秀丽线虫生殖细胞凋亡检测
秀丽线虫生殖细胞凋亡检测
题目：秀丽线虫生殖细胞凋亡检测一．实验目的:1.掌握检测凋亡细胞的方法2.学习使用荧光染料活体染色的方法和步骤二．实验原理1.秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)：是一种无毒无害、可以独立生存的线虫。
其个体小，成体仅1.5mm长，为雌雄同体(hermaphrodites)，雄性个体仅占群体的0.2%，可自体受精或双性生殖；在20°C下平均生活史为3.5天，平均繁殖力为300-350个；但若与雄虫交配，可产生多达1400个以上的后代。
1976年，Sulston和Horvitz利用秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)研究发现，其约13%的体细胞在胚胎发育中注定死亡，使得人们认识到细胞凋亡的遗传基础。
2.荧光染料活体染色：本实验使用吖啶橙(Acridineorange)作为染色剂，该染料对细胞具有慢性毒性，致癌性强，由于凋亡细胞因DNA片段化可结合更多染料，荧光显微镜下呈亮绿色，可在荧光显微镜下快速方便的检测出，适用于多数品系。
三．实验材料及设备1.实验材料：a）各品系秀丽隐杆线虫：N2（实验组）,cedT::gfp（方法对照组），ced-3（阴性对照）b）OP50c）M9培养基d）NGM培养基2.实验设备：a）普通光学显微镜b）载玻片若干，盖玻片若干，铂金丝c）暗箱d）吸水纸、滴管等e）荧光显微镜四．实验方法及步骤1.线虫接种、同步化2.取样：在12孔板培养板上，每孔吸取900UL预先接入少量OP50的M9培养基，每孔用铂金丝挑取培养20~30条成体线虫3.染色：向N2与ced-3品系中每孔加入250ug/mL吖啶橙100uL,混匀后置于培养箱（避光）染色45~60min。
4.方法对照组观察：向ced-1::GFP品系中加入1滴盐酸左旋咪唑,麻痹线虫后在荧光显微镜下观察。
5•恢复：将已染色的线虫吸出置于35mm培养基中，恢复45~60min,使摄入的含染料的OP50排出。
简述细胞凋亡的检测方法
简述细胞凋亡的检测方法
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细胞凋亡检测方法简述如下：
①形态学检测：利用光学显微镜、荧光显微镜乃至透射电子显微镜观察细胞形态变化，如细胞收缩、核染色质浓缩等。
②Annexin V标记：利用Annexin V与磷脂酰丝氨酸特异性结合的特性，荧光标记的Annexin V可检测早期凋亡细胞膜外翻的磷脂酰丝氨酸，结合PI可区分早晚期凋亡与坏死细胞。
③TUNEL染色法：检测细胞DNA断裂情况，通过标记末端脱氧核苷酸转移酶介导的DNA缺口，荧光显微镜下观察凋亡细胞的DNA片段化。
④Hoechst染色：使用荧光染料如Hoechst 33342染色细胞核，观察凋亡细胞核形态的改变，如浓缩、碎裂。
⑤DNA Ladder电泳：提取细胞DNA进行凝胶电泳，凋亡细胞DNA呈现特征性的梯状条带，反映DNA在核小体间的特定位置断裂。
现代细胞生物学技术
细胞凋亡检测技术的发展及应用【摘要】细胞凋亡在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键的角色。
根据死亡细胞的形态学、生物化学和分子生物学特征,可以将凋亡细胞与坏死细胞区别开来。
本文综述了常用的细胞凋亡检测技术与方法的基本原理,如形态学观察、荧光素染色、DNA阶梯、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性的检测等,并对各种方法的优点及局限性做一简要比较。
用透射电镜进行超微结构观察仍是鉴定细胞凋亡的金标准。
在选择细胞凋亡检测方法时,要充分了解各种方法的原理和应用范围,进行综合考虑。
多种检测方法的联合应用常可获得准确的结果。
【国内外研究动态】自1972 年由Kerr 提出细胞凋亡(A pop to sis) 的概念后, 引起细胞生物工作者的注意, 但由于检测技术的限制, 这种细胞现象只停留于形态描述, 缺乏定性、定量、定位的依据, 并未引起病理工作者的重视。
80 年代末, 随着分子生物学, 细胞生物学等学科理论和技术的发展, 凋亡检测技术也有了很大的发展, 特别是1993 年W ijsm an 提出的凋亡细胞DNA片断末端原位标记技术后, 使细胞凋亡的原位检测成为可能, 由此, 促进了对细胞凋亡本质的深入揭示, 也促进凋亡理论在生物医学各领域的广泛应用。
【技术路线】细胞凋亡; 线粒体膜电位; 荧光染料; 流式细胞术细胞凋亡是一种不同于细胞坏死的细胞死亡方式,是在一定的生理或病理情况下,机体为维护内环境的稳定,通过基因调控,激活内源性核酸内切酶而发生的细胞自动消亡的过程,亦称为程序化细胞死亡(programmed cell death , PCD)。
自1972 年Kerr 等。
根据细胞发生了与坏死完全不一样的死亡过程而提出细胞凋亡(apoptosis) 的概念后,引起细胞生物工作者的注意,但由于当时检测技术的限制,这种细胞凋亡现象只停留于形态描述,缺乏定性、定量、定位的依据,并未引起病理工作者的重视。
20 世纪80 年代末,随着分子生物学、细胞生物学等理论和技术的发展, 细胞凋亡检测技术也有了很大的发展。
新课程改革下的高中生物学情境教学：以“细胞的生命历程”为例
新课程改革下的高中生物学情境教学：以“细胞的生命历程”为例情境教学作为一种有效的教学方法，在新课程改革中显得尤为重要。
它能够将抽象的科学知识与学生的日常生活相连接，通过创设具有吸引力的学习情境，激发学生的好奇心和探索欲，从而提升学习效果。
在这种教学模式下，学生不再是被动的知识接受者，而是积极的探索者和思考者。
教师的角色也由知识的传授者转变为引导者和启发者，更多地关注学生思维的开展和能力的培养。
因此，在新课程改革的背景下，探索高中生物学情境教学，尤其是围绕“细胞的生命历程”这一主题的教学方法和实践，不仅是对教学模式的一种创新，更是对生物学教育理念的深刻反思。
这不仅关系到生物学知识的有效传授，更关系到学生对科学探究和生命尊重的态度培养。
情境教学，可以更好地实现教育的根本目的——培养具有创新精神和实践能力的现代公民。
一、引发问题探索在新课程改革的背景下，情境教学法以其独特的魅力成为教学革新的重要工具。
它强调在真实或模拟的情境中进行教学，通过问题导向激发学生的学习兴趣和探究欲望。
情境教学的核心在于创设具有教育意义的情境，让学生在探索和解决问题的过程中主动构建知识，发展思维能力。
在生物学课堂上，教师可以利用这种教学法，将抽象的生物学概念与学生的日常生活相结合，引导学生深入理解生物学现象和原理。
以“细胞的生命历程”这一单元中“细胞的增殖”的课堂教学为例。
（问题导向见表1）师：“让我们想象一下，如果你们能够缩小到细胞的尺寸，进入一个人体细胞内部，你们认为会看到什么？”生：“我想我会看到很多复杂的结构，就像一个小型工厂。
”师：“非常好的比喻！细胞确实像一个高度组织化的微型工厂。
那么，在细胞分裂的过程中，这个‘工厂’会经历哪些变化呢？”生：“细胞分裂时，它的DNA要复制，然后分配到两个新细胞中。
”师：“正确！这就是有丝分裂的基本过程。
那么在这个过程中，细胞是如何确保每个新细胞都得到完整的遗传信息的呢？”生：“这涉及染色体的正确分配和细胞周期的调控。
细胞凋亡检测细胞凋亡实验步骤检测方法
细胞凋亡检测,细胞凋亡实验步骤,检测方法一、定性和定量研究只定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜进行定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA定量琼脂糖凝胶电泳;二、区分凋亡和坏死可将二者区分开的方法：琼脂糖凝胶电泳,形态学观察透射电镜是是区分凋亡和坏死最可靠的方法,Hoechst33342/PI双染色法流式细胞仪检测,AnnexinV/PI 双染色法流式细胞仪检测等;不能将二者区分开的方法：原位末端标记法、PI单染色法流式细胞仪检测等;三、样品来源不同选择组织：主要用形态学方法HE染色,透射电镜、石蜡包埋组织切片进行原位末端标记,ELISA或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳;四、细胞凋亡检测1、早期检测:1 PS磷脂酰丝氨酸在细胞外膜上的检测2细胞内氧化还原状态改变的检测3细胞色素C的定位检测4 线粒体膜电位变化的检测2、晚期检测：细胞凋亡晚期中,核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA,产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段;对于晚期检测通常有以下方法：1 TUNEL末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记2 LM-PCR Ladder 连接介导的PCR检测3 Telemerase Detection 端粒酶检测3、生化检测：1典型的生化特征：DNA 片段化2检测方法主要有：琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记TUNEL等3TUNEL末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记4通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP 多为dUTP间接或直接接到DNA片段的3’-OH端,再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果;可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测;4、LM-PCR Ladder 连接介导的PCR检测当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少如活体组织切片时,直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化;通过LM-PCR,连上特异性接头,专一性地扩增梯度片段,从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段;此外,LM-PCR 检测是半定量的,因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较;如果细胞量很少,还可在分离提纯DNA后,用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶TdT使DNA标记,然后进行电泳和放射自显影,观察凋亡细胞中DNA ladder的形成;上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征,但细胞受到其它损伤如机械损伤,紫外线等也会产生这一现象,因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰;需结合其它的方法来检测细胞凋亡;其它方法：1Telemerase Detection 端粒酶检测端粒酶是由RNA和蛋白组成,它可以自身RNA为模板逆转录合成端粒区重复序列,使细胞获得“永生化”;正常体细胞是没有端粒酶活性的,每分裂一次,染色体的端粒会缩短,这可能作为有丝分裂的一种时钟,表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号;研究发现,90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性;2mRNA水平的检测研究者们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因,检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法;据报道,Fas 蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性T细胞cytotoxic T cells 等靶细胞;Bcl-2 和bcl-X 长的作为抗凋亡bcl-2 和bcl-X的调节物,它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活;用荧光定量PCR技术来检测基因表达水平无疑比之前者更快更准确;通过检测fas, bax-alpha 和bcl-X 长的基因的mRNA表达水平来进行细胞凋亡的检测; 5、细胞内氧化还原状态改变的检测：正常状态下,谷光苷肽GSH作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂;细胞内有毒的氧化物通过被GSH还原而定期去除,氧化型的GSH又可被GSH还原酶迅速还原;这一反应在线粒体中尤为重要,许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除;当细胞内GSH的排除非常活跃时,细胞液就由还原环境转为氧化环境,这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低,从而使细胞色素C三羧酸循环中的重要组分从线粒体内转移到细胞液中,启动凋亡效应器caspase的级联反应;6、细胞色素C的定位检测细胞色素C作为一种信号物质,在细胞凋亡中发挥着重要的作用;正常情况下,它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中,凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞浆,结合Apaf-1 apoptotic protease activating factor-1后启动caspase级联反应：细胞色素C/Apaf-1复合物激活caspase-9,后者再激活caspase-3和其它下游caspase; 7、线粒体膜电位变化的检测：1线粒体跨膜电位的耗散与细胞凋亡有密切关系2近年来陆续有报道说明线粒体跨膜电位的耗散早于核酸酶的激活,也早于磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面;而一旦线粒体跨膜电位耗散,细胞就会进入不可逆的凋亡过程;3在细胞凋亡过程中线粒体跨膜电位的耗散主要是由于线粒体内膜的通透性转变,这是由于生成了动态的由多个蛋白质组成的位于线粒体内膜与外膜接触位点的通透性转变孔道PT孔道能稳定线粒体跨膜电位就能防止细胞凋亡;线粒体在细胞凋亡作用中的进一步证据：1若将纯化的正常的线粒体与纯化的细胞核在一起保温,并不导致细胞核的变化;但若将诱导生成PT 孔道的线粒体与纯化的细胞核一同保温,细胞核即开始凋亡变化;2形态学观察,看到细胞数目有限,统计学上的准确性受影响；3凝胶电泳检测DNA破坏了细胞的完整性也不能测出凋亡细胞占总细胞的比例；4流式细胞术可检测细胞、亚细胞及分子水平的特征性变化;用于流式细胞仪检测的染料：PI、Hoechst、EB、DAPI、丫啶橙等,其中PI、Hoechst 最常用;PI和Hoechst33342双标：PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA或RNA结合;但是PI不能通过正常的细胞膜,Hoechst则为膜通透性的荧光染料,故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏,这时可为PI着红色;正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色,但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形,淡兰色,内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色,或核呈分叶,碎片状,边集; 故PI着色为坏死细胞；亮兰色,或核呈分叶状,边集的Hoechst着色的为调亡细胞;PI和Annexin-V双标：磷脂酰丝氨酸PS正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期或细胞损伤时PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中; Annexin-Vgreen可以和磷脂酰丝氨酸PS特异性结合;因此细胞处于调亡或坏死时,Annexin-V可为阳性早期的坏死细胞可能为阴性;但是只有坏死的细胞PI是阳性五、形态学观察1、普通光学显微镜观察2、透射电子显微镜观察3、荧光显微镜观察1、普通光镜下观察：1用苏木素-伊红HE染色：细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色凋亡细胞,正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色,坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失2Giemsa染色法、瑞氏染色法等,正常细胞核的色泽均一,凋亡细胞染色变深,坏死细胞染色浅或没染上颜色直接用倒置显微镜观察：1细胞体积变小,全面皱缩；2凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围;2、透射电子显微镜观察凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩;细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状或呈折缝样,部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体;3、荧光显微镜常用的荧光染料：丫啶橙、PI 、DAPI、Hoechst33258 和Hoechst33342、EB等Hoechst 33342、Hoechst 33258、DAPI三种染料与DNA的结合是非嵌入式的,主要结合在DNA的A-T碱基区;紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光;1PI双染色法基本原理Hoechst是与DNA特异结合的活性染料,能进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用;Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高;DAPI为半通透性,用于常规固定细胞的染色;碘化丙啶PI是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而将细胞核染红;因此将Annexin-V与PI匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来;注意事项：细胞凋亡时,其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一,但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低,或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致;在分析结果时应该注意;六、细胞凋亡的分子生物学检测方法:细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程,染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段;然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca ²+和Mg²+依赖的核酸内切酶作用下,在核小体单位之间被随机切断,形成180～200bp核小体DNA多聚体;DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶TdT的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端,从而可进行凋亡细胞的检测,这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法TUNEL;由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3’-OH形成,很少能够被染色;低分子量的DNA分离后,也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译nick translation,使低分子量的DNA标记或染色,然后分析凋亡细胞;TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征,可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定,并可检测出极少量的凋亡细胞,灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高,因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用;过氧化物酶标记测定法原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛digoxigenin-11-dUTP在TdT酶的作用下,可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端,与dATP形成异多聚体,并可与连接了报告酶过氧化物酶或碱性磷酸酶的抗地高辛抗体结合;在适合底物存在下,过氧化物酶可产生很强的颜色反应,特异准确的定位出正在凋亡的细胞,因而可在普通光学显微镜下进行观察;毛地黄植物是地高辛的唯一来源;在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体,因而非特异性反应很低;抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反应不到1％,若此抗体的Fc部分通过蛋白酶水解的方法除去后,则可完全排除细胞Fc受体非特异性的吸附作用;本方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培养的或从组织中分离的细胞凋亡测定;一试剂配制1、磷酸缓冲液PBS：磷酸钠盐50mM,NaCl 200mM;2、蛋白酶K200μg/ml,：蛋白酶K 0.02g；PBS 100ml;3、含2%H2O2的PBS缓冲液：H2O2 ；PBS缓冲液;4、TdT酶缓冲液新鲜配：Trlzma碱3.63g用HCl调节pH至,加ddH2O定容到1000ml；再加入二甲砷酸钠29．96g和氯化钴0.238g;5、TdT酶反应液：TdT酶32μl；TdT酶缓冲液76μl,混匀,置于冰上备用;6、洗涤与终止反应缓冲液：氯化钠17. 4g；柠檬酸钠8.82g；ddH2O 1000ml7、％二氨基联苯DAB溶液：DAB 5mg；PBS 10ml,, 临用前过滤后,加过氧化氢至%;8、％甲基绿：甲基绿0.5g；0.1M乙酸钠100ml;9、100％丁醇,100％、95％、90％、80％和70％乙醇,二甲苯,10％中性甲醛溶液,乙酸,松香水等;10、过氧化物酶标记的抗地高辛抗体ONCOR二实验步骤1、标本预处理：1石蜡包埋的组织切片预处理：将组织切片置于染色缸中,用二甲苯洗两次,每次5min;用无水乙醇洗两次,每次3min;用95％和75％乙醇各洗一次,每次3min;用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液20ug／ml,于室温水解15min,去除组织蛋白;用蒸馏水洗4次,每次2min,然后按下述步骤2进行操作;2冰冻组织切片预处理：将冰冻组织切片置10％中性甲醛中,于室温固定10min后,去除多余液体;用PBS洗两次,每次5min;置乙醇：乙酸2：1的溶液中,于-20℃处理5min,去除多余液体;用PBS洗两次,每次5min,然后按下述步骤2进行操作;3培养的或从组织分离的细胞的预处理：将约5 × 107个/ml细胞于4％中性甲醛室温中固定10min;在载玻片上滴加50～100μl细胞悬液并使之干燥;用PBS洗两次,每次5min,然后按下述步骤2进行操作;2、色缸中加入含2％过氧化氢的PBS,于室温反应5min;用PBS洗两次,每次5min;3、用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体,立即在切片上加2滴TdT酶缓冲液,置室温1～5min;4、用滤纸小心吸去切片周围的多余液体,立即在切片上滴加54μl TdT酶反应液,置湿盒中于37C反应1hr注意：阴性染色对照,加不含TdT酶的反应液;5、将切片置于染色缸中,加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液,于37℃保温30min,每10min将载玻片轻轻提起和放下一次,使液体轻微搅动;6、组织切片用PBS洗3次,每次5min后,直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体,于湿盒中室温反应30min;7、用PBS洗4次,每次5min;8、在组织切片上直接滴加新鲜配制的％DAB溶液,室温显色3～6min;9、用蒸馏水洗4次,前3次每次1min,最后1次5min;10、于室温用甲基绿进行复染10min;用蒸馏水洗3次,前两次将载玻片提起放下10次,最后1次静置30s;依同样方法再用100％正丁醇洗三次;11、用二甲苯脱水3次,每次2min,封片、干燥后,在光学显微镜下观察并记录实验结果;三注意事项一定要设立阳性和阴性细胞对照;阳性对照的切片可使用DNaseI部分降解的标本,阳性细胞对照可使用地塞米松1μM处理3-4hr的大、小鼠胸腺细胞或人外周血淋巴细胞;阴性对照不加TdT酶,其余步骤与实验组相同;一、吖啶橙简称AO荧光染色法原理：吖啶橙Acridine Orange是吖啶的衍生物之一;它是一种荧光染料,激发峰492nm,荧光发射峰530nmDNA,640nmRNA,它与双链DNA的结合方式是嵌入双链之间,而与单链DNA和RNA则由静电吸引堆积在其磷酸根上;在蓝光给502nm激发下,细胞核发亮绿色荧光约530nm,核仁和胞质RNA发桔红色荧光＞580nm;吖啶橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光,但细胞固定阻抑了这种结合,从而主要显示DNA、RNA两种核酸;1试剂AO贮备液：AO 50mg分析纯蒸馏水 50ml4℃冰箱保存4个月;Tris缓冲液：Tris 50mmol/LMgCl2 LKCl 25mmol/LAO工作液：将AO贮备液10:1用蒸馏水稀释,再用Tris缓冲液将AO稀释到μg/ml的终浓度;2操作步骤①取乙醇固定的细胞悬液,浓度为107/ml,1500r/min,5分钟,弃乙醇;②加入2ml AO工作液,室温染10分钟;③滴在载玻片上,加缓冲甘油封片;④在荧光显微镜下用吸收波长405nm,发射波长530-640nm观察;结果：活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光;凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体;二、Hoechst33258染色Hoechst33258为特异性DNA染料,,与A-T键结合,但在环境下则优先与RNA 结合,染色DNA时应调整染液的pH至,这种染料不溶于磷酸缓冲液；所以配制时必须先以蒸馏水溶解配成储存液在4℃中避光保存;本方法是用于培养细胞、细胞涂片或细胞甩片;试剂及配制1Hoechst33258贮存液：称取Hoechst33258试剂1mg,用20ml蒸馏水溶解后,滤过,4℃避光保存;用时蒸馏水10倍稀释成染色液;2 ,;3封片液：20mmol/L柠檬酸,50mmol/L 磷酸氢二钠,50%甘油;4细胞固定液：甲醇/冰乙酸3:1,现配;操作方法1原代细胞培养、细胞学涂片或细胞甩片机制制备的单细胞片;2细胞固定液4℃固定5min;3蒸馏水稍洗后,点加Hoechst33258染色液,10min;4蒸馏水洗片后,用滤纸沾去多余液体;5封片剂封片后荧光显微镜观察;结果：在荧光显微镜下,活细胞核呈弥散、均匀荧光,坏死细胞不被Hoechst 染色;出现细胞凋亡时,细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状蓝色荧光及明显核形态变化,如果见到3个或3个以上的DNA荧光碎片被认为是凋亡细胞;三、甲基绿-派诺宁染色法一原理细胞凋亡和细胞坏死均可表现为细胞核固缩等细胞死亡形态,但两者发生机制不同;细胞凋亡是一种细胞主动死亡过程,需要有细胞内蛋白酶的激活,细胞质内常有mRNA表达的增强;而细胞坏死是一种被动的细胞死亡过程,细胞质内常有RNA的损失;根据这一特点,可应用试剂甲基绿对DNA染色的特异性和派诺宁对RNA的亲和性,使甲基绿对固缩细胞核内的脱氧核糖核酸着染,如果细胞质内核糖核酸呈派诺宁阳性染色者为凋亡细胞,呈阴性染色者为坏死细胞;二试剂及配制1. 组织固定液无水乙醇 600ml氯仿 300ml冰醋酸 100ml2.甲基绿纯化新购买的甲基绿需用氯仿进行纯化处理以去除甲基紫;方法是将2％甲基绿水溶液20ml倾入洁净分液漏斗,加入氯仿20ml充分,使其内的甲基溶于氯仿中而呈紫红色;旋动分液漏斗下部的砂塞,慢慢把下沉带比红色的氯仿移去,再加入新的氯仿10ml,如此反复更换氯仿,直到无紫红色为止;该液作为贮存液,4℃保存;3.染色液甲基绿贮存液 5ml5%派诺宁水溶液 1ml蒸馏水 12mlL乙酸钠 18ml临用前配制,滤纸过滤;三操作方法1.新鲜取材组织置固定液中4℃固定3-6h或培养细胞、细胞学甩片固定10min;2.直接转入95%乙醇脱水和无水乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋;3.切片经二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化至蒸馏水;细胞学涂片不用梯度酒精4.置染色液中室温下染色约1h;5.取出切片,不经水洗,用滤纸吸干多余染液;6.插入丙酮中迅速分化;7.转入丙酮二甲苯1:1稍洗;8.二甲苯透明2-3次;9.中性树胶封固;四结果光学显微镜下凋亡细胞固缩,细胞核呈绿色或绿蓝色着染,胞质呈红紫色着染,坏死细胞只有固缩细胞核呈绿色着染;观察时可用凋亡指数进行计数,即随机选择约10-20个视野每张切片约1000-2500个细胞,计数凋亡细胞百分率;四、TdT介导的dUTP缺口末端标记技术TUNEL原理：在机体内部随时都在发生着细胞的死亡;传统上用显微镜来观察细胞的死亡,其特征为核染色质的浓缩及碎片的形成;但是这种现象出现的很晚,时间也很短暂;凋亡的特征是内源性核酸内切酶被激活,细胞自身的染色质或DNA被切割,出现单链或双链缺口,并产生与DNA断点数目相同的3ˉ-OH 末端;末端脱氧核糖核酸转移酶Terminal deoxynucleotidyl Transferase TdT可以将地高辛标记的dUTPDIG-dUTP标记至3’-OH末端,DIG-dUTP核苷酸结合在DNA断点部位,可以通过生物标记的抗地高辛抗体Anti-DIG-Biotin反应后,再结合链酶亲和素-过氧化物酶SABC,然后加入显色底物DAB予以显示;凋亡的细胞核呈棕黄色,从而可以在显微镜下观察到着色的凋亡细胞;试剂1.标记缓冲液Labeling Buffer5×浓度的TdT反应缓冲液,含有以下成分：500mmol/L二甲胂酸钾;10mmol/L CoCl2 氯化钴1mmol/L DTT二硫苏糖醇2.末端脱氧核糖核酸转移酶TdT,×20×204.封闭液Blocking Reagent5.生物素化抗地高辛抗体×100×100×2008.抗体稀释液9. 多聚赖氨酸或APES;10. 0.01M TBS,配法：1L双蒸馏水中加入8.5克氯化钠,1.2克Tris和纯乙酸;11. DAB显色试剂;操作步骤1.样品处理1玻片预先用多聚赖氨酸或APES进行处理;2细胞涂片和冰冻切片：最重要的是及时固定;用4%多聚甲醛/0.01M PBS室温下固定30-60分钟;0.01M PBS洗2分钟×2次;蒸馏水洗涤2分钟×2次; 3组织：有条件时应及时固定;常规4%多聚甲醛/0.01M PBS或10%中性缓冲福尔马林固定4小时以上,石蜡包埋;切片常规脱蜡入水脱蜡务必干净;2.新鲜配制3%H2O2,室温处理10分钟;蒸馏水洗涤2分钟×3次;3.标本片加0.01M TBS1:200新鲜稀释Proteinase K37℃消化5-15分钟,0.01M TBS洗2分钟×3次;细胞涂片和冰冻切片一般不消化或消化10-60秒钟;新鲜石蜡切片消化5-10分钟;陈旧石蜡切片消化10-30分钟;4.标本片加标记缓冲液Labeling Buffer20μl/片,以保持切片湿润;按每张切片取TdT和DIG-d-UTP各1μl,加入18μl标记缓冲液中,混匀;甩去切片上多余液体后加标记液,20μl/片;置样品于湿盒中,37℃标记2小时;5.0.01M TBS洗2分钟×3次;6.加封闭液50μl/片,室温30分钟,甩掉封闭液,不洗;7.用抗体稀释液1:100稀释生物素化抗地高辛抗体：取1ml抗体稀释液加生物素化抗地高辛抗体10μl,混匀后50μl/片加至标本片上;置样品于湿盒中,37℃反应30分钟;0.01M TBS洗2分钟×3次;8.用抗体稀释液1:100稀释SABC：取1ml抗体稀释液加SABC10μl,混匀后50μl/片加至切片;37℃反应30分钟;0.01M TBS洗5分钟×4次;显色;10.苏木素轻度复染;脱水,透明,封片;显微镜观察;结果判定细胞核固缩有的呈碎片状,不规则,大小不一致,呈棕黄色颗粒者为阳性细胞; 即凋亡的细胞TUNEL改良方法在细胞凋亡检测中的应用.0M枸橼酸盐缓冲液、通透液%Triton-100、枸橼酸钠、标记缓冲液：二甲胂酸钠100mmol/L标记、二巯基苏糖醇L,氯化钴coci;TdT反应液；标记缓冲液中加TdT酶100U/ml,biotin-dUTP；链霉菌素标记的辣根过氧化物酶,蛋白酶K20μg/ml;显色剂氨乙基咔唑amino ethyl carbazole,AEC的配制AEC 20mg二甲酰胺DMF0.05M醋酸缓冲液 50ml%H2O2实验步骤1切片用冷风吹干后为防止冰冻切片脱片用1%火棉胶封片1分钟,PBS漂洗3×5分钟；23%H2O2阻断10分钟后PBS洗3×5分钟；3组织切片浸泡于盛有L枸橼酸盐缓冲液的烧杯中,置于微波炉内,在650W,辐射时间15min的条件下进行组织处理;冷却至室温;4放在通透液%Triton -100溶于%枸橼酸钠溶液中室温20分钟,PBS漂洗3×5分钟；5滴加50μl TdT反应液37℃1h,PBS漂洗3×5分钟；6滴加50μl biotin-dUTP,反应液37℃1h,PBS漂洗3×5分钟；7滴加50μl链霉菌标记辣根过氧化物酶液37℃孵育30分钟,8PBS漂洗3×5分钟, AEC-H2O2显色10-15分钟,苏木素复染用1%的酸性水分化,水洗、水溶性封片;阳性对照dTd 反应前用20μg/ml蛋白酶K处理切片;阴性对照用PBS代替dTd反应液; 结果判断及标准改良的方法：凋亡细胞核呈红色固缩,有白边集或碎列,细胞膜皱褶,有的卷曲和出泡,在计数时避开坏死区域,以避免假阳性;计数500个细胞中的凋亡细胞数目,得出凋亡百分率;凋亡染色分度如下：每个高倍视野平均1-3个为Ⅰ级；3-6个为Ⅱ级；6-10个为Ⅲ级；>10个者为IV级;阳性对照：经在dTd反应认前用20μg/ml蛋白酶,处理切片30分钟的切片同改良方法基本相同,但红色较浅;阴性对照：切片无棕色反应;评价正常的或正在增殖的细胞没有DNA的断裂,没有3’-OH末端被标记,因此镜下无显色的物质;这种分子生物学与形态学相结合的方法,可以对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行标记,准确反应细胞凋亡最典型的生物化学与形态学特征,灵敏度远远高于一般的组织化学和生物化学方法;在检测过程中,可设阴性对照不加TdT阳性对照已知的阳性标本;注意:AEC孵育切片,反应产物为红色;可用苏木精对衬染色,反应产物是纯酒精溶性的,因此;可用酸性水溶液分化,然后用水溶性封固剂封片;五、凋亡细胞：凝胶电泳检测前已提及凋亡细胞的突出特征是由于内源性核酸内切酶的激活而导致细胞核DNA的断裂;典型的细胞凋亡,在核内形成大量200bp大小及其倍体的核苷酸片段,而非典型的凋亡细胞,由于核内的DNA降解不完全,仅形成300~50kb的DNA大片;利用这一特性,可通过DNA凝胶电泳来判定凋亡的发生和发展情况;试剂1. PBS缓冲液2. 消化液的配制：100mmol/L NaCl10mmol/L Tris-HCL25mmol/L EDTA%SDSml蛋白酶K3. 酚：氯仿：异戊醇混合液按25:24:1比例配制;4. 氯仿：异戊醇混合液按24:1比例配制;5. 醋酸铵,L;6. 100%和70%的乙醇;7. TE 缓冲液：100mmol/L Tris-HCL,5mmol/L EDTA;8. TBE缓冲液;9. 电泳仪;。
秀丽隐杆线虫在药物筛选中的应用
秀丽隐杆线虫在药物筛选中的应用秀丽隐杆线虫是一种常见的实验室模式生物，通常被用于生理学、神经学和药理学等研究领域。
随着科技的不断发展，人们越来越发现秀丽隐杆线虫的潜力以及应用价值，尤其是在药物筛选过程中。
下面，本文将为大家介绍秀丽隐杆线虫在药物筛选中的应用。
秀丽隐杆线虫的基本特点秀丽隐杆线虫的一个重要特点是其生命周期短。
它的寿命大约为2-3周，从卵发育到成虫只需要3到4天，这使得生物实验更方便、快捷。
此外，秀丽隐杆线虫的身体结构简单，易于观察、操作和控制。
药物筛选药物筛选（Drug screening）是将可能具有治疗作用的化学物质进行筛选，以发现新的药物或治疗手段的过程。
经过多年的探索和发展，人们已经发现了一些能够抑制乃至治愈某些疾病的药物。
但是，受到次级反应、耐药性以及毒副作用的限制，现行的药物仍然存在局限性。
因此，对药物的筛选和研发仍然是重要的科学问题。
秀丽隐杆线虫在药物筛选中的应用秀丽隐杆线虫作为一种便于操作的模式生物，可应用于各种药物筛选实验。
其基本筛选过程通常分为以下几个步骤：1.选择适当的突变体作为实验对象线虫有数千种基因变异体可用于研究。
因此，选择适当的突变体可大大提高实验的成功率。
例如，翻译抑制线虫能够胜任神经学实验，易造成神经元死亡的突变体便于设计细胞毒性实验。
2.将样本与药物混合在进行实验之前，需要将样本与待测药物混合。
线虫通常生活在标准培养液中，药物可通过不同的给药方式添加入培养液。
比如，可直接加入到培养液或用食物富含药物等等。
3.检测线虫反应添加药物后，需要观察并记录线虫的反应。
由于线虫身体简单，因此人们可以便捷地观察突变体或线虫的行为、发育和生存等指标，如运动速度、排便频率、生育率以及寿命等。
4.分析数据采集反应记录数据后，通常需要进行统计学分析处理，来证明线虫是否与药物有明显的互动影响。
秀丽隐杆线虫在药物筛选中的亮点基于其适用范围广泛、反应速度快等特点，秀丽隐杆线虫已经逐渐成为药物筛选中不可或缺的一种重要类别。
河南省豫西北教研联盟(许洛平)2024-2025学年高三上学期第一次质量检测生物试题含答案
豫西北教研联盟（许洛平）2024—2025学年高三第一次质量检测生物学（答案在最后）注意事项：1．答卷前，考生务必将自己的姓名、考生号、考场号和座位号填写在答题卡上，将条形码贴在答题卡条形码粘贴处。
2．作答选择题时选出每小题答案后，用铅笔在答题卡对应位置涂黑，如需改动用橡皮擦干净后再选涂其他答案。
3．非选择题用黑色字迹的签字笔作答，答案必须写在答题卡指定位置上，不准使用铅笔和涂改液，不按以上要求作答无效。
4．考生必须保证答题卡的整洁。
考试结束后，将答题卡交回。
一、选择题：本题共16小题，每小题3分，共48分。
每小题只有一个选项符合题目要求。
1.糖类和脂质在细胞的生命活动中具有重要作用，下列叙述错误的是（）A.糖被与细胞表面的识别、细胞间的信息传递等功能有密切关系B.胆固醇是构成动物细胞膜的重要成分，并参与人体血液中脂质的运输C.糖类在供应充足的情况下，可以大量转化为脂肪D.等量的脂肪比糖类含能量多，因此脂肪是生物体主要的能源物质【答案】D【解析】【分析】糖类和脂肪之间可以相互转化，但转化是有明显差异的。
【详解】A、糖被（糖蛋白）存在于细胞表面，与细胞表面的识别、细胞间的信息传递等功能密切相关，A正确；B、胆固醇是构成动物细胞膜的重要成分，同时还参与人体血液中脂质的运输，B正确；C、在糖类供应充足的情况下，多余的糖类可大量转化为脂肪储存起来，C正确；D、虽然等量的脂肪比糖类含能量多，但糖类是生物体主要的能源物质，脂肪是主要的储能物质，D错误。
故选D。
2.“结构与功能相适应”是生物学的基本观点，下列与该观点不一致的是（）A.载体蛋白的磷酸化导致其空间结构发生变化，活性也被改变B.细胞的生物膜系统为细胞器提供结构支撑，维持细胞形态C.真核细胞内的膜结构将细胞区室化，保证生命活动高效有序地进行D.人的红细胞储存大量的血红蛋白，主要承担运输氧气的作用【答案】B【解析】【分析】生物膜系统的功能：（1）保证内环境的相对稳定，对物质运输、能量转换和信息传递等过程起决定作用。
浅析秀丽隐杆线虫被大量用于筛选抗衰老药物的原因和相关实验步骤
浅析秀丽隐杆线虫被大量用于筛选抗衰老药物的原因和相关实验步骤作者：彭宇昀来源：《健康前沿》2019年第04期摘要：秀丽隐杆线虫是研究老化现象的重要模型生物，已经使用了近40年，在对具有延缓衰老作用的相關药物进行初步筛选方面具有重大贡献。
本文通过对有关文献和实验进行分析，就秀丽隐杆线虫被大量应用于筛选抗衰老化合物的原因和有关实验展开研究，分析利用秀丽隐杆线虫进行抗衰老药物筛选的优点，总结相关实验步骤，得出秀丽隐杆线虫细胞数目固定，与人类基因同源性较高且易养殖是其用于进行药物筛选的重要原因。
总结出进行实验时需要充分考虑，排除如待测的相关药物对OP50菌液的抑制性等无关变量对实验结果的影响。
关键词：秀丽隐杆线虫，抗衰老，筛选，原因秀丽隐杆线虫作为模式生物在生命科学的各项研究中使用广泛，大量运用于抗衰老药物的筛选。
[1]近年来，有研究提出诸如阿司匹林，二甲双胍等常用药物成分具有延缓人体衰老的功能，而秀丽隐杆线虫在对这类化合物的筛选过程中起了重要作用。
本文将探究秀丽隐杆线虫被广泛应用于抗衰老化合物筛选的原因。
1 原因分析1.1自身原因1.1.1 细胞数量固定经研究发现，秀丽隐杆线虫在其幼虫时期有556个体细胞和2个原始生殖细胞。
秀丽隐杆线虫的成虫可分为：雄性个体和雌雄同体个体两类，其中雄性成熟个体有1031个体细胞和1000个生殖细胞，雌雄同体成熟个体含有959个体细胞和2000个生殖细胞。
固定的细胞数量使研究人员可以更容易对比不同化合物的作用下，同种细胞在不同个体中在药物作用下的具体变化，减少无关变量的产生，使不同个体（如：用抗衰老药物处理和不用抗衰老药物处理的个体）的同种细胞之间差异性的比较更具有说服力。
同时，可以更好的探究药物在具体细胞中的作用方式、具体效果，探究对应化合物具有抗衰老作用的原因。
1.1.2 生殖能力强，雌雄同体相关文献表明，当秀丽隐杆线虫的雌雄同体成熟个体自体受精时可产生200～300颗卵，而雄性成熟个体与雌雄同体成熟个体交配，发生异体受精时可以产生1000多颗卵。
关于秀丽隐杆线虫的综述
关于秀丽隐杆线⾍的综述关于秀丽隐杆线⾍的综述⽣物153班刘通宇摘要：本⽂为关于秀丽隐杆线⾍的综述⽂章，主要介绍了秀丽隐杆线⾍的⼀些基本信息，并结合这些基本信息引出秀丽隐杆线⾍的细胞周期、神经系统等⽅⾯的研究价值与药物筛选、毒性评价⽅⾯的应⽤价值，并结合以上信息讨论笔者对于秀丽隐杆线⾍研究现状的评价以及在药理、进化论等⽅⾯的应⽤与研究展望，并探讨了其在回答⽣命意义中的价值。
关键词：秀丽隐杆线⾍；研究价值；应⽤价值Abstract: This is a summative article about Caenorhabditis elegans, mainly introduced some of the essential information and then elicit the research value on the cell circle, nervous system, and also applications value on medicine screening, toxicity assessment. At the end, the author gives out his personal assessment about the research that had been conducted, and also introduced his personal prospect about the application and research in pharmacology and evolutionism, etc. It also discussed the Caenorhabditis elegans’ role in answer ing the question for the meaning of life.Key words:Caenorhabditis elegans; research value; application value模式⽣物是⽣物学家实验中⽤于探究某种普遍⽣命现象的⽣物物种。
秀丽隐虫生殖细胞凋亡实验
3、CED-1::GFP标记法
CED-1是跨膜蛋白，在lim-7启动子作用下，在 鞘细胞表达，在凋亡过程中，CED-1::GFP蛋 白簇聚于凋亡细胞周围，不需要染色，但用于 其它品系需要进行遗传操作。
三、实验过程
1、品系：N2, ced-1::gfp，ced-4, ced-1; ced-5，OP50
4、接种
5、线虫保存
常规低温保存：贮存线虫的方法之一是在16-20℃条件下， 每隔2-3个月接种一次
冷冻保存：S-缓冲液，129 ml 0.05 M K2HPO4, 871 ml 0.05 M KH2PO4, 5.85 g NaCl，115℃灭菌20分钟；冷冻液：S-缓冲液 700ml+ 灭菌甘油300ml，混匀；1.8ml冻存管，高压灭菌。
115℃灭菌20min, 冷却后加1 ml 1 M MgSO4；可使用Kmedium替代M9，比较方便：52mMNaCl, 32mM KCl 250μg/ml吖啶橙
50mM NaN3 NGM （35mm）
实验设计
N2野生型 ced-4 Apaf 敲除，阴性对照
ced-1; ced-5，阳性对照
秀丽线虫生殖细胞凋亡检测
一、背景简介
1976年，Sulston和Horvitz利用秀丽隐杆线虫 （Caenorhabditis elegans）研究发现，其约13%的 体细胞在胚胎发育中注定死亡，使得人们认 识到细胞凋亡的遗传基础。
体细胞959，生殖细胞超过2000个，其中精子 约300个，卵子稍多一些，约一半注定凋亡。
2、设备：超净工作台，恒温培养箱，摇床，普通培养箱， 荧光显微镜，体视显微镜，高压灭菌锅，离心机，移液器 1000, 200, 10μ 。
3、实验耗材：12孔板或35mm培养皿，60或90mm培养皿， 铂金针，1000, 200, 10μ吸O4，5 g NaCl加水至1L，
秀丽线虫
秀丽线虫的研究进展秀丽线虫(Caenorhadits elegans)是研究动物遗传、个体发育及细胞生命活动的重要模式动物。
近年来，国际上以秀丽线虫为实验材料的生命科学研究取得了重要突破，分别在2002 年和2006 年两次获得诺贝尔生理医学奖。
在国内，越来越多的科研人员开始将秀丽线虫应用于自己的研究领域。
近年来，随着人们对其的研究日益深人，秀丽隐杆线虫以其独特的优势成为生物学家借以了解诸多基本生命现象的优良。
秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)在当代生命科学的发展过程中起着举足轻重的作用。
20 世纪60年代，分子遗传学的奠基人之一Brenner在和Crick等人一起确立了分子遗传学的中心法则以后，感到分子生物学的主要问题已经解决，生物学的未来应着眼于发育生物学和神经生物学等复杂问题的研究。
Brenner 试图寻找一种比果蝇更简单的、具有神经细胞的多细胞生物来探索个体及神经发育的遗传调控机制。
在经过了一系列的尝试后，他最终选择了秀丽线虫(C. elegans)为研究对象。
在此之前，Nigon 和Dougherty等已经在秀丽线虫的营养生长和有性生殖等方面做了许多前期工作。
线虫作为模式动物的优势线虫的饲养条件具有简单、廉价、易操作的特点，线虫成虫体长1mm,身体半透明,以大肠杆菌为食饵,从受精卵发育到成虫仅需不到四天时间。
在自然状态下线虫是一种可以自我繁殖的雌雄同体生物,因此繁殖起来也很迅速,这种能自我繁殖的能力还非常有利于得到具有同一基因结构的纯合体线虫。
另外,秀丽线虫还存在一种雄性个体,它不能自我繁殖,必须与雌雄同体的线虫交配才可繁衍后代。
利用雄性个体,人们可以将突变基因从一种线虫转移到另一种线虫中去。
线虫还可以像培养细胞一样保存在- 80℃。
这一优势是果蝇和小鼠等模式生物所不具备的。
秀丽线虫是第一个完成基因组测序的动物,它的约20 000个基因中有40%和人类基因具有同源性。
细胞凋亡的检测方法
细胞凋亡的检测方法
细胞凋亡的检测方法有多种，下面是其中几种常见的方法：
1. DNA片段化检测：细胞凋亡的一个特征是DNA片段化，这可以通过凝胶电泳或荧光标记DNA片段进行检测。
凝胶电泳可以观察到DNA在凋亡时被酶切成特定大小的片段，而荧光标记的DNA片段可以通过流式细胞仪进行定量检测。
2. 细胞膜的改变检测：细胞凋亡时，细胞膜上的磷脂从内层转移到外层，露出磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）。
这可以通过荧光染料如annexin V 与细胞膜上的PS结合来检测。
3. 细胞色素C释放检测：细胞凋亡会引起线粒体内的细胞色素C释放到胞浆中。
可以使用免疫荧光染色技术来检测细胞色素C的定位。
4. DNA染色：细胞凋亡时，细胞核会出现特征性的形态变化，如染色质凝集和核片断。
这可以通过荧光染色剂如荧光素磷酸酯（propidium iodide）和核染色素如Hoechst 33342来观察细胞核的形态变化。
这些方法可以单独应用或结合使用，以便对细胞凋亡进行准确的检测和定量分析。
十溴联苯醚对秀丽隐杆线虫毒性研究_王赢利陈建松阳宇翔解启来
十溴联苯醚（BDE-209）因具有良好的阻燃性能，被广泛添加到塑料、尼龙、涤棉纺织物、电 路板及建筑材料中。对于 BDE-209 的生物毒性，普遍认为是其在自然界缓慢降解成低溴物质而导致 的[1-3]，但是目前越来越多的研究表明，BDE-209 自身的生物毒性也不可忽视，它会导致小鼠体外受 精率降低，影响受精卵的早期发育[4]；会对中华哲水蚤的谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、谷胱甘肽 巯基转移酶（GST）和谷胱甘肽还原酶（GR）造成胁迫[5]；还会对菲律宾蛤仔外套膜抗氧化基因活 性产生抑制作用[6]。 目前有关 BDE-209 毒性学研究对象主要集中在鼠[4, 7]、 蚯蚓[8]、 水生物[5]、 鱼类[9]、 土壤微生物及其土壤酶活性[10-11]等方面，而以秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans, C. elgans)为模式 生物的毒理研究鲜有报导。 土壤中的秀丽隐杆线虫，其结构简单，通体透明，试验周期短，30% 的基因与哺乳动物基因组 同源，且全部基因均被解码，已被成功运用于生命科学领域的毒理研究[12-14]。铜、铅、镉等重金属 以及毒死蜱、芳烃、有机磷农药等有机污染物对秀丽隐杆线虫的毒理研究表明[15- 16],该模式生物能很 好地感知浓度的变化，为污染物毒性机理提供理论依据。本研究以秀丽隐杆线虫为对象，分析 BDE-209 对其产卵率、寿命以及体内超氧化物歧化酶基因（sod-3）、类 p-53 蛋白基因（cep-1）、 细胞色素 P450 基因（cyp35a2）、谷胱甘肽转移酶基因（gst-1）的影响，以期为 BDE-209 生殖、细 胞及分子水平毒性研究提供参考数据。
注： P， 亲代； F， 子代。 同一行中不同小写字母显著差异 （p <0.05） Note: P, Parental generation； F， Filial generation. Different lowercase letters in the same column mean significant difference（p < 0.05）
2021 高考生物 培优练习 细胞的生命历程(含答案)
2021高考生物培优练习细胞的生命历程1.效应T细胞能释放一种插入到靶细胞膜上的成孔蛋白(穿孔素)，促使靶细胞裂解。
相关机理如图，以下推测正确的是( )A.穿孔素属于分泌蛋白，在其合成分泌的过程中依次经过的膜结构有核糖体、内质网、高尔基体以及细胞膜B.穿孔素合成基因也存在于吞噬细胞中C.穿孔素参与调节的方式属于体液免疫，靶细胞死亡属于细胞凋亡D.由图可知穿孔素促进Na+内流进而改变细胞内渗透压，并且Na+内流需要消耗能量2.下列关于细胞生命历程的叙述，错误的是( )A.细胞内磷脂、DNA.蛋白质等物质受自由基攻击，可能导致细胞衰老B.原癌基因能阻止细胞不正常增殖，避免细胞发生癌变C.正在发育以及发育成熟的生物体中都会发生细胞凋亡，且数量惊人D.受精卵和早期胚胎细胞都是具有全能性的细胞3.下图是环境对酵母菌生存状态调节示意图。
当酵母菌细胞生活环境中缺乏存活因子时，细胞会启动自噬作用(通过溶酶体将自身一些大分子物质水解)，以延缓细胞的快速凋亡。
据图分析，下列有关叙述正确的是( )A.细胞凋亡只受基因调控，与环境无关B.自噬作用是细胞通过溶酶体将自身物质氧化分解提供能量C.自噬作用能够延缓细胞因营养物质不足而死亡D.Akt、mTor发挥作用导致细胞启动自噬作用4.科学家对于衰老起因的研究仍在摸索前行，《衰老生物学》中将衰老的定义修正为“衰老是由时间推移，以及与环境相互作用而引起的分子、细胞和机体结构与功能的随机改变，衰老增加死亡的可能性”。
下列说法正确的是( )A.衰老细胞的细胞膜通透性降低，物质运输能力也减弱B.细胞的死亡不利于机体更好地实现自我更新C.胚胎发育过程中，细胞会衰老，但不会凋亡D.细胞衰老后可通过细胞自噬将其清除，这与细胞内溶酶体有关5.鸡爪和鸭掌的最大不同在于，鸡爪的趾骨间没有蹼状结构，但在胚胎发育形成趾的时期，这两种动物的趾间都有蹼状结构。
鸡爪胚胎发育时期蹼的消失属于（）A. 细胞凋亡B. 细胞坏死C. 细胞癌变D. 细胞衰老6.在一个多细胞的生物体内，存在着各种在形态、结构和生理功能上具有差异的细胞，这是因为( )A. 细胞发生了变异B. 不同细胞的基因不同C. 某些细胞失去了全能性D. 不同细胞中的基因选择性地表达7.如图为人体某早期胚胎细胞所经历的生长发育阶段示意图，图中①～①为各个时期的细胞，a～c表示细胞所进行的生理过程。
两种常用氯氰菊酯对秀丽隐杆线虫生殖发育影响的信号转导通路
The reproductive signal pathways induced by two cypermethrins in Caenorhabdities elegansYU Xue-feng 1,2,GENG Wen-jing 1,2,GUO Xiao-ying 2*,ZHU Jiang 1*（1.School of Resources and Environment,Anhui Agricultural University,Hefei 230036,China;2.Institute of Agricultural Engineering,An⁃hui Academy of Agricultural Science,Hefei 230031,China ）Abstract ：In this study,Caenorhabdites elegans （C.elegans ）was selected as a model organism with which to explore the effects of alpha-cypermethrin （α-CPM ）and beta-cypermethrin （β-CPM ）on reproduction from the concentrations of 0.005to 3.2mg·L -1.The signal trans⁃duction pathways were also further investigated.The results showed that germ cell death and germline apoptosis in C.elegans was affected by α-CPM and β-CPM at 0.05mg·L -1,with dose effect.Further,the transduction of the reproductive injury signal was mainly dependenton the JNK MAPK signal transduction pathway and partially dependent on the p38MAPK signal transduction pathway.Lower concentra⁃tions of α-CPM and β-CPM also induced DNA damage in the gonad of C.elegans ,which mainly manifested as reduced brood size and hatching rate,with dose effect.These results indicate that exposure to α-CPM and β-CPM causes significant germ cell apoptosis in C.ele⁃gans .Also,the reproductive toxicity of β-CPM is higher than that of α-CPM.Keywords ：cypermethrin;Caenorhabditis elegans ;reproductive toxicity;signal transduction pathway余雪锋，耿文敬，郭肖颖，等.两种常用氯氰菊酯对秀丽隐杆线虫生殖发育影响的信号转导通路[J].农业环境科学学报,2019,38（9）：2066-2073.YU Xue-feng,GENG Wen-jing,GUO Xiao-ying,et al.The reproductive signal pathways induced by two cypermethrins in Caenorhabdities elegans [J].Jour⁃nal of Agro-Environment Science ,2019,38（9）:2066-2073.两种常用氯氰菊酯对秀丽隐杆线虫生殖发育影响的信号转导通路余雪锋1，2，耿文敬1，2，郭肖颖2*，朱江1*（1.安徽农业大学资源与环境学院，合肥230036；2.安徽省农业科学院农业工程研究所，合肥230031）收稿日期：2019-02-26录用日期：2019-04-10作者简介：余雪锋（1994—），女，安徽宿州人，硕士研究生，从事农业生态环境监测评价和植物营养学研究。
环境浓度下邻苯二甲酸二乙酯对秀丽隐杆线虫的生态毒理效应
作者简介: 严晨之(１９９６￣) ꎬ女ꎬ江苏无锡人ꎬ６２５５１９１３４＠ ｑｑ.ｃｏｍ.
∗责任作者ꎬ周磊(１９８９￣) ꎬ男ꎬ江苏如皋人ꎬ副研究员ꎬ博士ꎬ主要从事环境化学和生态毒理学研究ꎬｚｈｏｕｌｅｉ＠ ｅｃｕｓｔ.ｅｄｕ.ｃｎ
基金项目: 国家自然科学基金项目( Ｎｏ.２１８０６０３７)
Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ ( Ｎｏ.２１８０６０３７)
ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓꎬ ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ａｆｆｅｃｔ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｍｏｔｉｏｎ ｂｅｈａｖｉｏｒ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｃｅｒｔａｉｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ
ｏｒｇａｎｉｓｍｓ. Ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｅｃｏ￣ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ＤＥＰ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｓｃｅｎａｒｉｏｓ (２４ ｈꎬ ７２ ｈ ａｎｄ １０ ｄ)
２ １７ ６
环 境 科 学 研 究
第 ３３ 卷
( Ｐ<０ ０１) . Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎꎬ ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｎｄｐｏｉｎｔｓꎬ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｏｄｙ ｌｅｎｇｔｈꎬ ｂｏｄｙ ｗｉｄｔｈ ａｎｄ ｈｅａｄ ｔｈｒａｓｈｉｎｇ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙꎬ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ
到显著影响( Ｐ>０ ０５) . ②在不同浓度 ＤＥＰ 溶液中暴露 ７２ ｈ 后ꎬ秀丽隐杆线虫的发育水平受到干扰. 与对照组相比ꎬ在 ＤＥＰ 浓度
最高(２ ｍｇ∕Ｌ) 时ꎬ秀丽隐杆线虫体长下降了 ３ ２１％( Ｐ<０ ０５) ꎻ在 ＤＥＰ 浓度为０ ０００ ２ ｍｇ∕Ｌ 时ꎬ秀丽隐杆线虫的体宽呈上升趋势ꎬ
2020年天津市第五十七中学高三生物期中考试试题及答案解析
2020年天津市第五十七中学高三生物期中考试试题及答案解析一、选择题：本题共15小题，每小题2分，共30分。
每小题只有一个选项符合题目要求。
1.下列关于检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质的实验的叙述，正确的是（）A.切下的花生子叶薄片用体积分数为50%的酒精处理，更便于染色B.斐林试剂甲液与双缩脲试剂B液合理搭配使用可使梨提取液显紫色C.含糖量较高的生物材料，用斐林试剂检测后都会呈现明显的砖红色D.苏丹Ⅲ染液可将脂肪染成红色2.基因组稳定性是维持一切生命活动的基础，然而，多种外源和内源因素作用下产生的广泛DNA损伤和复制压力，构成了基因组不稳定的主要来源。
人体中有一种名为ATR激酶的蛋白质负责启动细胞对基因组不稳定的响应和修复，一旦感应到DNA损伤和复制压力会迅速活化，全局性地调控基因组的稳定。
下列叙述错误的是（）A.ATR激酶的合成场所是核糖体，合成时需要ATP提供能量B.在DNA复制过程中若ATR激酶丢失会增加分裂间期的基因组的不稳定性C.DNA复制时由于基因突变导致的DNA损伤，不一定引起生物性状的改变D.某些环境因素使基因中磷酸和核糖之间的化学键断裂会活化ATR激酶3.下列关于细胞学说内容的叙述，正确的是（）A.一切生物都是由细胞发育而来，并由细胞和细胞产物所构成B.施菜登、施旺提出“所有的细胞都来源于先前存在的细胞”C.细胞学说揭示了动植物的统一性，阐明了生物界的统一性D.细胞拥有自己的生命，是一个绝对独立的单位4.新冠病毒是一种RNA病毒，由它引起的新冠肺炎严重威胁全世界人民的生命安全。
下列关于该病毒的叙述，正确的是（）A. 新冠病毒没有细胞结构，在分类上属于原核生物B. 新冠病毒属于最基本的生命系统C. 新冠病毒唯一的细胞器是核糖体D. 新冠病毒只能在活细胞中增殖5.弃耕农田发生了一系列的演替，形成森林，关于该过程的叙述错误的是（）A.在演替过程中不断进化形成新物种，并取代原有的物种B.随着时间的推移，群落的垂直结构变得复杂C.群落演替使生物群落对光能的利用率提高D.与草本植物阶段相比，木本植物阶段的演替比较缓慢6.下列有关变异及进化的叙述，正确的是（）A. 生物因受环境的影响而产生的变异都是不能遗传的B. 乳酸菌内染色体复制时，可其进化提供选择材料C. 自然界中，某些染色体数目减半的生物具有可育性D. 生物体细胞发生的染色体变异属于不可遗传的变异7.以下实例,能证明微量元素是生命活动必需的是( )A.人体缺硒——克山病B.植物缺镁——白化苗C.动物缺钙——抽搐D.植物缺钾一易倒伏8.当环境温度达到40Ⅲ时，人体散热的有效途径是（）A. 传导B. 对流C. 辐射D. 出汗9.某50肽中有丙氨酸（R基为-）2个，现脱掉其中的丙氨酸（相应位置如图）得到几种不同有机物，其中脱下的氨基酸均以游离态正常存在。
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题目：秀丽线虫生殖细胞凋亡检测
一．实验目的:
1.掌握检测凋亡细胞的方法
2.学习使用荧光染料活体染色的方法和步骤
二．实验原理
1.秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）：是一种无毒无害、可
以独立生存的线虫。
其个体小，成体仅 1.5mm长，为雌雄同体（hermaphrodites），雄性个体仅占群体的0.2%，可自体受精或双性生殖；在20℃下平均生活史为3.5天，平均繁殖力为300-350个；但若与雄虫交配，可产生多达1400个以上的后代。
1976年，Sulston和Horvitz利用秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）研究发现，其约13%的体细胞在胚胎发育中注定死亡，使得人们认识到细胞凋亡的遗传基础。
2.荧光染料活体染色：本实验使用吖啶橙（Acridine orange）作为
染色剂，该染料对细胞具有慢性毒性，致癌性强，由于凋亡细胞因DNA片段化可结合更多染料，荧光显微镜下呈亮绿色，可在荧光显微镜下快速方便的检测出，适用于多数品系。
三．实验材料及设备
1.实验材料：
a)各品系秀丽隐杆线虫：N2（实验组）, ced-1::gfp（方法对照组），ced-
3（阴性对照）
b)OP50
c)M9培养基
d)NGM培养基
2.实验设备：
a)普通光学显微镜
b)载玻片若干，盖玻片若干，铂金丝
c)暗箱
d)吸水纸、滴管等
e)荧光显微镜
四．实验方法及步骤
1.线虫接种、同步化
2.取样：在12孔板培养板上，每孔吸取900μL预先接入少量OP50
的M9培养基，每孔用铂金丝挑取培养20~30条成体线虫
3.染色：向N2与ced-3品系中每孔加入250μg/mL吖啶橙100μL,
混匀后置于培养箱（避光）染色45~60min。
4.方法对照组观察：向ced-1::GFP品系中加入1滴盐酸左旋咪唑，
麻痹线虫后在荧光显微镜下观察。
5.恢复：将已染色的线虫吸出置于35mm培养基中，恢复45~60min，
使摄入的含染料的OP50排出。
麻痹线虫并置于荧光显微镜下观察。
6.观察：上述三个品系用相同方法观察：蓝光激发，在20倍物镜中，
凋亡细胞位于生殖腺臂弯转弯附近，呈亮黄色（染色时间长）或亮
橙色（染色时间短）（ced-1::GFP组凋亡细胞呈亮绿色），未凋亡细胞
核为均匀的暗绿色。
五．实验结果
（一）方法对照组：
图1方法对照组荧光显微镜观察结果
在方法对照组中可观察到GFP蛋白标记的凋亡细胞的阳性结果：在生殖腺臂弯转弯附近有亮绿色的空泡，
外沿颜色最深，内侧颜色浅，该品系无需染色，发出绿
色荧光的是标记ced-1蛋白的GFP蛋白，会聚集在凋亡
细胞细胞膜上。
（二）实验组：
图2实验组荧光显微镜观察结果
在实验组中能观察到吖啶橙标记的凋亡细胞的阳性结果：呈现亮橙色的细胞结构，在20倍物镜中，凋
亡细胞位于生殖腺臂弯转弯附近，呈亮黄色（染色时间
长）或亮橙色（染色时间短），未凋亡细胞核为均匀的
暗绿色。
（三）阴性对照组：
图3阴性对照组荧光显微镜观察结果
由于ced-3为凋亡基因缺陷品系，所以在阴性对照组中理论上不可能观察到凋亡细胞的阳性结果，但是在
结果中仍然可以看到呈现亮橙色的细胞结构，有两种可
能：1.受损死亡的细胞2.染色时间过长，吖啶橙杀死细
胞，产生假阳性结果。
六．实验讨论
1.实验结论：
本实验使用吖啶橙或GFP 蛋白标记凋亡细胞，使其在荧光显微镜下显示为亮绿色
2.讨论一：实验中有哪些注意事项？
1.吖啶橙有较强毒性，长时间使用吖啶橙染色会导致细胞死亡，
染色超过90min会增加假阳性。
2.吖啶橙有毒性，实验过程中严禁直接接触皮肤，取用吖啶橙需
要在实验室专门的区域，所有接触了吖啶橙的实验器械都要集
中处理。
3.在取用线虫时，动作要轻缓，防止伤害线虫，如果确实感觉难
度太大，可以向培养基中加入少量无菌水或培养基，然后用吸
管吸取含有线虫的液体以吸取线虫。
3.讨论二：如何设置阳性对照？
答：线虫研究的常用品系还包括ced-1与ced-5，这两个品系的特点是，因此，如果使用这两个品系作为阳性对照，可以很容易的在荧光显微镜下观察到凋亡细胞。
4.讨论三：ced-1::GFP组的作用是什么？
答：该组为方法对照，作用是证明本次实验所用的吖啶橙标记凋亡细胞的方法准确可靠，CED-1是跨膜蛋白，在lim-7启动子作用下，在鞘细胞表达，在凋亡过程中，CED-1::GFP蛋白簇聚于凋亡细胞周围，不需要染色，但用于其它品系需要进行遗传操作。
七．参考文献
[1]DOS REMEDIOS CG, CHHABRA D, KEKIC M, et al. Actin binding proteins: regulation of cytoskeletal microfilaments.[J]. 2(2):433-473
[2] 翟中和，王喜忠，丁明孝等.《细胞生物学》[M].高等理科教育，2004(1):123-128.
[3]刘雪兰,孙菲菲,李培英, 等.寄生虫基因功能研究的模式生物-秀丽隐杆线虫[J].中国兽医杂志,2011,(8):63-65. DOI:10.3969/j.issn.0529-6005.2011.08.025.。