基因表达研究技术
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基因表达研究技术
SAGE RNA选择性剪切 原位杂交 基因定点突变 蛋白质及RNA相互作用技术 基因芯片及数据分析 利用酵母鉴定靶基因功能 其他分子生物学技术
基因表达系列分析技术—SAGE
(p193)
定义：一种以DNA序列测定为基础定量分析 全基因组表达模式的技术。能直接读出任何 一种细胞类型或组织的基因表达信息 原理：mRNA3‘末端部位存在可标识其特异 性的标签，长度在9-14个bp，检测标签可 获得该mRNA的表达信息。标签通过串联连 接于克隆载体上，便于测序，同时根据同一 标签重复次数，可计算其对应基因表达频率
用途：酵母细胞内研究真核DNA-蛋白质 间的相互作用 通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互 作用蛋白的编码基因。 分析鉴定细胞中转录调控因子与顺式作用 元件相互作用
酵母双杂交体系
(p207)
原理：不同转录激活因子的DB和AD形 成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的 功能 ，酵母双杂交系统利用杂交基因通 过激活报道基因的表达探测蛋白-蛋白的 相互作用 用途：分离与已知靶蛋白质相互作用基因 载体：含DB的载体和含AD的载体 报道株：经改造的含报道基因的重组质粒 的宿主细胞
荧光原位杂交
基因定点突变技术(p197)
原理：通过改变基因特定位点核苷酸 序列来改变所编码的氨基酸序列， 用途：
研究某个氨基酸残基对蛋白质结构、 催化活性以及结合配体能力的影响 改造DNA调控元件特征序列、 修饰表达载体、引入新的酶切位点
方法
寡核苷酸介导的DNA突变：含错配的寡核苷 酸与目的序列退火；聚合酶延伸及连接酶连 接；转化；分离RFDNA 重叠延伸介导的定点突变：诱变引物扩增出 两种靶片断→退火→末端补平→扩增 大引物诱变法：正反（突变）向突变引物扩 增→产生大突变引物→与野生型DNA和正向 引物混合→退火→PCR
双链cDNA合成 AE酶消化 A,B连接子分离
标签酶消化
流程
Klenow酶连接形成双标签片段
PCR扩增
锚定酶切割
连接
回 收 片 段 ， 测 序 ， 分 析
克隆至载体
应用
人类基因组研究 组织细胞的特异基因表达 构建染色体表达图谱 模式生物的研究 肿瘤分子机制
RNA选择性剪接技术(p195)
2 聚合酶链式反应（PCR）可以在体外快速扩 增特异基因，其特异性主要取决于（） A 反应体系中模板DNA的量 B 反应体系中DNA聚合酶的种类 C 引物序列的结构和长度 D 反应体系中四种dNTP的浓度
3 DNA重组技术用于体外切割DNA分子的酶是（） A 限制性内切酶 B 反转录酶 C DNA聚合酶 D DNA 连接酶
杂交
待分析基因在与芯片结合探针杂交之前必 需进行分离、扩增及用荧光标记，以提高 检测的灵敏度。 杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探 针进行的反应产生一系列信息的过程。选 择合适的反应条件能使生物分子间反应处 于最佳状况中，减少生物分子之间的错配 率。
信号检测和结果分析
杂交反应后芯片上各反应点的荧光位置、荧 光强弱可用计算机控制的高分辨荧光扫描仪 可获得。 根据扫描结果，通过计算机软件处理即可给 出目的基因的结构或表达信息。
4 可用于蛋白质组学研究的技术包括（） A 双向电泳技术 B 聚合酶链式反应 C 蛋白质印迹 D 蛋白质质谱分析 E RACE技术
5 可全部或部分抑制基因表达，以便研究基因 功能的技术包括（） A 基因定点突变 B 酵母双杂交 C 基因敲除 D RNA干涉（RNAi） E 基因表达系列分析（SAGE）
在EMSA中可用放射性同位素标记的DNA 片段与细胞提取物共温育，在非变性聚丙 烯酰胺凝胶中进行电泳。放射自显影技术 显现标记DNA条带位置。根据位置判断细 胞提取物中是否存在DNA结合蛋白。
百度文库 练习：
1 关于基因芯片技术下列叙述错误的是（）
A 基因芯片的工作原理是分子杂交 B 基因芯片可用于SNP研究 C 基因芯片可以改造变异基因 D 基因芯片可以同时检测大量靶基因的表达
RNA选择性剪接：用不同的剪接方式从一个 mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的 过程。 类型：平衡剪接，5’选择性剪接，3‘选择性 剪接，外显子遗漏性剪接，相互排斥性剪接。 方法：RT-PCR
原位杂交技术(p197)
概念：将标记的核酸探针与细胞或组织中 的核酸进行杂交，通过原位杂交确定杂交 体在样本中的原来位置 种类： 原位菌落（或噬菌斑）杂交（组织细 胞) Northern原位杂交（mRNA水平） Southern原位杂交（染色体水平）
转基因和同源的内 源基因的表达都被 抑 –共抑制
基因芯片(p214)
原理：将一系列的核酸片段固定在芯片载体 上作为固相靶片段，待测的核酸片段人工标 记上不同的荧光、或同位素等作为探针，一 定条件下两者杂交，根据杂交后不同的信号 即可获得靶片段的信息，进行计算机分析 过程：芯片制备、样品制备、杂交反应和信 号检测和结果分析
AD BD
杂合蛋白
激活转录功能
RNA干扰（RNAi）技术(p212)
RNA干扰：利用设计的双链小RNA高效、 特异性降解细胞内同源mRNA，从而阻 断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的 表型。 基因沉默：双链RNA经酶切后会形成很 多小片段，siRNA和miRNA 。siRNA 一旦与mRNA中的同源序列互补结合， 会导致mRNA失去功能，即不能翻译产 生蛋白质，也就是使基因“沉默”了。
基因敲除(p200)
基因敲除是通过DNA定点同源重组，改
变基因组中的某一特定基因，在生物活体
内研究该基因的功能
植物基因敲除
T-DNA插入失活进行植物基因敲除。利用根 癌农杆菌T-DNA介导转化，将一段带有报告 基因的序列标签整合到基因组DNA上，如果 它插入到目的基因内部或附近，就会影响其 表达，从而使该基因“失活”。 Ti质粒(tumor-in-ducing plasmid)转移 DNA (transfer DNA, T-DNA)：无专一整 合位点 利用PCR可以筛选出基因敲除株系。
原理与特点
原理：原位杂交以标记的外源基因为探针，在 适宜的条件下，探针与固定在玻片上的细胞内 变性染色体上互补序列形成稳定的杂交体，然 后根据探针标记的性质进行检测，放射性同位 素标记的探针用自显影检测。酶标记探针通过 显色反应检测。 特点：原位杂交能在成分复杂的组织中进行单 一细胞的研究，不需从组织或细胞中提取核酸， 对含量极低的靶序列灵敏度高。能准确反映组 织细胞的相互关系及功能状态。
6 用于研究蛋白质与RNA相互作用的是（） A 原位杂交 B 酵母双杂交 C 凝胶电泳阻滞分析 D 免疫杂交
酵母单杂交法
(p206)
原理：将已知的顺式作用元件构建到最基 本启动子(Pmin)上游，把报告基因连接 到Pmin下游。将待测转录因子的cDNA 与酵母转录激活结构域(AD)融合表达载 体导入细胞，该基因产物如果能够与顺式 作用元件结合，而激活Pmin启动子使报 告基因表达。
报告基因：是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基 因，是一个表达产物非常容易被鉴定的基因
基因芯片的应用
基因表达分析 基因型、基因突变和多态性分析 （SNP） 疾病的诊断与治疗 药物研究中的应用
凝胶阻滞试验 (p223)
原理：蛋白质与DNA结合后分子质量将 增加，在电泳中移动的速率减小，没有结 合蛋白的DNA片段迁移速率大。利用这 一原理可分离纯化细胞提取物中特定 DNA结合蛋白
SAGE RNA选择性剪切 原位杂交 基因定点突变 蛋白质及RNA相互作用技术 基因芯片及数据分析 利用酵母鉴定靶基因功能 其他分子生物学技术
基因表达系列分析技术—SAGE
(p193)
定义：一种以DNA序列测定为基础定量分析 全基因组表达模式的技术。能直接读出任何 一种细胞类型或组织的基因表达信息 原理：mRNA3‘末端部位存在可标识其特异 性的标签，长度在9-14个bp，检测标签可 获得该mRNA的表达信息。标签通过串联连 接于克隆载体上，便于测序，同时根据同一 标签重复次数，可计算其对应基因表达频率
用途：酵母细胞内研究真核DNA-蛋白质 间的相互作用 通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互 作用蛋白的编码基因。 分析鉴定细胞中转录调控因子与顺式作用 元件相互作用
酵母双杂交体系
(p207)
原理：不同转录激活因子的DB和AD形 成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的 功能 ，酵母双杂交系统利用杂交基因通 过激活报道基因的表达探测蛋白-蛋白的 相互作用 用途：分离与已知靶蛋白质相互作用基因 载体：含DB的载体和含AD的载体 报道株：经改造的含报道基因的重组质粒 的宿主细胞
荧光原位杂交
基因定点突变技术(p197)
原理：通过改变基因特定位点核苷酸 序列来改变所编码的氨基酸序列， 用途：
研究某个氨基酸残基对蛋白质结构、 催化活性以及结合配体能力的影响 改造DNA调控元件特征序列、 修饰表达载体、引入新的酶切位点
方法
寡核苷酸介导的DNA突变：含错配的寡核苷 酸与目的序列退火；聚合酶延伸及连接酶连 接；转化；分离RFDNA 重叠延伸介导的定点突变：诱变引物扩增出 两种靶片断→退火→末端补平→扩增 大引物诱变法：正反（突变）向突变引物扩 增→产生大突变引物→与野生型DNA和正向 引物混合→退火→PCR
双链cDNA合成 AE酶消化 A,B连接子分离
标签酶消化
流程
Klenow酶连接形成双标签片段
PCR扩增
锚定酶切割
连接
回 收 片 段 ， 测 序 ， 分 析
克隆至载体
应用
人类基因组研究 组织细胞的特异基因表达 构建染色体表达图谱 模式生物的研究 肿瘤分子机制
RNA选择性剪接技术(p195)
2 聚合酶链式反应（PCR）可以在体外快速扩 增特异基因，其特异性主要取决于（） A 反应体系中模板DNA的量 B 反应体系中DNA聚合酶的种类 C 引物序列的结构和长度 D 反应体系中四种dNTP的浓度
3 DNA重组技术用于体外切割DNA分子的酶是（） A 限制性内切酶 B 反转录酶 C DNA聚合酶 D DNA 连接酶
杂交
待分析基因在与芯片结合探针杂交之前必 需进行分离、扩增及用荧光标记，以提高 检测的灵敏度。 杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探 针进行的反应产生一系列信息的过程。选 择合适的反应条件能使生物分子间反应处 于最佳状况中，减少生物分子之间的错配 率。
信号检测和结果分析
杂交反应后芯片上各反应点的荧光位置、荧 光强弱可用计算机控制的高分辨荧光扫描仪 可获得。 根据扫描结果，通过计算机软件处理即可给 出目的基因的结构或表达信息。
4 可用于蛋白质组学研究的技术包括（） A 双向电泳技术 B 聚合酶链式反应 C 蛋白质印迹 D 蛋白质质谱分析 E RACE技术
5 可全部或部分抑制基因表达，以便研究基因 功能的技术包括（） A 基因定点突变 B 酵母双杂交 C 基因敲除 D RNA干涉（RNAi） E 基因表达系列分析（SAGE）
在EMSA中可用放射性同位素标记的DNA 片段与细胞提取物共温育，在非变性聚丙 烯酰胺凝胶中进行电泳。放射自显影技术 显现标记DNA条带位置。根据位置判断细 胞提取物中是否存在DNA结合蛋白。
百度文库 练习：
1 关于基因芯片技术下列叙述错误的是（）
A 基因芯片的工作原理是分子杂交 B 基因芯片可用于SNP研究 C 基因芯片可以改造变异基因 D 基因芯片可以同时检测大量靶基因的表达
RNA选择性剪接：用不同的剪接方式从一个 mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的 过程。 类型：平衡剪接，5’选择性剪接，3‘选择性 剪接，外显子遗漏性剪接，相互排斥性剪接。 方法：RT-PCR
原位杂交技术(p197)
概念：将标记的核酸探针与细胞或组织中 的核酸进行杂交，通过原位杂交确定杂交 体在样本中的原来位置 种类： 原位菌落（或噬菌斑）杂交（组织细 胞) Northern原位杂交（mRNA水平） Southern原位杂交（染色体水平）
转基因和同源的内 源基因的表达都被 抑 –共抑制
基因芯片(p214)
原理：将一系列的核酸片段固定在芯片载体 上作为固相靶片段，待测的核酸片段人工标 记上不同的荧光、或同位素等作为探针，一 定条件下两者杂交，根据杂交后不同的信号 即可获得靶片段的信息，进行计算机分析 过程：芯片制备、样品制备、杂交反应和信 号检测和结果分析
AD BD
杂合蛋白
激活转录功能
RNA干扰（RNAi）技术(p212)
RNA干扰：利用设计的双链小RNA高效、 特异性降解细胞内同源mRNA，从而阻 断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的 表型。 基因沉默：双链RNA经酶切后会形成很 多小片段，siRNA和miRNA 。siRNA 一旦与mRNA中的同源序列互补结合， 会导致mRNA失去功能，即不能翻译产 生蛋白质，也就是使基因“沉默”了。
基因敲除(p200)
基因敲除是通过DNA定点同源重组，改
变基因组中的某一特定基因，在生物活体
内研究该基因的功能
植物基因敲除
T-DNA插入失活进行植物基因敲除。利用根 癌农杆菌T-DNA介导转化，将一段带有报告 基因的序列标签整合到基因组DNA上，如果 它插入到目的基因内部或附近，就会影响其 表达，从而使该基因“失活”。 Ti质粒(tumor-in-ducing plasmid)转移 DNA (transfer DNA, T-DNA)：无专一整 合位点 利用PCR可以筛选出基因敲除株系。
原理与特点
原理：原位杂交以标记的外源基因为探针，在 适宜的条件下，探针与固定在玻片上的细胞内 变性染色体上互补序列形成稳定的杂交体，然 后根据探针标记的性质进行检测，放射性同位 素标记的探针用自显影检测。酶标记探针通过 显色反应检测。 特点：原位杂交能在成分复杂的组织中进行单 一细胞的研究，不需从组织或细胞中提取核酸， 对含量极低的靶序列灵敏度高。能准确反映组 织细胞的相互关系及功能状态。
6 用于研究蛋白质与RNA相互作用的是（） A 原位杂交 B 酵母双杂交 C 凝胶电泳阻滞分析 D 免疫杂交
酵母单杂交法
(p206)
原理：将已知的顺式作用元件构建到最基 本启动子(Pmin)上游，把报告基因连接 到Pmin下游。将待测转录因子的cDNA 与酵母转录激活结构域(AD)融合表达载 体导入细胞，该基因产物如果能够与顺式 作用元件结合，而激活Pmin启动子使报 告基因表达。
报告基因：是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基 因，是一个表达产物非常容易被鉴定的基因
基因芯片的应用
基因表达分析 基因型、基因突变和多态性分析 （SNP） 疾病的诊断与治疗 药物研究中的应用
凝胶阻滞试验 (p223)
原理：蛋白质与DNA结合后分子质量将 增加，在电泳中移动的速率减小，没有结 合蛋白的DNA片段迁移速率大。利用这 一原理可分离纯化细胞提取物中特定 DNA结合蛋白