细胞培养基本知识
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3. 贴壁生长细胞传代
? 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶
贴壁生长细胞传代方法
? 1. 吸光培养瓶中的培养液 ,用PBS溶液清洗2-3次。 ? 2. 加入1-2 ml 0.25％的胰蛋白酶液 (以消化液能覆盖
整个瓶底为准）静置 2-10 min（显微镜下动态监测 ）。 ? 3. 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。 ? 4. 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞， 形成细胞悬液。 ? 5. 吸取1/10—1/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内 。 ? 6. 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养 瓶内。 ? 7. 将后者放入培养箱中培养。
1. 超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、 液氮保存罐、离心机、水纯化装置、高压 蒸汽消毒装置、酶标仪
2. 过滤除菌装置、手术器械、培养器皿、移 液器
超净工作台
利用鼓风机驱动空气通 过高效空气微粒滤层净化 后，徐徐通过工作台面， 在操作区形成无菌环境。 按气流方向的不同分为： 1.外流式， 2.侧流式
? 贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束 ? 潜伏期：此时细胞有生长话动，而无细胞分裂
。
? 对数生长期 ：细胞数随时间变化成倍增长，活 力最佳，最适合进行实验研究。
? 停止期（平台期） ：细胞长满瓶壁后，细胞虽 有活力但不再分裂。其机制：接触抑制、密度 依赖性。
传代的方法
根据细胞生长的恃点，传代方法有 3种。
细胞培养基本知识
细胞室
1. 准备室：用于进行培养器皿的清晰、包 装、培养物质的准备和消毒以及供应物 品的保藏等.
2. 缓冲间：为了减少将外界污染源头带入 培养室
3. 培养室：是专门用于进行细胞培养和各 种无菌操作的实验室。其基本条件是： 清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适 宜的光线。
体外培养的设备和器具
1. 天然培养基：有血清、血浆、和组织提取液（
如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限，成分复杂，影响对某些实验产物
的提取和实验结果的分析，易发生支原体污染 。
2. 合成培养基：是根据细胞生存所需物质的种类
和数量，用人工方法模拟合成的。主要成分是 氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它 一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定，成本低 。
3. 浸酸：利用强氧化作用清除器皿表面可 能残留的有机物,时间在6小时以上最好 过夜。
4. 冲洗：反复注满水、倒空达20次以上。 最后用二次水浸洗2～3次，烘干后包装
清洁液的配制
胶塞和塑料用品的清洗
先在水中浸泡，然后用 2%NaOH溶液煮沸10分 钟，自来水冲洗晾干后，再用 1%稀盐酸浸泡 30分 钟，最后分别用自来水和三次水各冲洗 3次，烘 干备用。
CO 2培养箱
? CO2培养箱设定的条件为 37 ℃ ，5％CO2 。
? 使用CO2培养箱培养细胞时 应注意的问题：
① 使用螺旋口瓶培养细胞时 ，需将瓶盖微松，以保证 通气。
② 保持培养箱内空气干净。 定期消毒。
③ 箱内灭菌蒸馏水 3升，以 保持箱内湿度，避免培养 液蒸发 。
自动双重纯水蒸馏器
培养器皿
过滤除菌装置
1.不锈钢板式滤器：
2.微孔滤膜滤器：有可换膜式 滤器和一次性滤器两大类。
细胞培养的概念
原代培养：就是初次培养，即培养物一经接种到
培养皿中就不再分割，任其生长繁殖而不更换 生长器皿。它包括：细胞培养、组织培养、器 官培养。
传代培养：随着培养时间的延长、细胞分裂繁殖
，细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长 速度逐渐减慢甚至停止，在这种情况下，都需
要将培养物分割成小的培养 。
原代培养细胞的生命归宿
? 原代培养期 ? 传代培养期 ? 衰退期
体外细胞培养物的生长类型
? 贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。
见于各种实体瘤细胞。
? 悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴
附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。
每代贴附生长细胞的生长过程
? 游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态． 也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形 。
?平衡盐溶液：无 Ca2+、Mg2+的缓冲液
PBS：NaCl
8.00g
KCl
0.20g
Na2HPO4·H2O 1.56g
KH2PO4
0.20g
加水至1000 ml
PH值调至7.2-7.4
?消化液
1. 胰蛋白酶：主要用的是0.25％胰蛋白酶液，胰蛋
白酶是一种黄白色粉末，用无 Ca2+、Mg2+的PBS缓 冲液配制，过滤除菌。它作用于与赖氨酸或精氨 酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白， 影响细胞骨架，从而使细胞分离。浓度越高，作 用越强，但超过一定限度会损伤细胞。用含血清 培养液终止其消化作用。
培养细胞生长的条件
? 1. 细胞的营养需要 ? 2. 细胞的生存环境 ① 温度: 37 ℃ ② O2 ③ CO2: 5%
CO2 +H2O ← →H 2CO3 ← →H+ + HCO3④ pH: 7.2-7.4 ⑤ 渗透压 ? 3 无污染 ? 4 无毒
细胞培养用液
? 水：新鲜配置的三蒸水或去离子水
1. 悬浮生长细胞传代
? 离心法传代：离心（1000 r/min）去上清，沉淀物加新培养 液后再混匀传代。
? 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除 1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。
2. 半悬浮生长细胞传代（ Helaቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ胞）
? 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接 吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。
2. EDTA ：是一种化学螯合剂，对细胞有一定的解 离作用。毒性小、价格便宜、使用方便。
3.胶原酶溶液：又称羧肽酶，有胶原酶 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 、Ⅳ型及肝细胞专用胶原酶 5种，可根据制备不 同组织细胞悬液选择不同类型的胶原酶
培养基
培养基（培养液）是维持体外细胞 生存和生长的溶液，分天然培养基 和合成培养基。
1. 一次性培养瓶和培养 板：一般朔料培养器 皿的细胞生长面带负 电荷，有利于大多数 表面带正电荷的细胞 贴壁生长
2. 玻璃培养瓶、溶液瓶 、移液管
常用玻璃器皿清洗
1. 浸泡：在5%稀盐酸溶液中浸泡12h以上， 以达到软化器皿表面所附着物质，并中 和器皿表面的碱性物质。
2. 刷洗：用软毛毛刷将浸泡后的其面在洗 涤剂水中反复刷洗，以除去表面杂质。
? 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶
贴壁生长细胞传代方法
? 1. 吸光培养瓶中的培养液 ,用PBS溶液清洗2-3次。 ? 2. 加入1-2 ml 0.25％的胰蛋白酶液 (以消化液能覆盖
整个瓶底为准）静置 2-10 min（显微镜下动态监测 ）。 ? 3. 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。 ? 4. 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞， 形成细胞悬液。 ? 5. 吸取1/10—1/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内 。 ? 6. 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养 瓶内。 ? 7. 将后者放入培养箱中培养。
1. 超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、 液氮保存罐、离心机、水纯化装置、高压 蒸汽消毒装置、酶标仪
2. 过滤除菌装置、手术器械、培养器皿、移 液器
超净工作台
利用鼓风机驱动空气通 过高效空气微粒滤层净化 后，徐徐通过工作台面， 在操作区形成无菌环境。 按气流方向的不同分为： 1.外流式， 2.侧流式
? 贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束 ? 潜伏期：此时细胞有生长话动，而无细胞分裂
。
? 对数生长期 ：细胞数随时间变化成倍增长，活 力最佳，最适合进行实验研究。
? 停止期（平台期） ：细胞长满瓶壁后，细胞虽 有活力但不再分裂。其机制：接触抑制、密度 依赖性。
传代的方法
根据细胞生长的恃点，传代方法有 3种。
细胞培养基本知识
细胞室
1. 准备室：用于进行培养器皿的清晰、包 装、培养物质的准备和消毒以及供应物 品的保藏等.
2. 缓冲间：为了减少将外界污染源头带入 培养室
3. 培养室：是专门用于进行细胞培养和各 种无菌操作的实验室。其基本条件是： 清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适 宜的光线。
体外培养的设备和器具
1. 天然培养基：有血清、血浆、和组织提取液（
如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限，成分复杂，影响对某些实验产物
的提取和实验结果的分析，易发生支原体污染 。
2. 合成培养基：是根据细胞生存所需物质的种类
和数量，用人工方法模拟合成的。主要成分是 氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它 一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定，成本低 。
3. 浸酸：利用强氧化作用清除器皿表面可 能残留的有机物,时间在6小时以上最好 过夜。
4. 冲洗：反复注满水、倒空达20次以上。 最后用二次水浸洗2～3次，烘干后包装
清洁液的配制
胶塞和塑料用品的清洗
先在水中浸泡，然后用 2%NaOH溶液煮沸10分 钟，自来水冲洗晾干后，再用 1%稀盐酸浸泡 30分 钟，最后分别用自来水和三次水各冲洗 3次，烘 干备用。
CO 2培养箱
? CO2培养箱设定的条件为 37 ℃ ，5％CO2 。
? 使用CO2培养箱培养细胞时 应注意的问题：
① 使用螺旋口瓶培养细胞时 ，需将瓶盖微松，以保证 通气。
② 保持培养箱内空气干净。 定期消毒。
③ 箱内灭菌蒸馏水 3升，以 保持箱内湿度，避免培养 液蒸发 。
自动双重纯水蒸馏器
培养器皿
过滤除菌装置
1.不锈钢板式滤器：
2.微孔滤膜滤器：有可换膜式 滤器和一次性滤器两大类。
细胞培养的概念
原代培养：就是初次培养，即培养物一经接种到
培养皿中就不再分割，任其生长繁殖而不更换 生长器皿。它包括：细胞培养、组织培养、器 官培养。
传代培养：随着培养时间的延长、细胞分裂繁殖
，细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长 速度逐渐减慢甚至停止，在这种情况下，都需
要将培养物分割成小的培养 。
原代培养细胞的生命归宿
? 原代培养期 ? 传代培养期 ? 衰退期
体外细胞培养物的生长类型
? 贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。
见于各种实体瘤细胞。
? 悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴
附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。
每代贴附生长细胞的生长过程
? 游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态． 也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形 。
?平衡盐溶液：无 Ca2+、Mg2+的缓冲液
PBS：NaCl
8.00g
KCl
0.20g
Na2HPO4·H2O 1.56g
KH2PO4
0.20g
加水至1000 ml
PH值调至7.2-7.4
?消化液
1. 胰蛋白酶：主要用的是0.25％胰蛋白酶液，胰蛋
白酶是一种黄白色粉末，用无 Ca2+、Mg2+的PBS缓 冲液配制，过滤除菌。它作用于与赖氨酸或精氨 酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白， 影响细胞骨架，从而使细胞分离。浓度越高，作 用越强，但超过一定限度会损伤细胞。用含血清 培养液终止其消化作用。
培养细胞生长的条件
? 1. 细胞的营养需要 ? 2. 细胞的生存环境 ① 温度: 37 ℃ ② O2 ③ CO2: 5%
CO2 +H2O ← →H 2CO3 ← →H+ + HCO3④ pH: 7.2-7.4 ⑤ 渗透压 ? 3 无污染 ? 4 无毒
细胞培养用液
? 水：新鲜配置的三蒸水或去离子水
1. 悬浮生长细胞传代
? 离心法传代：离心（1000 r/min）去上清，沉淀物加新培养 液后再混匀传代。
? 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除 1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。
2. 半悬浮生长细胞传代（ Helaቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ胞）
? 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接 吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。
2. EDTA ：是一种化学螯合剂，对细胞有一定的解 离作用。毒性小、价格便宜、使用方便。
3.胶原酶溶液：又称羧肽酶，有胶原酶 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 、Ⅳ型及肝细胞专用胶原酶 5种，可根据制备不 同组织细胞悬液选择不同类型的胶原酶
培养基
培养基（培养液）是维持体外细胞 生存和生长的溶液，分天然培养基 和合成培养基。
1. 一次性培养瓶和培养 板：一般朔料培养器 皿的细胞生长面带负 电荷，有利于大多数 表面带正电荷的细胞 贴壁生长
2. 玻璃培养瓶、溶液瓶 、移液管
常用玻璃器皿清洗
1. 浸泡：在5%稀盐酸溶液中浸泡12h以上， 以达到软化器皿表面所附着物质，并中 和器皿表面的碱性物质。
2. 刷洗：用软毛毛刷将浸泡后的其面在洗 涤剂水中反复刷洗，以除去表面杂质。