基因表达分析技术
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3 cycle = 8 Amplicon
4 cycle = 16 Amplicon
5 cycle = 32 Amplicon
6 cycle = 64 Amplicon
7 cycle = 128 Amplicon
A
No. of Cycles
1
No. Amplicon Copies of Target
2
➢基本原理
是将标记的特异RNA探针（32P或生物素）与待测 的RNA样品液相杂交，标记的特异RNA探针与目 的RNA结合，形成双链RNA，免受RNA酶的消化； 而未结合的单链RNA经RNA酶A或RNA酶T1消化 形成寡核糖核酸。
A
9
RPA基本程序：
●待测RNA的分离 ●体外转录标记RNA探针 ●待测RNA与探针RNA进行液相杂交 ● RNA酶消化 ●不同大小杂交片段凝胶电泳分离
A
5
Nt
3638
28S
2604
3kb
18S
623
0.4 kb
RNA琼脂糖凝胶电泳 Northern blot hybridization
A
6
分子杂A 交实验
7
放 射 自 显 影 照 片
A
8目 录
2．核糖核酸酶保护实验
（ribonuclease protection assay，RPA）
➢ 是灵敏度和特异性很高的mRNA定量分析方法
2
4
3
8
4
16
5
32
6
64
20
1,048,576
30
1,073,741,824
28
常规PCR方法的局限性分析：
• 无法对起始模板准确定量,只能对终产物进 行分析
• 必须在扩增后用电泳方法分析,费时费力而 且EB有毒
• 无法对扩增反应实时检测
A
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2、实时荧光定量PCR （real-time PCR）
5
5
5
5
5
5
5
5
5 5
5 5
25～30 次循环后，模板DNA的含量
可以扩大100万倍以上。
A
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目录
PCR体系基本组成成分
模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+
A
20
PCR的基本反应步骤
变性
95˚C
延伸 72˚C
退火
Tm-5˚C
A
21
实验仪器
电泳仪
A
22
琼脂糖凝胶电泳槽
A
23
PCRA仪
24
PCR反应
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
A
25
实验结果
PCR结果。1、对照(无模板)；2－6、
PCR产物（5ul样品）
A
26
凝胶成像系统
A
27
Target Amplification
1 cycle = 2 Amplicon
2 cycle = 4 Amplicon
A
12
3．原位杂交（in situ hybridization，ISH）
➢ 可细胞或组织中原位表达的mRNA进行区域定位 ➢ 标记探针特异性地与目标靶 mRNA序列杂交，检测标记
信号来确定基因在组织和细胞内表达的区位信息。 ➢ 可作为定量分析的补充。
A
13
原位杂交技术主要步骤：
• 材料处理及细胞样品的固定； • 样品的制备和预处理； • 探针的制备和预杂交； • 探针及样品的变性； • 杂交温育； • 检测杂交信号，进行结果分析。
l
3’
BD
l BD
l BD
Taq
BD
BD
l l
5’
3’
Extension Continued Apply Excitation Wavelength
➢ 反转录实时定量PCR
A
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逆转录酶
mRNA
杂化双链
ＤＮＡ聚合酶 cDNA
PCR扩增
A
16
PCR技术原理
A
17
一、基本工作原理
Template DNA 5
5 5
Cycle 1
Primer 1 5 Primer 2
5 5
源自文库
5 5
Cycle 2
5 5
5
5
5
5
A
5 5
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目录
5 5
5 5
Cycle 3
A
11
RPA比Northern Blot的优势：
• 1.过量的探针与目的基因的杂交在液相环境完成，反应更 加完全
• 2.RPA比Northern Blot灵敏15－150倍，适合检测各种表 达水平之基因
• 3.RPA通量高，同时检测多个基因，可评价他们在同一情 况下的差异表达
• 4.一次RPA就能完成10 多次Northern Blot的工作，加快研 究速度
A
14
（二）RT-PCR常用的mRNA检测方法
1．反转录PCR
➢ 可用于mRNA的半定量分析
➢ 反转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR） 它以mRNA为模板，体外扩增cDNA，再以cDNA为模 板进行特定基因转录产物的PCR扩增。RT-PCR技术一 般用于RNA的定性分析；如果设置阳性参照，则可对 待测RNA样品进行半定量分析。
A
10
32P标记的探针：杂交双链进行变性PAGE， 用放射自显影或磷屏成像系统检测探针的信号；
生物素标记的探针：杂交双链经过变性PAGE后， 电转移至尼龙膜，用链霉亲和素－辣根过氧化物酶 和化学发光底物与膜上biotin标记的探针结合， X射线胶片或化学发光图像分析仪检测杂交信号。
核糖核酸酶保护实验原理示意图
A
30
非特异性的嵌入荧光染料
（Non-specific DNA binding dyes）
– SYBR® Green I – SYBR® Gold – Ethidium Bromide
A
31
DNA binding dyes
3’
5’
5’
3’
Extension
3’
BD
BD
Taq
5’
Taq
BD
BD
BD
A
3
（一）基于杂交原理检测mRNA的表达水平
1．Northern 印迹（Northern blot）
※是一种基于RNA-DNA杂交原理建立的一种RNA分析技术 ※指将RNA变性及电泳分离后，并转移到固相支持物上，用杂
交反应来鉴定其中特定mRNA分子的含量及其大小。
A
4
三 种 印 迹 技 术 的 比 较
基因表达分析技术
METHODS FOR ANALYZING GENE EXPRESSION
A
1
基因表达
基因
mRNA 蛋白质多肽链
A
2
一、通过检测mRNA 揭示基因转录水平的表达特征
根据分析方法的原理和功能特性，可将基因表达分析分为:
封闭性系统研究方法: 例如DNA微阵列、Northern印迹、实 时RT-PCR等方法。只能研究已知的基因。 开放性系统研究方法: 如差异显示PCR、双向基因表达指纹 图谱、分子索引法、随机引物PCR指纹分析等，可以发现 和分析未知的基因。 这里主要针对已知基因的常用表达分析方法做一介绍。
4 cycle = 16 Amplicon
5 cycle = 32 Amplicon
6 cycle = 64 Amplicon
7 cycle = 128 Amplicon
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No. of Cycles
1
No. Amplicon Copies of Target
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➢基本原理
是将标记的特异RNA探针（32P或生物素）与待测 的RNA样品液相杂交，标记的特异RNA探针与目 的RNA结合，形成双链RNA，免受RNA酶的消化； 而未结合的单链RNA经RNA酶A或RNA酶T1消化 形成寡核糖核酸。
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RPA基本程序：
●待测RNA的分离 ●体外转录标记RNA探针 ●待测RNA与探针RNA进行液相杂交 ● RNA酶消化 ●不同大小杂交片段凝胶电泳分离
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Nt
3638
28S
2604
3kb
18S
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0.4 kb
RNA琼脂糖凝胶电泳 Northern blot hybridization
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分子杂A 交实验
7
放 射 自 显 影 照 片
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8目 录
2．核糖核酸酶保护实验
（ribonuclease protection assay，RPA）
➢ 是灵敏度和特异性很高的mRNA定量分析方法
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64
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常规PCR方法的局限性分析：
• 无法对起始模板准确定量,只能对终产物进 行分析
• 必须在扩增后用电泳方法分析,费时费力而 且EB有毒
• 无法对扩增反应实时检测
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2、实时荧光定量PCR （real-time PCR）
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25～30 次循环后，模板DNA的含量
可以扩大100万倍以上。
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目录
PCR体系基本组成成分
模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+
A
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PCR的基本反应步骤
变性
95˚C
延伸 72˚C
退火
Tm-5˚C
A
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实验仪器
电泳仪
A
22
琼脂糖凝胶电泳槽
A
23
PCRA仪
24
PCR反应
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
A
25
实验结果
PCR结果。1、对照(无模板)；2－6、
PCR产物（5ul样品）
A
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凝胶成像系统
A
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Target Amplification
1 cycle = 2 Amplicon
2 cycle = 4 Amplicon
A
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3．原位杂交（in situ hybridization，ISH）
➢ 可细胞或组织中原位表达的mRNA进行区域定位 ➢ 标记探针特异性地与目标靶 mRNA序列杂交，检测标记
信号来确定基因在组织和细胞内表达的区位信息。 ➢ 可作为定量分析的补充。
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原位杂交技术主要步骤：
• 材料处理及细胞样品的固定； • 样品的制备和预处理； • 探针的制备和预杂交； • 探针及样品的变性； • 杂交温育； • 检测杂交信号，进行结果分析。
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Extension Continued Apply Excitation Wavelength
➢ 反转录实时定量PCR
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逆转录酶
mRNA
杂化双链
ＤＮＡ聚合酶 cDNA
PCR扩增
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PCR技术原理
A
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一、基本工作原理
Template DNA 5
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Cycle 1
Primer 1 5 Primer 2
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源自文库
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Cycle 2
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目录
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Cycle 3
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RPA比Northern Blot的优势：
• 1.过量的探针与目的基因的杂交在液相环境完成，反应更 加完全
• 2.RPA比Northern Blot灵敏15－150倍，适合检测各种表 达水平之基因
• 3.RPA通量高，同时检测多个基因，可评价他们在同一情 况下的差异表达
• 4.一次RPA就能完成10 多次Northern Blot的工作，加快研 究速度
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（二）RT-PCR常用的mRNA检测方法
1．反转录PCR
➢ 可用于mRNA的半定量分析
➢ 反转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR） 它以mRNA为模板，体外扩增cDNA，再以cDNA为模 板进行特定基因转录产物的PCR扩增。RT-PCR技术一 般用于RNA的定性分析；如果设置阳性参照，则可对 待测RNA样品进行半定量分析。
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32P标记的探针：杂交双链进行变性PAGE， 用放射自显影或磷屏成像系统检测探针的信号；
生物素标记的探针：杂交双链经过变性PAGE后， 电转移至尼龙膜，用链霉亲和素－辣根过氧化物酶 和化学发光底物与膜上biotin标记的探针结合， X射线胶片或化学发光图像分析仪检测杂交信号。
核糖核酸酶保护实验原理示意图
A
30
非特异性的嵌入荧光染料
（Non-specific DNA binding dyes）
– SYBR® Green I – SYBR® Gold – Ethidium Bromide
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DNA binding dyes
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Extension
3’
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Taq
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Taq
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（一）基于杂交原理检测mRNA的表达水平
1．Northern 印迹（Northern blot）
※是一种基于RNA-DNA杂交原理建立的一种RNA分析技术 ※指将RNA变性及电泳分离后，并转移到固相支持物上，用杂
交反应来鉴定其中特定mRNA分子的含量及其大小。
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三 种 印 迹 技 术 的 比 较
基因表达分析技术
METHODS FOR ANALYZING GENE EXPRESSION
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基因表达
基因
mRNA 蛋白质多肽链
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一、通过检测mRNA 揭示基因转录水平的表达特征
根据分析方法的原理和功能特性，可将基因表达分析分为:
封闭性系统研究方法: 例如DNA微阵列、Northern印迹、实 时RT-PCR等方法。只能研究已知的基因。 开放性系统研究方法: 如差异显示PCR、双向基因表达指纹 图谱、分子索引法、随机引物PCR指纹分析等，可以发现 和分析未知的基因。 这里主要针对已知基因的常用表达分析方法做一介绍。