水貂肠炎病毒VP2基因的原核表达及鉴定

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1 0 离心 1 i ,取 上清进行 S S— A E 电泳。 电 200g 5 mn D PG 泳结束 后 ,借 鉴 康 彬 的 方法 ,先 用考 马斯 亮蓝 染 色 2 i,蒸 馏 水 > 干净 ,在 20 m 的 K L中 浸 泡 0mn 中洗 5 M C 1 i。小心切下 目的条 带所在凝 胶 ,切 碎后 加入少 量 0mn P S ( H7 0 B p . )缓冲液 ,4C浸泡过夜 。4 200g  ̄ ℃1 0 离心 1 i ,收集上 清 ,用氯 仿 :甲醇 =1 2的溶 液析 出蛋 5mn : 白,4c 200g c1 0 离心1 i,沉淀 用适 当 p . B 5mn H 70P S溶
实验通过克隆水貂肠炎病 毒 M V— Y E Z L一1 V 2基 因 株 P
的主要抗原 区,并在大肠杆 菌 中高效 表达 ,得 到重组蛋
白 ,经 We en—Bo i sr t l t g验 证 该 蛋 白 具 有 良 好 抗 原 性 , tn
可为今后抗 ME V单克 隆抗体 制备及 相 关免 疫 学检 测方
Pr ka y tc Ex e so n I e tfc to o i k En e ii r s VP2 Ge o r o i pr si n a d d n i a in fM n t rtsViu i ne
Q a u i Z a gY no g i Y bn h n a ln n
126 表达产物的可溶性分析 .. 将诱导表达的菌液 ,4 200g ℃1 0 离心 1 i 5m n收集菌 体沉淀 ,P S洗涤 3次 ,在 冰 浴上 超 声破 碎。 工作2S B ,
D A凝胶 回收试 剂 盒、各种 限制性 内切酶 、T N 4连 接酶 ,D A Ma e、蛋 白 M re、P D 8一T载 体 等均 N rr k a r M 1 k 购 自宝 生物 ( 连 )公 司 ;小 量质 粒提 取试 剂 盒购 白 大
参 照 G n ak 上 发 表 的 ME V 2 基 因 序 列 eB n V P
(J9 14 ,用 D A t 软件 分析 了该序 列的亲 水性疏 F5 27 ) N Sr a 水性和抗原标签 ,最终 设计 出 1对特 异性 引物 ,序列
如 : 上 游 引 物 : 5 一 3 : C G A T G A G G G G A TC G T G T . G A T A A C: 下 游 引 物 : 5 一 3 : C G T G G A AC C G C CC A
中和抗体。编码 V 2衣 壳蛋白的基因 中含有决定抗 原表 P
位 和宿主范围的核苷酸 序列 ,V 2几个碱基 和氨基 酸的 P
病毒株 ME Z L一1 V— Y ,表 达载体 P T一3 a E 2 ,表 达
菌株 B2 ( E ) L 1 D 3 ,兔 抗 M V I 均 为 本 实 验 室 保 存 , E g G
O E A M G 生物 公 司 。
1 1 3 引 物 . .
间歇 3s ,总工作 时间 2 i,功率 40W。4 20 0g 0mn 5 ℃1 0
离心 1 i,分别收集上清和沉淀 ( 5mn 用与上清等量的 p H 7 0P S溶解 )进行 S S— A E分析 。 . B D PG 127 表达产物的洗涤、溶解和纯化 .. 经上一步 得 知表 达 产 物 以 包 涵体 方 式 存在 。依 照
b ig id c d w t P G. h e u t o e c mp r t e e p r n sf re p e s n id c me ts o d ta e p oen e p e ・ en n u e i I T T e rs l ft o a a i x e me t o x rs i n u e n h we tt rt i x r s h s h v i o h h
改变就会影 响病 毒 的生物学 特征
,这 些特 性 决定 了
辣根过氧化物酶 ( R )标记 的猪抗兔 I H P g G二抗 ( 自 购
Dk a o公 司 )
v 2蛋 白在病毒感 染过 程 中起着极为 重要 的作 用 。本 P
通 讯 作 者 :张 彦 龙 ,E—ma :za gnn @ yho cm  ̄ i h nylg ao.o .2 l n
水貂肠炎病 毒 ( V)又名水貂细小病 毒 ,是 引起 ME
水 貂以剧 烈腹 泻为主要 临床特征 的急性 、烈性 、高致 死 性和高度 接触性传染 病 的病原 ,该 传染病称 水貂传染 性 肠 炎 ( ik i etu ne t ) 或 水 貂 细 小 病 毒 性 肠 M n n c oset is f i ri 炎 ,我国于 17 9 4年首次报道发生本病 ,此后该病逐渐
墅生
CisJ r Wli 21 3 3: 1—2 he uao i f 0 , 3(】 1 1 n eo l f d e 2 n l 8 1
水 貂 肠 炎 病 毒 V 2基 因 的 原 核 表 达 及 鉴 定 P
钱毓斌 张彦龙
( 东北林 业大学野生动物资源学院,哈尔滨 ,104 ) 50 0
I A A c A c T A C G T 。下 戈 线 分 别 为 E o I T A c A CC G T GC A J l cR I 和 X oI h 限制性 内切酶位 点。预计扩增片段长度 86b 。 4 p
12 方 法 wk.baidu.com.
沉淀 用 8 M 尿 素 重 悬 ,4 过 夜 以 溶 解 包 涵 体。4 ℃ ℃
白具有 ME V的抗原性 ,可为今后抗 ME V单克隆抗体制备及 相关免疫学检测方法的建立提供 良好 的抗原物 质。 关键词 :水貂肠炎病毒 ;V 2基 因:原核表达与鉴定 P
中图 分 类 号 :¥5 .2 8 89 文献 标 识 码 :A 文 章 编 号 :10 0 2 (0 2 3一l8— 4 0 0— 17 2 1 )0 1 0
p l eae c a eci ( C o m rs h i r t n P R) asy at n l ig te e i p o an o e V 2 g n . h r me tW l e t y n a o sa f ra a z pt e d m i f h P e e T ef g n a c n d i o e yn h o t a s o n
s n w s o eh g e t f c e c n t e c n i o . i a f h ih s i in yi h o dt n o 1 0 mM P G. a 7 fr6 h u s S o t e i f IT t ℃ o o r. DS—P 3 AGE a ay i s o e h t h n lss h w d t a e t
P T一 2 etr n as r e t E ce ci.oi L 1 ( E ) . eo bnt npo i a fc nl epesd ae E 3 avc dt nf m di o shrha cl B 2 D 3 oa r o n i R cm i i rt nW e i t xrse t ao e s i e y f r
摘要 :在分析水貂肠炎病毒 V 2基 因主要抗原位点分布 的基础上 ,设计 了 1对特异性 引物 ,克隆一 段长为 8 6b , P 4 p
编 码 主 要 抗 原 位 点 的 基 因片 段 。 将该 基 因 片段 定 向 插入 表 达 载 体 P T一 2 E 3 a中 ,转化 B 2 ( E ) 菌 株 ,IT L1 D 3 P G诱 导
实现高效表达。诱导表达比较实验结果表明 ,在 3  ̄ 7C,IT P G浓度为 10m . M,诱 导时 间为 6 h ,诱 导表达 达到最 大
效 率 。 重 组 蛋 白以 包 涵 体 形 式 存 在 ,大小 约为 5 D,应 用 兔 抗 水 貂 M V抗 体 , 经 Wetr bot g 证 该 重 组 蛋 0K E s n— l i 验 e tn
vlp n. eo me t
Ke r s:Mi k e trt i s y wo d n n e i v r ;VP e e;P o a y t x r si n a d i e t c t n i s u 2g n r k r oi e p e so n d n i a i c i f o
《 分子克隆实验 指 南第三版 》 中的 方法对包 涵体进 行 洗 涤。具体为将 超 声 波裂 解 的 沉淀 重 悬 于 9倍体 积 的含
0 5 Ti n 10j 1 m lLE T ( H 80 的裂 . % roX— 0 口 0m o D A p . ) t } /
解 缓 > 中 ,室 温 放 置 5m n ℃ 1 0 中液 i,4 20 0g离 心 5mn i,
法 的建 立 提 供 良好 的 抗 原 物 质 。
蔓延全国 ,给水 貂养殖 业造成 了巨大 的经济损失
。 1 材料 与方 法 1 1 材料 .
11 1 菌株 与血清 ..
成熟的病毒粒子中含有 3种多肽 ,V 1(7 5 、 P 7 . K)
V 2 (35 P 6 . K)和 V 3 (3 。其中 V 2蛋 白是构成 衣 P 6 K) P 壳蛋 白的主要成分 ,具 有免疫原性 ,能 够诱导机体 产生
第一作者 简介 :钱 毓斌 ,男,2 5岁 ,硕士研究生 ;主要从事动物疾病检验及分 子病毒学研究。E—m i:qb umal @16 tm al yh a no u 2 .o
3期
钱 毓 斌 等 :水 貂 肠 炎 病 毒 V 2基 因 的 原 核 表 达 及 鉴 定 P
19 1
112 主 要试 剂 ..
( ol ef C lg e o R sucs o h ̄t oer n e i ,H ri,104 ,C ia e r ,N a e r t U w m t o e F sy y ab n 50 0 hn )
Ab t a t sr c :W e a l e 4 p n ce t e fa me te c d n h i n ie i st fmi k e tr i v r sVP r ti y mp i d a 8 6 b u lo i rg n n o i g te man a t n c i o n n e t i 2 p oen b i f d g e i s u
p oen w s a o t 0 K a d w s e p e s d i h o n i cu in b d . h e u t sen—b ot g r v ae h h r ti a b u D a x r se n t e f r o a n l s o y T e rs l o we tr 5 n m f o f ltn ee d ta te i l t rc mb n t n p oe n r a td welw t n i e o ia i r ti e ce l i a t —MEV s r m. lr s l n iae h tt e rc mbn t n p oen c n b au be o h e u Al e ut id c td ta h e o i ai r ti a e v l a l s o i r vd n s f l ni e r r p r t n o n i — n p o ii g a u eu t nf e a ai f t — MEV mo o l n n io ya d r lt d i a g o p o a n co a a t d n ea e l b mmu o o i a ee t n me h d d ・ n l gc d tc i t o e・ l o
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