原核表达与常用蛋白质纯化技术探讨

pET载体诱导表达 载体诱导表达——经典的表达系统 载体诱导表达 经典的表达系统
表达条件的优化：蛋白不表达，或表达量低，如何解决？ 表达条件的优化：蛋白不表达，或表达量低，如何解决？
温度对表达的影响 培养基对表达的影响（e.g. Glucose 对表达的影响） 对表达的影响） 培养基对表达的影响（ 菌株的选择 不同克隆表达水平的差异 溶氧量与培养体积
三大表达系统比较
pET系列 pET系列 (T7 promoter, Novagen公司) Novagen公司 公司)
T7/lac 启动子，IPTG 诱导表达，6 XHis, 标签小，无需切割， 启动子， 诱导表达， 标签小，无需切割， 一般来说，对蛋白活性无影响。纯化及其方便。 一般来说，对蛋白活性无影响。纯化及其方便。
离子交换
选择离子交换剂
根据序列计算等电点 分离纯化的Buffer应使蛋白稳定。 应使蛋白稳定。 分离纯化的 应使蛋白稳定 根据Buffer pH与等电点的大小选择纯化填料 根据 与等电点的大小选择纯化填料 洗脱方式：改变 值或增加盐浓度 洗脱方式：改变pH值或增加盐浓度 ——阴离子交换剂：降低 值，洗脱增加 阴离子交换剂： 阴离子交换剂 降低pH值 ——阳离子交换剂：升高 值，洗脱增加 阳离子交换剂： 阳离子交换剂 升高pH值 ——增加盐浓度，洗脱增加（常用） 增加盐浓度， 增加盐浓度 洗脱增加（常用）
pET28a BL21(DE3)pLysS Lane 1：表达LB 目 的 蛋 白 Lane 4：TB 1 2 3 4 表达LB：LB add 0.2% glucose Lane 3：SOB Lane 2：LB
表达
不同菌株对蛋白表达的影响
不同菌株对表达量的影响 pET28a Lane 1：BL21(DE3) Lane 2：BL21(DE3)pLysS 目 的 蛋 白 Lane 4：BR21CodonPlusRIL Lane 3：Rosetta(DE3)
纯化方法的组合
需要结合待纯化蛋白的特性， 需要结合待纯化蛋白的特性，综合考虑各种纯化方法的适 用条件，选择合适的纯化方法与不同纯化步骤的次序。 用条件，选择合适的纯化方法与不同纯化步骤的次序。 例如： 蛋白纯化时， 中螯合剂（ 例如：His蛋白纯化时，要小心 蛋白纯化时 要小心Buffer中螯合剂（EDTA） 中螯合剂 ） 与还原剂（ 与还原剂（DTT）的影响 ） 而进行离子交换纯化时，则必须考虑 与样品的pH 而进行离子交换纯化时，则必须考虑Buffer与样品的 与样品的 值和离子强度，尤其是细菌裂解后， 值和离子强度，尤其是细菌裂解后，细胞内物质的释放对 pH值与离子强度的影响 值与离子强度的影响 硫酸铵沉淀与透析的搭配使用 包涵体蛋白的变、 包涵体蛋白的变、复性与纯化
+
等电点 蛋 白 质 净 电 吸附于 荷 离子交换剂 Buffer pH值 值 吸附于阴离子交换剂
pH
电
交换剂
选择起始Buffer的pH 选择起始Buffer的 Buffer
一般选择接近中性的pH值 通常情况下，蛋白在中性pH值 一般选择接近中性的pH值，通常情况下，蛋白在中性pH值 pH pH 的缓冲体系中稳定 过酸或过碱的溶液不利于蛋白的稳定， 过酸或过碱的溶液不利于蛋白的稳定，特别对于需要活性 的蛋白，pH值的选择更重要 的蛋白，pH值的选择更重要 缓冲体系的pH与待纯化蛋白的等电点之间， 缓冲体系的pH与待纯化蛋白的等电点之间，一般相差 pH与待纯化蛋白的等电点之间 0.5~1个 0.5~1个pH ——相差过大，蛋白结合牢固，难于洗脱 相差过大， 相差过大 蛋白结合牢固， ——相差过小，蛋白不容易与交换剂结合 相差过小， 相差过小 ——经验性数据，因蛋白与填料而异，有时需要尝试、优化 经验性数据， 经验性数据 因蛋白与填料而异，有时需要尝试、
纯化效果不好
样品没有很好细心去除不溶性物质——可以离心或过滤 样品没有很好细心去除不溶性物质——可以离心或过滤 重复使用前树脂没有洗干净——充分洗净树脂并再生 重复使用前树脂没有洗干净——充分洗净树脂并再生 较多杂蛋白 ——提前终止表达引入的杂蛋白，可采用C ——提前终止表达引入的杂蛋白，可采用C端融合 ——链间二硫键的存在导致杂蛋白出现，可加入还原剂（β ME） ——链间二硫键的存在导致杂蛋白出现，可加入还原剂（β-ME） ——去垢剂（Triton、Tween、NP40） ——去垢剂（Triton、Tween、NP40） ——甘油与NaCl ——甘油与NaCl
Lane 1:全菌蛋白 全菌蛋白 Lane 2:沉淀蛋白（包涵体） 沉淀蛋白（ 沉淀蛋白 包涵体） Lane 3:上清蛋白（可溶） 上清蛋白（ 上清蛋白 可溶）
1
2 3 37℃
1
2 3 25℃
1
2 3 18℃
不同温度下的表达对包涵体蛋白形成的比较
His 蛋白纯化
基本原理 影响纯化的因素 咪唑浓度与pH值——咪唑对蛋白纯化的影响 咪唑浓度与pH值——咪唑对蛋白纯化的影响 离子强度 去垢剂、还原剂与螯合剂 常见问题 带His-tag重组蛋白不吸附到Ni-chelating树脂上 His-tag重组蛋白不吸附到Ni-chelating树脂上 Ni-chelating分离纯化的效果不好 Ni-chelating分离纯化的效果不好 ;
原核表达与常用蛋白质纯化技术探讨
北京全式金生物技术有限公司 www.transgen.com.cn
比较 pET、pMAL、pGEX 表达系统表达和纯化的 pET、pMAL、 优缺点。 优缺点。 介绍pET 表达系统表达条件的优化，纯化技巧。 介绍pET 表达系统表达条件的优化，纯化技巧。 离子交换纯化技巧 未知蛋白如何选择纯化方法，纯化方法如何组合？ 未知蛋白如何选择纯化方法，纯化方法如何组合？ 组合
某些表达载体的表达效率在放大培养时无法提高 主要是溶氧量的问题, 主要是溶氧量的问题, 可以通过在摇瓶中加入不 同量的培养基的方式来确定最佳体积 一般不要超过容器容积的1/10，最多不超过1/5 一般不要超过容器容积的1/10，最多不超过1/5
包涵体
成因： 白合成速度过快，无法正确折叠 成因：蛋白合成速度过快，无法正确折叠 解决办法
选择不同的菌株与载体的组合 降低蛋白表达的速度 影响蛋白积累的速率：温度，转速，IPTG浓度，诱导OD值 影响蛋白积累的速率：温度，转速，IPTG浓度，诱导OD值…… Origami 宿主菌 thioredoxin reductase/glutathione reductase 双突变，帮助形成更多 的二硫键，增加蛋白的可溶性。
蛋白不结合
His-tag被操作过程混入的重金属离子所饱和，可以通过添加 His-tag被操作过程混入的重金属离子所饱和，可以通过添加 0.5mM EDTA来去除重金属离子的干扰 EDTA来去除重金属离子的干扰 His-tag被包裹在不易和树脂发生结合的位置（比较罕见） His-tag被包裹在不易和树脂发生结合的位置（比较罕见）
ຫໍສະໝຸດ Baidu
目 目 的 蛋 白 的 蛋 白
10 20
40
80
120
10 20
40
80
120
咪唑梯度/mM Buffer中咪唑初始浓度 中咪唑初始浓度0 中咪唑初始浓度
咪唑梯度/mM Buffer中咪唑初始浓度 中咪唑初始浓度10mM 中咪唑初始浓度
Buffer中咪唑初始浓度对 中咪唑初始浓度对His 纯化的影响 中咪唑初始浓度对
BL21(DE3) BL21(DE3)pLysS
Rosetta(DE3) BL21CodonPlusRIL BL21CodonPlusRP Origami
适用于富含GC的真核生物基因的表达 的真核生物基因的表达 适用于富含 具有thioredoxin reductase/glutathione reductase 双突 具有 有助于形成更多的二硫键，增加蛋白的可溶性。 变，有助于形成更多的二硫键，增加蛋白的可溶性。
三大系统纯化蛋白比较 MBP 纯化 GST 纯化
MBP 融合蛋白
GST 融合蛋白 GST
MBP
GST 和 MBP 一个浓度一步洗脱，蛋白纯度低。 一个浓度一步洗脱，蛋白纯度低。
His 纯化
杂蛋白
目的蛋白
20
40
80
120
160
咪唑梯度/mM
His 咪唑浓度梯度洗脱，纯化效果 理想。 咪唑浓度梯度洗脱， 理想。
目 的 蛋 白
NaCl浓度 浓度 初始NaCl浓度 浓度20mM 初始 浓度
NaCl浓度 浓度 初始NaCl浓度 浓度50mM 初始 浓度 初始NaCl浓度 浓度100mM 初始 浓度
初始NaCl浓度对离子交换纯化 浓度对离子交换纯化(DEAE)的影响 初始 浓度对离子交换纯化 的影响
常用离子交换剂举例——DEAE FastFlow、P11 DEAE FastFlow、 常用离子交换剂举例
菌株 BL21 启动子 tac (pGEX、 、 pMal) T7 (pET) T7 (pET) T7 (pET) T7 (pET) T7 (pET) T7 (pET) 特性 适用于非T7启动子的表达系统， 适用于非 启动子的表达系统，适用于毒性蛋白的表 启动子的表达系统 达 适用于T7、T7/lac的表达系统，适用于非毒性蛋白的 适用于 、 的表达系统， 的表达系统 表达 含有质粒pLysS，具氯霉素抗性，该质粒含有表达T7 ，具氯霉素抗性，该质粒含有表达 含有质粒 溶菌酶的基因，可降低目的基因的背景表达水平。 溶菌酶的基因，可降低目的基因的背景表达水平。适 用于毒性和非毒性蛋白的表达 补充6种稀有密码子对应的 补充 种稀有密码子对应的tRNA，提高外源基因，特 ，提高外源基因， 种稀有密码子对应的 别是真核基因在原核系统中的表达水平 适用于富含AT的真核生物基因的表达 适用于富含 的真核生物基因的表达
DEAE Sepharose FastFlow: 弱碱型阴离子交换剂， 流速快，使用及再生方便，易于操作。 P11： 属于离子交换纤维素，强酸型阳离子交换剂 交换容量大，回收率高。成本相对低廉。 填料需经过酸洗、减洗等处理步骤，使用前需要充分平衡，操作较 复杂
未知蛋白纯化方法的选择
根据载体选择纯化方法 根据蛋白质性质 热稳定蛋白---热变性初分离 抗体-抗原，底物-抑制剂，例如RNase Inhibitor 纯化----CNBr-activated Sepharose 硫酸铵沉淀与透析 蛋白的稳定与活性——Glycerol 不同纯化方法的组合
pGEX系列 pGEX系列
(GST融合表达 Pharmacia公司 (GST融合表达, Pharmacia公司) 融合表达, 公司)
Tac 强启动子， 强启动子， GST 融合，可溶性表达，纯化难以控制，GST 一步洗脱， 融合，可溶性表达，纯化难以控制， 一步洗脱， 得到的蛋白纯度较低。需要去掉GST. 得到的蛋白纯度较低。需要去掉GST.
选择起始Buffer 选择起始Buffer 中的离子强度
离子强度越低， 离子强度越低，蛋白与离子交换剂结合越紧密 但是， 但是，也会增强其它蛋白的非特异性结合 离子强度越高，蛋白与离子交换剂结合越困难 离子强度越高， 但是，也会抑制其它蛋白与离子交换剂结合，增进特异性结合， 但是，也会抑制其它蛋白与离子交换剂结合，增进特异性结合，有 助于纯化。 助于纯化。 需要通过实验摸索合适的条件， 需要通过实验摸索合适的条件，优化纯化工艺
1
2
3
4
不同菌株对蛋白表达的影响
Another Gene 含有稀有密码子：Rossetta (DE3) 含有稀有密码子：
目的蛋白
1：BL21(DE3)； 2：BL21(DE3)pLysS； 3：Rosetta(DE3)
M 1C
1I
2C 2I
3C
3I
pET28a 载体表达真核基因菌株的优化
蛋白表达的菌株选择
pMAL系列 周质表达, BioLabs公司 pMAL系列 (周质表达, BioLabs公司) 公司)
Tac 强启动子， 强启动子， MBP 融合，可溶性表达，纯化难以控制，Maltose 一步洗 融合，可溶性表达，纯化难以控制， 得到的蛋白纯度较低,需要去掉MBP 脱，得到的蛋白纯度较低,需要去掉MBP 。