是就是不见表达。
一般我们是如何判断没有表达呢？大多都是首先进行SDS-PAGE。
在跑胶的时候一定要设对照，比较严谨的电泳对照，应该是：Marker，标准品阳性对照（如果有，且打算做Western的话），以及空白载体（诱导）和重组载体（不诱导）2个阴性对照，再加上诱导不同时间的表达结果。
Marker用于判断条带大小，标准品用于判断Western体系包括抗体显色剂和操作的可靠性，以及精确判断大小；空白载体（诱导）负对照有助于判断在非诱导条件下的本底表达；而重组载体（不诱导）负对照则有助于判断诱导的效果以及排除诱导剂对宿主菌潜在的干扰，或者是区分细菌内源和外源表达产物——偷懒可不是好习惯，会影响结果判断。
注意，接种表达和接种做感受态都类似，一定要用挑单克隆、加足量抗生素、过夜培养的新鲜菌液转种最好，在筛选压力下生长旺盛的种子液远比经过4℃保存的菌液要好得多，也许是因为保存时间长会导致抗生素失效部分细菌丢失质粒或者其他变化。
反正就是一种经验做法。
跑SDS-PAGE的话可以用考马斯亮兰染，它灵敏度在100ng左右；但是不能跟着做Western了。
银染的灵敏度在0.1～1 ng；有钱还可以用Sypro Red，灵敏度高还可以继续做Western。
WesternBlot是蛋白质定性和半定量的最通用的技术，具体细节可参考生物通WesternBlot技术专题，我们有详细介绍的。
在做过Western Blot仍没有检测到表达带，那么就要开始进行下一步的分析了。
首先，看看载体的多克隆位点和片断插入的序列，是否有因为酶切连接而意外引入了转录终止信号。
有时载体几经多个实验人员的周转，反复插入片断，或者是粘端
相同的不同酶切片断之间的连接，会意外在启动子后面带入终止位点，特别是用到XbaI之类的酶要小心。
然后要对测序结果进行确定，确定插入的每个碱基都是正确的，没有意外终止的情况。
还有个大家容易忽略的问题：就是要看基因中有没有细菌不常用的密码子——如果有，需要考虑换表达菌株。
每种菌株都有自己独特的
设计，或者是
pET系列就一定需要有T7 RNA聚合酶片段整合在细菌中的菌株才可用于表达。
采用不同调控机制会使用不同的表达菌株，所以换菌株一定要仔细看过载体的调控方式再换。
以Novagen为例，如果使用BL21(DE3)表达不成功的话可以换Rosetta系列菌株，它能够由一种氯霉素抗性的、与pET 相容的质粒提供AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA 的tRNA。
所以这类菌株能够明显改善大肠杆菌中由于稀有密码子造成的表达限制。
有时不明原因的表达蛋白截短（比预期的分子量要小很多）也可能是由于稀有密码子造成的。
另外一种可能是不严谨的本底表达产物抑制。
没有发现原则性错误之后，最简单、快捷的就是改变一下表达温度、IPTG浓度。
低温、较长时间的表达有利于蛋白稳定、融合表达，低浓度的IPTG可以减少化学物质对细胞的损伤。
培养基中的葡萄糖可能会抑制表达。
有时表达的蛋白可能比预期的有不同，要认真研究电泳结果。
如果尝试改变条件后依然没有表达，可以试试换不同的培养基。
除了LB外还有TB、M9等，Novagen公司还有特殊的培养基出售补充各种细菌生长所需营养。
如果还是不行，考虑那么就剩下换换载体或者表达系统了。
在换过不同载体，不同菌株之后仍是表达不出来的话，笔者的建议是：放弃吧。
有些蛋白是用大肠杆菌无
法表达的，或许可以尝试其它的表达系统。
毕竟，将构建好的质粒交给细菌后，有些事情是我们不能控制的，未知的。
尝试其他的表达系统未尝不是一种办法。
不过原核不能表达，转去做真核，也不保险，这时候试试体外表达，会更省事，因为没有细胞生长的限制，更容易得到结果，可能只是花费高些，产量低些。
能做出结果是第一需要时，这些就不能计较太多。
生物通将随后介绍几个体外表达系统，欢迎留意。
如果你成功表达出来了，首先要恭喜你，之后你仍然可能遇到各种各样的问题。
这个很正常，科研的道路是曲折的嘛。
Q1：蛋白表达出来了，但是跑SDS-PAGE时大小不符？
进行SDS-PAGE的时候蛋白的净电荷会影响迁移率。
带电量高的蛋白会结合较少的SDS，因此阻碍了蛋白的泳动。
富含脯氨酸的蛋白会在SDS-PAGE胶中移动得特别慢。
如果蛋白的等电点在5到9之间，并且组成的氨基酸组分没有明显的偏好，那么目的蛋白迁移率与预期相差较远就很有可能不是由于凝胶电泳造成的。
我们前面提到过，在很特殊的情况下稀有密码子的问题也会造成表达产物的截短。
应加以考虑。
这个时候最好利用C端或者N端的标签进行Western Blot，看是否由于蛋白被蛋白酶降解而导致多条目的条带或者比预期小很多的条带出现。
如果排除以上因素仍
Q2：蛋白不可溶，怎么办
许多外源蛋白在大肠杆菌中表达后都是以包涵体形式存在，包涵体是一种致密、不可溶的颗粒。
一般情况下，形成包涵体表达产率都很高，并且容易分离，得到比较
的蛋白形成包涵体也就不会对细胞产生太大的损伤。
如果你表达蛋白的目的是为了作为抗原制备抗体，那么出现包涵体也不算太坏，可以用PBS将包涵体悬浮，使用佐剂将溶液乳化后注射进入动物体内进行免疫。
包含体的形成据分析原因之一在于表达量过高，表达产物来不及折叠为活性形式——多数以高表达见长的表达系统都会得到包含体产物。
如果融合表达含有标签，常用的做法是将包涵体用尿素溶解后在变性的情况下进行纯化，然后复性。
复性是表达下游最折磨人的步骤，生物通以后会逐步介绍。
但是，在那之前你应该还要确定一下，你的蛋白真的是不可溶吗细胞裂解是否完全呢利用相差显微镜或者染色后对细胞裂解物进行观察。
是否仍可以看到完整的细胞裂解后的沉淀是否和之前收集细胞沉淀大小相似裂解后溶液是否看起来澄清以上任何一种情况出现都可能意味着细胞没有被彻底裂解而导致裂解上清检测不到产物。
如果形成了包涵体，在比较高倍的（>400×）光镜下可以观察到大肠杆菌中有致密的结构。
因为包涵体可能会占据细胞一半体积。
Q3：必须要可溶的蛋白，你可以怎么做
如果你希望得到能行使功能的蛋白，那么就最好还是想办法使蛋白以可溶形式表达，包涵体复性也是一条十分曲折的道路。
避免包涵体形成的方法很多，比如：选用表达量不高的表达系统，选择有助于可溶性表达的融合表达系统比如pThio，pMal等等，对于T7系统来说降低或者减少诱导条件（例如降低ITPG浓度减少T7
聚合酶）从而降低表达速度，使用基本培养基等也有助于可溶性表达。
另外一个容易忽视的问题是大肠杆菌内还原性过高会导致二硫键不能正确形成，同样容易导致表达产物不溶，更换菌株例如Novagen的Origami系列也有助于解决这个问题。
生物通将在随后专门介绍几种特殊的用途的大肠杆菌菌株，不妨留意。
一般包涵体可以先使用温和变性剂（如：低浓度的尿素）和去污剂（如：Triton-X 100）将包涵体初步洗涤，之后用8M尿素将包涵体溶解。
可以通过透析复性、或者
有人尝试当蛋白挂在柱子上的时候，在还原和氧化的谷胱甘肽存在的情况下用浓度从6M到0M的盐酸胍过柱，促使蛋白的折叠。
在蛋白重新折叠后用咪唑洗脱。
Q4：切除标签时引入的蛋白酶是否一定要切除
很多时候我们要用蛋白酶除去加入的标签（除了NEB出有内含肽自动断裂这种模式就不需要蛋白酶了），在蛋白酶切除标签后是否一定要去除呢？有人认为蛋白酶与目的蛋白加入的比例是1:500甚至更低，蛋白酶是不会影响到下一步操作的，在一些粗放的生化实验不用去处蛋白酶。
严谨的后继实验需要将蛋白酶除去。
很多公司已经开发出带有标签的蛋白酶，使得仅通过过亲和柱就可以方便的去除蛋白酶和融合标签，令实验越来越方便了。