酸乳中乳酸菌的分离鉴定及其活力的测定

乳糖发酵反应是阳性, 而其他四种糖 （阿拉伯糖、麦芽糖、七叶苷、蔗糖、
棉子糖、纤维二糖、核糖发酵）都是阴
性反应的乳杆菌。
酸奶中乳酸菌的菌落数测定结果
用直接计数法，记录每个平板的菌落数，然后计算每个样液同一稀释度下的两个平板的平均菌落数。
观察计数发现稀释度在10-7时计数最适宜，菌落数在30-300之间。
酸奶样品测定在出厂间隔时间为3d时，蒙牛酸奶中的乳酸菌数分别为295、297；酸奶样品测定在出厂间隔 时间为6 d时，蒙牛酸奶中的乳酸菌数分别为273、271；酸奶样品测定在出厂间隔时间为9 d时，蒙牛酸奶中 的乳酸菌数分别为212、213。
所以酸奶菌落总数为： 样品的测定与出厂的间隔时间为3d： N=(N1+N2) X A/2=（295+297）X 107/2=296 X 107cfu/mL 样品的测定与出厂的间隔时间为6d： N=(N1+N2) X A/2=（273+271）X 107/2=272 X 107 cfu/mL 样品的测定与出厂的间隔时间为9d： N=(N1+N2)X A/2= （ 212+213 ） X 107/2= 213 X 107cfu/mL 实验分析：酸奶中所含的乳酸菌数，随着 出厂天数的延长会出现明显下降的趋势。
指导老师：李作美
班级：2012级食品质量与安全 学生：芦雯 学号：51206041015
目录
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概述 材料与方法 结果与分析 结论 致谢
1. 概述
背景
酸奶是日常生活中的一种传统的受欢迎的 发酵型的乳制品，它的营养价值含量相当 的丰富，并且对人体有很好的保健功效。
意义
蒙牛冠益乳中的乳酸菌主要为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。 对乳酸菌活力的测定，判定酸奶的最佳饮用时间，为酸奶的消 费提供科学的依据，同时也对微生物做出研究。
活力的测定是指该菌种产酸能力，把正
处在指数生长期的乳酸菌按3%的量接种
到60mL的新鲜牛奶中，然后每隔2h测定 一次牛奶的酸度变化，直至牛奶酸度变
化不再明显。
3. 结果与分析
酸奶中 乳酸菌 的菌落 数测定 结果
酸奶中 乳酸菌 的分离 培养
糖发酵 试验
生理生 化试验 结果
生长曲 线的绘 制
产酸能 力的测 定
糖发酵试验
保加利亚乳杆菌的生化鉴定结果 嗜热链球 菌的生化 保加利亚乳
杆菌的生化
鉴定结果
鉴定结果
嗜热链球菌的试验 分析：葡萄糖和蔗 糖糖发酵试管中的 培养基由原来的紫 色变化为黄色 , 麦 芽糖发酵培养基没 有改变颜色, 45℃ 的温度下可以生长 繁殖
保加利亚乳杆菌的 试验分析：乳糖发 酵试管中的培养基 由原来的紫色变成 了黄色 , 葡萄糖、 蔗糖、麦芽糖、七 叶苷均都没有改变 颜色
• 单位是：cfu/mL
• N1、N2-------平行平皿中乳酸菌落个数 • A--------稀释倍数
生长曲线的绘制
•
产酸能力的测定
挑选出乳酸菌生长繁殖适宜的三个培 • 养基平板，将培养分离出来的乳酸菌菌 株，用接种环挑取一定量的菌种，将它 接种在MRS培养基中，将之分别标号为1、 2、3，然后将之放入恒温培养箱中，进 行摇床培养。每隔2h测量一次乳酸菌的 OD值，直至OD值不再明显变化为止。 并通过实验所得到的OD值，绘制出乳酸 菌的生长曲线，最后观察每个生长期的 变化，找出指数期的时间段。
• •
3．倒平板 把经高温高压灭菌的MRS琼脂培养基冷却到45℃左右，按无菌操作法倒7只平板，倒平板时注意量的
把握，浅浅的一层，待凝固。
• • 4．分离方法 用一支1mL无菌移液管分别吸取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8的稀释菌悬液各1mL，分别
接种在与之相对应的7个无菌平板中，每个平皿放稍许；马上用无菌玻璃涂棒将样品菌液均匀地涂布在平 板，放置一段时间后，将之倒置，最后放入37℃恒温箱中培养48h。 • • • • 5．菌落观察 恒温培养48h过后，取出培养平板；观察培养基内菌落的形态，找出乳酸菌菌落。 6．镜检 选取一块干净的载玻片，在载玻片的中央滴加一滴生理盐水，在无菌操作法的环境下，用接种环挑取
有气泡产生,若出现微小气泡，也可视为产气阳性。我们有的时候还能观察到接种的乳酸菌
有没有动力,如果有动力,乳酸菌培养物就能飘散着生长在培养基中。 • 将麦芽糖、七叶苷、乳糖、蔗糖和葡萄糖五种糖的发酵培养基，分别加入试管中，高度约
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为整个试管的三分之二。分别用接种环挑取MRS琼脂培养基中的乳酸菌的疑似菌落接种在
这几个试管中，放入二氧化碳培养箱中培养2-3d（37℃）。 • 各种生化指标的鉴定，获得乳酸菌的生化特性。
酸奶中乳酸菌菌落数的测定
• （1）配置酸奶溶液
• 吸取1ml酸奶于一支标有10-1标号的无菌生理盐水中配成1：10的稀释液。
• （2）稀释
• 吸取lmL混合均匀的1：10的酸奶稀释液加入标有10-2标号试管内，同理作10倍递增稀释液。 • 吸取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8八个梯度的酸奶稀释液，依次放入相应的无菌平 皿中，每个平皿放浅浅的一层。 • (3) 倒平板． • 平皿中加入稀释液后，马上把冷至45℃左右的改良TJA培养基加入平皿中，用1mL无菌生理盐水作空白对 照，等待培养基凝固之后，把平板倒置，放入恒温培养箱中培养，温度在37℃左右，培养时间为48h。 • (4) 观察计数： • 观察乳酸菌菌落的形态特点，把菌落数在30-300之间的平板挑选出来，开始计数。则1mL检样中乳酸菌数 为：(N1+N2) X A/2 • 注：
生长曲线的绘制
酸奶中乳酸菌的OD值
根据酸奶中乳酸菌 的OD值，分别绘出 三个平板中的酸奶
中的乳酸菌的生长
曲线
结果分析：由上图乳 酸菌的生长曲线可得， 乳酸菌的生长指数期 在4-8h。
产酸能力的测定
由上述实验结果得出，应该选取生长 5h的乳酸菌接种入新鲜的牛奶 中，每隔2h测定牛奶的pH值，根据每次测定的pH值来绘制酸度曲线。
少量乳酸菌涂片；结晶紫初染→碘液媒染→乙醇脱色→番红复染，干燥后用油镜观察。
生化试验鉴定乳酸菌
• 糖发酵试验 • 试验方法：在无菌操作的环境下,用接种环挑取一定的量培养基上的乳酸菌,使之接种在发酵 液体的培养基的试管中。在完成接种任务后,将乳酸菌培养基试管放入培养箱中培养。每天 定时观察试验结果,观察培养基内颜色有没有发生变化，即有没有产酸。查看小倒管中有没
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C
D
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酸奶中乳酸菌的分离培养
经过对乳酸菌菌落的观察，发现在MRS 琼脂培养基的7个平 板上，10-7稀释度的菌落观察是最好的。经过MRS琼脂培养基分 离的菌株, 有较大的菌落、透明、呈灰白的颜色、两面是凸起来的。 镜检进一步观察，革兰氏染色阳性，油镜下观察，呈杆状的为保 加利亚乳杆菌，呈链状并且为一个一个小球形的为是热链球菌。
测定乳酸菌的 OD值和产生酸能力来评定酸乳中乳酸菌的活力，
2. 材料与方法
材料与设备
A B 设备：高压灭菌锅 CO2培养箱 电子天平 冰箱 鼓风干燥箱 超净工作台 光学显微镜
材料：蒙牛冠益乳
实验方法
酸奶中乳酸菌的 培养分离 生化试验鉴定 酸奶中乳酸菌
乳酸菌
菌落数的测定
生长曲线的绘制
产酸能力的测定
嗜热链球菌的生化鉴定结果
生理生化试验结果
链球菌的生化特性
乳杆菌的生化特
性
嗜热链球菌：能在 50℃条件 下生长 30 min, 不能在 pH9.2、 4.0% NaCl 条件下生长, 不可以水 解精氨酸, 不产生氨气, 而且麦芽糖、 蔗糖、棉子糖发酵都为阴性反应的 乳酸链球菌。
保加利亚乳杆菌不可以水解精氨酸,
酸奶中乳酸菌的培养分离
•1．培养基的配制 •
称取MRS琼脂培养基66.2g，加热溶解于1000ml蒸馏水中，加热煮沸后，装入锥形瓶中，121℃高灭菌15min备用。
•2．菌悬液的配制
•（1）拿1支洁净的锥形瓶，加入225mL的生理盐水；
•（2）取7只洁净的试管，各盛9mL的生理盐水；
•（3）塞上棉塞，用报纸包裹扎紧后，放入103kPa、121℃高压蒸汽灭菌20min； •（4）用玻璃棒将酸奶样品搅拌均匀，吸取酸奶25mL，加入放有225mL无菌生理盐水的锥形瓶中，充分振摇，让酸奶样 品均匀散布，这就是10-1的酸奶样品稀释液； •（5）将7支盛有9mL生理盐水的无菌试管，分别标记为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，利用无菌移液 管吸取10-1的酸奶样品稀释液 1mL，分别加入盛有 9mL无菌生理盐水的试管中，再次稀释，得到10-2稀释液，同理得到 10-3-10-8的样品稀释液。
结果分析：随着培 养时间加长，产酸
能力逐渐下降，活
力下降。
4. 结 论
A
B
C
致谢：
衷心地感谢生 物与食品工程 系的各位领导 和老师。