秀丽线虫生殖细胞凋亡检测

题目：秀丽线虫生殖细胞凋亡检测

一．实验目的:

1.掌握检测凋亡细胞的方法

2.学习使用荧光染料活体染色的方法和步骤

二．实验原理

1.秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）：是一种无毒无害、可

以独立生存的线虫。其个体小，成体仅 1.5mm长，为雌雄同体（hermaphrodites），雄性个体仅占群体的0.2%，可自体受精或双性生殖；在20℃下平均生活史为3.5天，平均繁殖力为300-350个；但若与雄虫交配，可产生多达1400个以上的后代。1976年，Sulston和Horvitz利用秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）研究发现，其约13%的体细胞在胚胎发育中注定死亡，使得人们认识到细胞凋亡的遗传基础。

2.荧光染料活体染色：本实验使用吖啶橙（Acridine orange）作为

染色剂，该染料对细胞具有慢性毒性，致癌性强，由于凋亡细胞因DNA片段化可结合更多染料，荧光显微镜下呈亮绿色，可在荧光显微镜下快速方便的检测出，适用于多数品系。

三．实验材料及设备

1.实验材料：

a)各品系秀丽隐杆线虫：N2（实验组）, ced-1::gfp（方法对照组），ced-

3（阴性对照）

b)OP50

c)M9培养基

d)NGM培养基

2.实验设备：

a)普通光学显微镜

b)载玻片若干，盖玻片若干，铂金丝

c)暗箱

d)吸水纸、滴管等

e)荧光显微镜

四．实验方法及步骤

1.线虫接种、同步化

2.取样：在12孔板培养板上，每孔吸取900μL预先接入少量OP50

的M9培养基，每孔用铂金丝挑取培养20~30条成体线虫

3.染色：向N2与ced-3品系中每孔加入250μg/mL吖啶橙100μL,

混匀后置于培养箱（避光）染色45~60min。

4.方法对照组观察：向ced-1::GFP品系中加入1滴盐酸左旋咪唑，

麻痹线虫后在荧光显微镜下观察。

5.恢复：将已染色的线虫吸出置于35mm培养基中，恢复45~60min，

使摄入的含染料的OP50排出。麻痹线虫并置于荧光显微镜下观察。

6.观察：上述三个品系用相同方法观察：蓝光激发，在20倍物镜中，

凋亡细胞位于生殖腺臂弯转弯附近，呈亮黄色（染色时间长）或亮

橙色（染色时间短）（ced-1::GFP组凋亡细胞呈亮绿色），未凋亡细胞

核为均匀的暗绿色。

五．实验结果

（一）方法对照组：

图1方法对照组荧光显微镜观察结果

在方法对照组中可观察到GFP蛋白标记的凋亡细胞的阳性结果：在生殖腺臂弯转弯附近有亮绿色的空泡，

外沿颜色最深，内侧颜色浅，该品系无需染色，发出绿

色荧光的是标记ced-1蛋白的GFP蛋白，会聚集在凋亡

细胞细胞膜上。

（二）实验组：

图2实验组荧光显微镜观察结果

在实验组中能观察到吖啶橙标记的凋亡细胞的阳性结果：呈现亮橙色的细胞结构，在20倍物镜中，凋

亡细胞位于生殖腺臂弯转弯附近，呈亮黄色（染色时间

长）或亮橙色（染色时间短），未凋亡细胞核为均匀的

暗绿色。

（三）阴性对照组：

图3阴性对照组荧光显微镜观察结果

由于ced-3为凋亡基因缺陷品系，所以在阴性对照组中理论上不可能观察到凋亡细胞的阳性结果，但是在

结果中仍然可以看到呈现亮橙色的细胞结构，有两种可

能：1.受损死亡的细胞2.染色时间过长，吖啶橙杀死细

胞，产生假阳性结果。

六．实验讨论

1.实验结论：

本实验使用吖啶橙或GFP 蛋白标记凋亡细胞，使其在荧光显微镜下显示为亮绿色

2.讨论一：实验中有哪些注意事项？

1.吖啶橙有较强毒性，长时间使用吖啶橙染色会导致细胞死亡，

染色超过90min会增加假阳性。

2.吖啶橙有毒性，实验过程中严禁直接接触皮肤，取用吖啶橙需

要在实验室专门的区域，所有接触了吖啶橙的实验器械都要集

中处理。

3.在取用线虫时，动作要轻缓，防止伤害线虫，如果确实感觉难

度太大，可以向培养基中加入少量无菌水或培养基，然后用吸

管吸取含有线虫的液体以吸取线虫。

3.讨论二：如何设置阳性对照？

答：线虫研究的常用品系还包括ced-1与ced-5，这两个品系的特点是，因此，如果使用这两个品系作为阳性对照，可以很容易的在荧光显微镜下观察到凋亡细胞。

4.讨论三：ced-1::GFP组的作用是什么？

答：该组为方法对照，作用是证明本次实验所用的吖啶橙标记凋亡细胞的方法准确可靠，CED-1是跨膜蛋白，在lim-7启动子作用下，在鞘细胞表达，在凋亡过程中，CED-1::GFP蛋白簇聚于凋亡细胞周围，不需要染色，但用于其它品系需要进行遗传操作。七．参考文献

[1]DOS REMEDIOS CG, CHHABRA D, KEKIC M, et al. Actin binding proteins: regulation of cytoskeletal microfilaments.[J]. 2(2):433-473

[2] 翟中和，王喜忠，丁明孝等.《细胞生物学》[M].高等理科教育，2004(1):123-128.

[3]刘雪兰,孙菲菲,李培英, 等.寄生虫基因功能研究的模式生物-秀丽隐杆线虫[J].中国兽医杂志,2011,(8):63-65. DOI:10.3969/j.issn.0529-6005.2011.08.025.