丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺和组氨酸发酵

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第十五章丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺和组氨酸发酵

第一节丙氨酸发酵

丙氨酸(Alanine,A1a),亦称α-氨基丙酸(α-aminopropionic acid),具有甜味,常用作调味料。霉菌、酵母、细菌、放线菌等微生物都能够由糖类和无机氮源、有机氮源发酵生产L-丙氨酸。这就是所谓的直接发酵法。后来又开发了酶法及固定化法等,原料则使用延胡索酸或L-天冬氨酸。

发酵法生产L-丙氨酸,主要是以降解葡萄糖等碳源生成的丙酮酸为底物,经过氨基转移反应或还原氨基化反应完成的。酶法是以L-天冬氨酸为底物,经过L-天冬氨酸-β-脱羧酶的反应,生成L-丙氨酸。

1.氨基转移反应

氨基转移反应,很早就已为人所知,该反应广泛分布在植物、动物、微生物的代谢过程之中。北井等的研究表明,丙氨酸产生菌胶状棒杆菌(Corynebacterium gelatinosum)No.7183,是通过丙酮酸与L-谷氨酸之间的转氨作用生成丙氨酸的。最初由氨基移转反应生成的丙氨酸是L-丙氨酸,但是经丙氨酸消旋酶的作用,转变成D-丙氨酸,因此该菌株生成的最终产物是DL-丙氨酸。

2.还原氨基化反应

Wiame和Goldmann分别报导了枯草杆菌、肺结核小杆菌(Myeobacterium tuberculosis)有还原氨基化反应。鲛岛等在假单胞菌No.483的无细胞抽出液中,检出了丙氨酸脱氢酶活性,该酶以NAD为辅酶,最适pH为9.8。但是还原氨基化反应的氢并不是由乳酸脱氢酶反应提供,而是由丙糖磷酸脱氢酶反应供给。该菌株生产的丙氨酸是L-丙氨酸。

3.天冬氨酸-β-脱羧酶反应

由于大多数采用直接发酵法生产的丙氨酸是DL-型,而L-天冬氨酸可通过酶法由反丁烯二酸廉价生产,因此,可采用天冬氨酸为原料,利用天冬氨酸-β-脱羧酶催化L-天冬氨酸-β-羧基的裂解来生产L-丙氨酸。Chibata等发现德阿昆哈假单孢菌(Pseudomonas dacunhae)具有很高的天冬氨酸-β-脱羧酶活性。L-丙氨酸可由L-天冬氨酸化学定量地酶法生产,100g L-天冬氨酸可生成66g L-丙氨酸,其摩尔转化率为99%。

Takamatsu等和Tosa等采用共同固定化大肠杆菌(天冬氨酸酶)和德德阿昆哈假单孢菌(天冬氨酸-β-脱羧酶),由反丁烯二酸直接酶法生产L-丙氨酸。

目前主要采用酶法来生产L-丙氨酸。

第二节脯氨酸发酵

L-脯氨酸(L-Proline,L-Pro)是非必需氨基酸,具有特殊甜味,用于制作医药品、配制氨基酸输液、抗高血压药物甲巯丙脯氨酸等。工业制造L-脯氨酸,最早是用动物胶水解提取的。1965年前后,吉永、大和谷、千畑、野口等相继报导了L-脯氨酸的发酵生产法。发酵法主要采用谷氨酸产生菌的突变株,近来已引入基因工程技术,用非谷氨酸产生菌由糖质原料发酵生产L-脯氨酸。

一、脯氨酸生物合成途径及调节机制

在微生物中,L-脯氨酸的生物合成是由谷氨酸经过四步反应而生成的,其合成途径如下:谷氨酸→γ-谷氨酰磷酸→L-谷氨酸-γ-半醛→Δ′-吡哆啉-5-羧酸→L-脯氨酸上述四步反应中有三步反应是由酶催化进行的。但其中Δ′-吡哆啉-5-羧酸的合成是自发进行的。

据对黄色短杆菌No.14-5(异亮氨酸缺陷)代谢的研究,该菌株主要按上述途径合成L-脯氨酸,几乎没有鸟氨酸合成的乙酰化途径,也就是说几乎没有鸟氨酸-酮酸转氨酶的反应。l967年,吉永等指出ATP及Mg2+能够促进黄色短杆菌No.14-5由L-谷氨酸生成L-脯氨酸,而且谷氨酸的磷酸化(活化)反应参与了脯氨酸的生物合成。还指出,No.14-5菌株的异亮氨酸缺陷突变的遗传变异部位是苏氨酸脱水酶的缺失,而且证明,恰恰是由于这种苏氨酸脱水酶的缺失才引起了脯氨酸的大量积累。因为菌体内苏氨酸脱水酶的缺失,而随着苏氨酸的积累,与赖氨酸一起协同反馈抑制了天冬氨酸激酶的活性,从而使ATP剩余。同时,由于苏氨酸的增多,也抑制了高丝氨酸激酶的活性,同样也使A TP剩余。上述两项A TP剩余,使以ATP为辅酶的谷氨酸激酶反应容易进行。而且作为谷氨酸激酶底物的谷氨酸,也因高浓度生物素存在,在菌体内异常地增加,也有利于该酶反应的进行,从而导致谷氨酸向脯氨酸转变。也就是说,产生菌是通过把难以透过的谷氨酸转换为容易透过的脯氨酸的方式,完成了菌体内大量谷氨酸的解毒,于是L-脯氨酸大量积累。

二、脯氨酸发酵

脯氨酸发酵所用菌株大体分为两类,即从谷氨酸产生菌诱导而来的和由非谷氨酸产生菌诱导来的,见表l5-1。从脯氨酸发酵产生菌的遗传特性来看,有异亮氨酸缺陷(Ile-)、组氨酸缺陷(His-)、鸟氨酸缺陷(Orn-)、丝氨酸缺陷(Ser-)、苯丙氨酸缺陷(Phe-)、酪氨酸缺陷(Tyr-)、核酸碱基缺陷等;还有磺胺胍抗性(SG r)、青霉素抗性(Pen r)、利福平抗性(Rif r)、DL-3,4-脱氢脯氨酸抗性(DHP r)等。非谷氨酸产生菌链式寇氏杆菌(Kurthia catenaforma) No.45(L-Ser-),是典型的来自非谷氨酸产生菌的脯氨酸产生菌,而且原始菌株也有相当高的脯氨酸产率。

表15-1 L-脯氨酸产生菌

注:Ile异亮氨酸,His组氨酸,Pro脯氨酸,Ser丝氨酸,Orn鸟氨酸,Glu谷氨酸,SG磺胺孤,Suc 琥珀酸,DHP DL-3,4-脱氢脯氨酸,AZC铃兰氨酸,TAC噻唑烷-4-羧酸,Km卡那霉素,-营养缺陷,g 生长,r抗性

用L-谷氨酸产生菌突变株发酵生产L-脯氨酸,培养基都是在L-谷氨酸发酵的基本培养基中,添加高浓度的(NH4)2SO4、充分生长所需要的生物素及所需氨基酸或营养物质(按限制生长的浓度)。

Nakamori等将黄色短杆菌2247的异亮氨酸缺陷菌株,用亚硝基胍(NTG)处理后,获得的变异株No.199,在以10%葡萄糖为碳源的培养基中,培养72h,可生成L-脯氨酸45g/L。此变异株的胞内A TP较亲株高1.6~2.0倍。

方佩静等在选育产L-脯氨酸的变异株中,由北京棒杆菌ASl.299诱变获得一株鸟氨酸缺陷变异株AS l.727。在适宜条件下,该突变株可产L-脯氨酸25~27g/L。

郭慧珍等以谷氨酸棒状杆菌No.94为出发菌株,经诱变后获得磺胺胍和DL-3,4-脱氢脯氨酸双重抗性变异株。该菌株产酸率随着生物素的增加而增加,当生物素浓度达300μg/L时,产酸最高。最佳发酵培养基为葡萄糖18%,氯化铵6%,生物素300μg/L。该菌在5000L发酵罐中连续发酵6罐,产L-脯氨酸30~33g/L,对糖转化率为20%,提取收得率为44.4%。

张伟国等以嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCCl3870为出发菌株,经硫酸二乙酯(DES)和NTG 逐级诱变处理,药物平板定向筛选,获得l株L-脯氨酸产生菌ZQ-3(SG r、Suc g、DHP r),在含16%葡萄糖的发酵培养基中,可产L-脯氨酸53~55g/L。

Sugiura等由粘质赛氏杆菌选育具有DHP和TAC双重抗性变异株SPl26,可产L-脯氨酸20g/L。继续以SPl26为出发菌株,用NTG(250μg/mL,30℃)处理15min,获得铃兰氨酸抗性变异株SPl87,在含15%蔗糖的培养基中产酸40g/L,当糖浓度增至20%时,产酸高达56g/L。

中西等以嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870为出发菌株,用NTG进行诱变处理,在含有2%谷氨酸钠的培养基上进行筛选,获得一株在添加L-谷氨酸后高产L-脯氨酸菌株TA-20。该菌株以葡萄糖为碳源时,在添加6%L-谷氨酸和2.5%硫酸铵的发酵培养基中,发酵42h,可积累L-脯氨酸108.3g/L,而副生的其他氨基酸只有0.7g/L。

在L-脯氨酸发酵产生菌育种工作中,引入基因工程操作,主要是使从脯氨酸前体物谷氨酸到脯氨酸合成的酶系,或者说是使参与谷氨酸供给的酶增强,从而提高脯氨酸产量。伊藤等对乳糖发酵短杆菌缺失磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的谷氨酸缺陷突变株,进行基因操作。即以谷氨酸缺陷型的回复作为指标,把参与TCA循环草酰乙酸供给的PEPC基因克隆,得到重组质粒pAJ200,又使pAJ200自然发生缺失,获得了稳定的重组质粒pAJ201,然后将其导入乳糖发酵短杆菌的脯氨酸产生菌。结果PEPC活性提高1.5倍,使脯氨酸产量提高71%。

第三节谷氨酰胺发酵

谷氨酰胺(L-Glutamine,L-Gln)是一种特殊的氨基酸,为快速繁殖细胞优先选择的呼吸燃料,如粘膜细胞和淋巴细胞;调节酸碱平衡;组织间的氮载体;核酸、核苷酸、氨基糖和蛋白质的重要前体。大量的证据表明,谷氨酰胺是一种条件性必需氨基酸。在应急情况下,机体对谷氨酰胺的需要超过其合成能力。因此,可以通过肠外营养或饲料中添加谷氨酰胺以营养凋控的方式加速动物体的康复。

谷氨酰胺也是一种极有发展前途的新药。作为药物,有增进脑神经机能的作用,可以用来治疗神经衰弱,改善脑出血后的记忆障碍,促进智力低下儿童的智力发育,防治癫痫病发作,治疗帕金森氏综合症。谷氨酰胺也是治疗胃溃疡、慢性胃炎的有效药物。

一、谷氨酰胺生物合成途径及调节机制

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