水稻稻瘟病菌基因组中疏水蛋白的分布与聚类分析
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1.3 稻瘟病病原菌疏水蛋白基因的 PCR 检测
薄膜这一机制所产生的，膜厚约 10 nm，性质稳定(丁 靖志等, 2004)。目前，在许多丝状真菌中已发现疏水 蛋白的存在，其生物学功能是目前研究热点之一(林 福呈, 2001)。然而，在其它有机体中尚未发现有疏水 蛋白的存在。疏水蛋白对真菌类的生长和繁殖起着 非常重要的作用，所以疏水蛋白不仅在生物领域具 有很高的科研价值，在医药和其它工业中同样拥有 非常好的应用前景(胡振彦和高峰, 2008)。
www.molplantbreed.org/doi/10.3969/mpb.007.000978 基金项目: 本研究由农业部 948 项目(2006－G61)和国家 863 计划项目(2002AA245041)共同资助
分子植物育种 979 Molecular Plant Breeding
www.molplantbreed.org DOI: 10.3969/mpb.007.000978
Abstract Hydrophobins play an important role in the interaction of pathogenic bacteria and its host plants. In this research, We acquired 18 ORFs with potential hydrophobin function in the whole genome of Magnaporthe grisea which screened from 58 hydrophobin sequence from NCBI database by using BLAST tool, and 11 ORFs of which was chosed to design specific primers, then we detected the distribution of these primers in 17 rice blast fungus. At the same time, we also reconstructed the phylogenic tree of 58 hydrophobin sequences by using N-J of Clustal X and tested bootstrap of Mega3.0. The results showed that there were 11 primers were detected by PCR and 4 of which obtained specific bands which consistent with the anticipation, 6 of which had no specific band, 1 primer without any specific band. The results of phyletic evolution analyzed showed that average disparity index (DI) among hydrophobin was 0.62, and 58 hydrophobins were divied into two ClusterS: Ⅰand ClusterⅡ, which accord with classⅠand classⅡof fungal hydrophobins, respectively. All the hydrophobins from the fungi of Basidiomycotina, M. grisea and M. anisopliae belongs to Cluster Ⅰ, the other fungal hydrophobins belongs to Cluster Ⅱ. At last our research would lay a foundation for further clarifying the distribution of M. grisea and for validating the function of its related genes. Keywords Rice blast fungus (Magnaporthe grisea), Hydrophobin, Phyletic evolution, Special PCR, Cluster analysis
从互联网(http://www.uniprot.org/uniport/)下载获 得 25 个真菌的 58 份蛋白质信息(表 1)，随后在 BLAST Similarity Search (http://www.broad.mit.edu/cgi-bin/annotation/magnaporthe/blast_page . cgi ? organismName = Magnaporthe)数据库中进行比对，筛选具有疏水蛋白 功能的稻瘟病病原菌 ORF。
(Schizophyllum commune)子实体和气生菌丝形成时， 1 材料与方法
某些基因及其相应的 cDNA 序列可以编码约 100 个 氨基酸的小蛋白，它含有 8 个半胱氨酸残基和一段 分泌性的信号肽。他们把上述这一类物质统称为疏 水蛋白(hydrophobin)。疏水蛋白的分子一般较小，在 10 kD 左右，约含有 100 个氨基酸，氨基酸总体疏水 性中等，以在保守位置上含 8 个半胱氨酸残基和具 有独特而相似的水缘性图谱(氨基酸亲水－疏水性特 征图谱)为主要特征；刚合成的疏水蛋白都带有一段
1.1 供试菌株
供试菌株为本室验室保存的且具有不同致病力的 15 个稻瘟病菌野生型菌株：0575、NX3911、V86010、 02－29、M39、V86010、安 02－2、GX－28、95－4－ww1C、 P06－6、0309、97－230、02－1n－1－2、02－72－1－1 和展 3－ 2－1。野生型菌株 CY2 的 2 个致病突变体：CY2 －T1 和 CY2 －T2。
1.4 稻瘟菌 DNA 的提取
水稻表面的角质层和蜡质层能够在水稻体表形
培养基的配制：水解酪蛋白 0.5 g；酵母提取物
成了疏水性表面。稻瘟病菌可以感知疏水信号并将 0.5 g；蔗糖 15 g；酒石酸铵 5.0 g；硝酸铵 1.0 g；磷酸二
wenku.baidu.com
疏水信号传导至细胞内诱导附着胞的分化：稻瘟病 氢钾 1.0 g；硫酸镁 0.5 g；氯化钠 0.1 g；氯化钙 0.1 g；
从稻瘟病数据库下载具有疏水蛋白功能的 ORF 的全长。用 Primer 5.0 设计特异引物，通过 PCR 扩增 检测本实验室中部分菌株的疏水蛋白基因。
PCR 的反应程序：95℃ 3 min，94℃ 1 min，57℃~ 64℃ 30 s，72℃ 1 min，循环 30 次，72℃ 5 min。退火 温度因引物不同而有所变化。
疏 水 蛋 白 这 一 名 词 最 早 是 由 Rosenberg 和 瘟病菌不同菌株之间是否存在疏水蛋白以及之间的
Kjelleberg (1986)在研究细菌与寄主吸附机理时提出 关系，为进一步研究稻瘟病病原菌中的疏水蛋白基
的，意指覆盖在微生物细胞表面的任何疏水物质(hy- 因奠定了基础。
drophobic substances)。Wessels 等(1991)发现裂褶菌
菌在侵染水稻过程中分泌一种真菌疏水蛋白，该蛋 灭菌水 1 000 mL。分装到 100 mL 的锥形瓶中，每瓶
白由 MPG1 基因编码并参与菌丝和水稻叶表的互作 约为 40 mL，灭菌后待用。
(Talbot, 1999)。 稻 瘟 病 菌 芽 管 形 成 时 向 胞 外 分 泌
菌丝的培养：挑取平板或试管中的新鲜菌丝接种
分子植物育种，2009 年，第 7 卷，第 5 期，第 978－984 页 Molecular Plant Breeding, 2009, Vol.7, No.5, 978－984
研究报告 Research Report
水稻稻瘟病菌基因组中疏水蛋白的分布与聚类分析
吴毅歆 1,2 范成明 3 何月秋 1*
Distribution and Clustering Analysis of Hydrophobins in the Whole Genome of Rice Blast Fungus Magnaporthe Grisea
Wu Yixin 1,2 Fan Chengming 3 He Yueqiu 1*
序列保守的分泌信号肽。
1.2 筛选具有潜在疏水蛋白特性的 ORF
疏水蛋白在真菌生长发育过程中起着极为重要且 广泛的生物学作用，主要参与如气生菌丝、孢子和子 实体等疏水性气生结构的产生(W觟sten and de Vocht, 2000)，介导孢子对疏水基质的吸附(Wessels, 2000)，保 护子实体外表层并在内部形成疏水性微通道，保障 高湿度环境下正常的气体交换(Trembley et al., 2002) 等等。这些重要的生物学功能均是基于疏水蛋白遇 到亲水—— —疏水界面时就会自我组装成一层两亲性
1 Key Laboratory of Agricultural Biodiversity and Pests Control, Ministry of Education, Yunnan Agricultural University, Kunming, 650201; 2 Cash Crop Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kumning, 650205; 3 Institution of Crop science, Chinese academy of Agricultural Science, Beijing, 100081 * Corresponding author, heyueqiu@tom.com DOI: 10.3969/mpb.007.000978
MPG1p 蛋白单体，MPG1p 蛋白单体在体外可自动组 到配置好的液体培养基中，并在 28℃，150 r/min 的恒
装形成一层两性薄膜，其亲水面面对正在生长的芽 温摇床培养培养 3~4 d。
管，疏水表面向外侧与水稻表面相接触，增强亲和力
DNA 的提取：首先将培养好的菌丝通过滤纸过
1 云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室, 昆明, 650201; 2 云南省农业科学院经济作物研究所, 昆明, 650205; 3 中国农 业科学院作物科学研究所, 北京, 100081 * 通讯作者, heyueqiu@tom.com
摘 要 病原菌中的疏水蛋白在病原菌与寄主植物互作的过程中起着重要的作用。本研究利用 BLAST 工 具从 NCBI 数据库公布的 58 个疏水蛋白序列中筛选得到 18 条稻瘟病病原菌基因组中具有潜在疏水蛋白功 能的 ORF，选取其中的 11 条 ORF 设计特异引物，检测其在 17 个稻瘟病病原菌中的分布状况。同时，利用序 列比对工具 Clustal X 和 Mega3.0 软件的邻接法，对筛选的 58 条已知疏水蛋白序列构建疏水蛋白的系统进 化树。研究结果表明：经 PCR 检测，在 11 对引物中有 4 对引物高度专一且所得片断与预期大小基本一致，6 对引物扩增不特异，1 对引物扩增无特异条带。通过系统进化树分析得知，疏水蛋白间的平均分离度为 0.62， 筛选的 58 条疏水蛋白可分为两大类：Cluster Ⅰ和 Cluster Ⅱ，分别与真菌疏水蛋白Ⅰ型和Ⅱ型相对应；所有 的担子菌、稻瘟菌和绿僵菌中的疏水蛋白构成 ClusterⅠ，其它真菌的疏水蛋白构成 ClusterⅡ。本试验的研究 将为进一步明确稻瘟病病原菌中的疏水蛋白分布状况，以及相关基因的功能验证奠定基础。 关键词 稻瘟病菌, 疏水蛋白, 系统进化, 特异 PCR, 聚类分析
薄膜这一机制所产生的，膜厚约 10 nm，性质稳定(丁 靖志等, 2004)。目前，在许多丝状真菌中已发现疏水 蛋白的存在，其生物学功能是目前研究热点之一(林 福呈, 2001)。然而，在其它有机体中尚未发现有疏水 蛋白的存在。疏水蛋白对真菌类的生长和繁殖起着 非常重要的作用，所以疏水蛋白不仅在生物领域具 有很高的科研价值，在医药和其它工业中同样拥有 非常好的应用前景(胡振彦和高峰, 2008)。
www.molplantbreed.org/doi/10.3969/mpb.007.000978 基金项目: 本研究由农业部 948 项目(2006－G61)和国家 863 计划项目(2002AA245041)共同资助
分子植物育种 979 Molecular Plant Breeding
www.molplantbreed.org DOI: 10.3969/mpb.007.000978
Abstract Hydrophobins play an important role in the interaction of pathogenic bacteria and its host plants. In this research, We acquired 18 ORFs with potential hydrophobin function in the whole genome of Magnaporthe grisea which screened from 58 hydrophobin sequence from NCBI database by using BLAST tool, and 11 ORFs of which was chosed to design specific primers, then we detected the distribution of these primers in 17 rice blast fungus. At the same time, we also reconstructed the phylogenic tree of 58 hydrophobin sequences by using N-J of Clustal X and tested bootstrap of Mega3.0. The results showed that there were 11 primers were detected by PCR and 4 of which obtained specific bands which consistent with the anticipation, 6 of which had no specific band, 1 primer without any specific band. The results of phyletic evolution analyzed showed that average disparity index (DI) among hydrophobin was 0.62, and 58 hydrophobins were divied into two ClusterS: Ⅰand ClusterⅡ, which accord with classⅠand classⅡof fungal hydrophobins, respectively. All the hydrophobins from the fungi of Basidiomycotina, M. grisea and M. anisopliae belongs to Cluster Ⅰ, the other fungal hydrophobins belongs to Cluster Ⅱ. At last our research would lay a foundation for further clarifying the distribution of M. grisea and for validating the function of its related genes. Keywords Rice blast fungus (Magnaporthe grisea), Hydrophobin, Phyletic evolution, Special PCR, Cluster analysis
从互联网(http://www.uniprot.org/uniport/)下载获 得 25 个真菌的 58 份蛋白质信息(表 1)，随后在 BLAST Similarity Search (http://www.broad.mit.edu/cgi-bin/annotation/magnaporthe/blast_page . cgi ? organismName = Magnaporthe)数据库中进行比对，筛选具有疏水蛋白 功能的稻瘟病病原菌 ORF。
(Schizophyllum commune)子实体和气生菌丝形成时， 1 材料与方法
某些基因及其相应的 cDNA 序列可以编码约 100 个 氨基酸的小蛋白，它含有 8 个半胱氨酸残基和一段 分泌性的信号肽。他们把上述这一类物质统称为疏 水蛋白(hydrophobin)。疏水蛋白的分子一般较小，在 10 kD 左右，约含有 100 个氨基酸，氨基酸总体疏水 性中等，以在保守位置上含 8 个半胱氨酸残基和具 有独特而相似的水缘性图谱(氨基酸亲水－疏水性特 征图谱)为主要特征；刚合成的疏水蛋白都带有一段
1.1 供试菌株
供试菌株为本室验室保存的且具有不同致病力的 15 个稻瘟病菌野生型菌株：0575、NX3911、V86010、 02－29、M39、V86010、安 02－2、GX－28、95－4－ww1C、 P06－6、0309、97－230、02－1n－1－2、02－72－1－1 和展 3－ 2－1。野生型菌株 CY2 的 2 个致病突变体：CY2 －T1 和 CY2 －T2。
1.4 稻瘟菌 DNA 的提取
水稻表面的角质层和蜡质层能够在水稻体表形
培养基的配制：水解酪蛋白 0.5 g；酵母提取物
成了疏水性表面。稻瘟病菌可以感知疏水信号并将 0.5 g；蔗糖 15 g；酒石酸铵 5.0 g；硝酸铵 1.0 g；磷酸二
wenku.baidu.com
疏水信号传导至细胞内诱导附着胞的分化：稻瘟病 氢钾 1.0 g；硫酸镁 0.5 g；氯化钠 0.1 g；氯化钙 0.1 g；
从稻瘟病数据库下载具有疏水蛋白功能的 ORF 的全长。用 Primer 5.0 设计特异引物，通过 PCR 扩增 检测本实验室中部分菌株的疏水蛋白基因。
PCR 的反应程序：95℃ 3 min，94℃ 1 min，57℃~ 64℃ 30 s，72℃ 1 min，循环 30 次，72℃ 5 min。退火 温度因引物不同而有所变化。
疏 水 蛋 白 这 一 名 词 最 早 是 由 Rosenberg 和 瘟病菌不同菌株之间是否存在疏水蛋白以及之间的
Kjelleberg (1986)在研究细菌与寄主吸附机理时提出 关系，为进一步研究稻瘟病病原菌中的疏水蛋白基
的，意指覆盖在微生物细胞表面的任何疏水物质(hy- 因奠定了基础。
drophobic substances)。Wessels 等(1991)发现裂褶菌
菌在侵染水稻过程中分泌一种真菌疏水蛋白，该蛋 灭菌水 1 000 mL。分装到 100 mL 的锥形瓶中，每瓶
白由 MPG1 基因编码并参与菌丝和水稻叶表的互作 约为 40 mL，灭菌后待用。
(Talbot, 1999)。 稻 瘟 病 菌 芽 管 形 成 时 向 胞 外 分 泌
菌丝的培养：挑取平板或试管中的新鲜菌丝接种
分子植物育种，2009 年，第 7 卷，第 5 期，第 978－984 页 Molecular Plant Breeding, 2009, Vol.7, No.5, 978－984
研究报告 Research Report
水稻稻瘟病菌基因组中疏水蛋白的分布与聚类分析
吴毅歆 1,2 范成明 3 何月秋 1*
Distribution and Clustering Analysis of Hydrophobins in the Whole Genome of Rice Blast Fungus Magnaporthe Grisea
Wu Yixin 1,2 Fan Chengming 3 He Yueqiu 1*
序列保守的分泌信号肽。
1.2 筛选具有潜在疏水蛋白特性的 ORF
疏水蛋白在真菌生长发育过程中起着极为重要且 广泛的生物学作用，主要参与如气生菌丝、孢子和子 实体等疏水性气生结构的产生(W觟sten and de Vocht, 2000)，介导孢子对疏水基质的吸附(Wessels, 2000)，保 护子实体外表层并在内部形成疏水性微通道，保障 高湿度环境下正常的气体交换(Trembley et al., 2002) 等等。这些重要的生物学功能均是基于疏水蛋白遇 到亲水—— —疏水界面时就会自我组装成一层两亲性
1 Key Laboratory of Agricultural Biodiversity and Pests Control, Ministry of Education, Yunnan Agricultural University, Kunming, 650201; 2 Cash Crop Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kumning, 650205; 3 Institution of Crop science, Chinese academy of Agricultural Science, Beijing, 100081 * Corresponding author, heyueqiu@tom.com DOI: 10.3969/mpb.007.000978
MPG1p 蛋白单体，MPG1p 蛋白单体在体外可自动组 到配置好的液体培养基中，并在 28℃，150 r/min 的恒
装形成一层两性薄膜，其亲水面面对正在生长的芽 温摇床培养培养 3~4 d。
管，疏水表面向外侧与水稻表面相接触，增强亲和力
DNA 的提取：首先将培养好的菌丝通过滤纸过
1 云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室, 昆明, 650201; 2 云南省农业科学院经济作物研究所, 昆明, 650205; 3 中国农 业科学院作物科学研究所, 北京, 100081 * 通讯作者, heyueqiu@tom.com
摘 要 病原菌中的疏水蛋白在病原菌与寄主植物互作的过程中起着重要的作用。本研究利用 BLAST 工 具从 NCBI 数据库公布的 58 个疏水蛋白序列中筛选得到 18 条稻瘟病病原菌基因组中具有潜在疏水蛋白功 能的 ORF，选取其中的 11 条 ORF 设计特异引物，检测其在 17 个稻瘟病病原菌中的分布状况。同时，利用序 列比对工具 Clustal X 和 Mega3.0 软件的邻接法，对筛选的 58 条已知疏水蛋白序列构建疏水蛋白的系统进 化树。研究结果表明：经 PCR 检测，在 11 对引物中有 4 对引物高度专一且所得片断与预期大小基本一致，6 对引物扩增不特异，1 对引物扩增无特异条带。通过系统进化树分析得知，疏水蛋白间的平均分离度为 0.62， 筛选的 58 条疏水蛋白可分为两大类：Cluster Ⅰ和 Cluster Ⅱ，分别与真菌疏水蛋白Ⅰ型和Ⅱ型相对应；所有 的担子菌、稻瘟菌和绿僵菌中的疏水蛋白构成 ClusterⅠ，其它真菌的疏水蛋白构成 ClusterⅡ。本试验的研究 将为进一步明确稻瘟病病原菌中的疏水蛋白分布状况，以及相关基因的功能验证奠定基础。 关键词 稻瘟病菌, 疏水蛋白, 系统进化, 特异 PCR, 聚类分析