原位杂交技术原理及其应用

（二）玻片和组织切片的处理 • 1．玻片的处理玻片包括盖片和载片 • 应用热肥皂刷洗，自来水清洗干净后，置 于清洁液中浸泡24h，清水洗净烘干，95%酒精 中浸泡24h后蒸馏水冲洗、烘干，烘箱温度最 好在150℃或以上过夜以去除任何RNA酶。盖玻 片在有条件时最好用硅化处理，锡箔纸包裹无 尘存放。 • 由于ISHH的实验周期长，实验程序繁杂， 因此，要应用粘附剂预先涂抹在玻片上，干燥 后待切片时应用，以保证在整个实验过程中切 片不致脱落。
• DNA合成仪的诞生使制造寡核苷酸探针成 为可能，与上述探针不同的是寡核苷酸探 针不是克隆性DNA探针，它是由DNA合成仪 依照所需杂交的靶核苷酸序列合成的。具 有制造方便，价格低廉的优点，也可进行 放射性与非放射性标记，但其特异性不如 克隆性探针强，亦不如其杂交信号高。
原位杂交组织化学技术 的基本步骤
• 近年来，地高辛（Digoxigonin）标记技术 引起科技工作者的极大兴趣。Boeringer Mannhem Bio－chemisca于1987年将地高辛 标记的有关试剂及药盒投放市场。 • 和其它非放射性标记物一样，地高辛较放 射性标记系统安全，方便、省时间。同时 在敏感性和质量控制方面比生物素标记技 术要优越，可以检测出人基因组DNA中的单 拷贝基因。地高辛标记法显示的颜色为紫 蓝色（标记碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色 系统），有较好的反差背景。
用原位杂交术，可在原位研究细胞合成
某种多肽或蛋白质的基因表达。 此方法有很高的敏感性和特异性，可进 一步从分子水来探讨细胞的功能表达及 其调节机制。已成为当今细胞生物学、 分子生物学研究的重要手段。
In situ hybridization
Aromase gene The rat brain section
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• 常用的粘附剂有铬矾-明胶液，其优点是 价廉易得，但在长周期实验过程中，粘附 效果不够理想。 • 多聚赖氨酸液具有较好的粘附效果，但价 格昂贵，需进口。 • 近年Vector Lab (U.S.A.)推出一种新的 粘附剂叫Vectorband Reagent,每一单位 包装可制备500～700张载玻片，粘附效果 极佳，价格较多聚赖氨酸便宜，制片后可 长期保存应用。
固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在
固体的支持物上（常用的有硝酸纤维素滤膜， 其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等），另 一条参加反应的核酸链游离在溶液中。固相 杂交包括：
菌落原位杂交（colony in situ hybridization）、 斑点杂交（Dot blot）、 Southern印迹杂交（Southern blot） Northern印迹杂交（Northern blot） 组织原位杂交（Tissue in situ hybridization），
• Pezzella（1987）创建了用磺基化DNA探针来做细 胞或组织原位杂交的方法，其基本原理是使DNA探 针的胞嘧啶碱基磺基化，利用单克隆抗体识别磺 基化探针，再通过免疫组化方法显示结合的单克 隆抗体，从而对杂交结合的探针进行定位。 • 本法的优点是磺基化DAN探针标记简便，不需作缺 口平移标记，敏感度也较高。 • 生物素标记探针技术是Brigat（1983）首先建立 的，它利用生物素标记的探针在组织切片上检测 了病毒DNA，通过生物素与抗生物素结合，过氧化 物酶-抗过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞 中的定位。 • 生物素标记探针技术目前已被广泛应用，特别是 在病毒学和病理学的临床诊断中。
• 由于同位素标记探针具有放射性既污染环境， 又对人体有害，且受半衰期限制等缺点，科学 工作者们开始探索用非放射性的标记物标记核 酸探针进行原位杂交。 • Bauman（1981）等首先应用荧光素标记cRNA探 针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成 功。 • Shroyer（1982）报道用2，4二硝基苯甲醛 （DNP）标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原 性，然后用兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探 针，最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交 探针。 • 这两种方法至今仍有采用，但因敏感度不够高， 应用不够普遍。
即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学 技术
原位杂交技术的基本原理
利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过
碱基对之间非共价键的形成，出现稳定的双链区， 形成杂交的双链。 1.两条核苷酸单链片段，在适宜的条件下，通过氢键 结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或 RNA-RNA 双键分 子 2.应用带有标记的（有放射性同位素，如3H、35S、 32P，荧光素、生物素、地高辛等非放射性物 质)DNA或 RNA片段作为核酸探针,与组织切片或细 胞内待测核酸(RNA或DNA）片段进行杂交 3.用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观 察目的 mRNA或DNA 的存在与定位
• 大致可分为： ①杂交前准备，包括固定、取材、玻片和 组织的处理，如何增强核酸探针的穿透 性、减低背景染色等； ②杂交； ③杂交后处理； ④显示（visualization）：包括放射性自 显影和非放射性标记的显色。
（一）固定 兼顾三个方面： • 保持细胞结构， • 最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平； • 使探针易于进入细胞或组织。 • DNA是比较稳定的，mRNA却绝然不同，非常容易 被降解。因此，对于DNA的定位来说，固定剂的 种类和浓度并不十分重要。相反，在RNA的定位 上，如果要使RNA的降解减少到最低限度，那么， 不仅固定剂的种类浓度和固定的时间十分重要， 而且取材后应尽快予以冷冻或固定。在解释ISHH 的结果时应考虑到取材至进入固定剂或冰冻这段 时间对RNA保存所带来的影响，因组织中mRNA的 降解是很快的。
• 在固定剂中，最常用的是多聚甲醛。 • 对于mRNA的定位，我们常采用的方法是将组织固定于4% 多聚甲醛磷酸缓冲液中1～2h，在冷冻前浸入15%蔗糖溶 液中，置4℃冰箱过夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷 箱切片机或振荡切片机切片。 • 组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸 入4%多聚甲醛约10min，空气干燥后保存在-70℃。如冰 箱温度恒定，在-70℃可保存数月之久不会影响杂交结果。 • 在病理学活检取材多用福尔马林固定和石蜡包埋，这种 标本对检测DNA和mRNA有时也可获得杂交信号，但石蜡包 埋切片由于与蛋白质交叉连接的增加，影响核酸探针的 穿透，因而杂交信号常低于冰冻切片。同时，在包埋的 过程中可减低mRNA的含量。
• 蛋白酶K（Proteinase K）:1μg/ml(于0.1mol/l Tris/50mmol/L EDTA, pH8.0缓冲液中),37℃孵育 15～20min，以达到充分的蛋白消化作用而不致影 响组织的形态为目的。 • 蛋白酶K还具有消化包围着靶DNA的蛋白质的作用， 从而提高杂交信号。 • 在蛋白酶K消化后，应用0.1mol/L的甘氨酸溶液 （在PBS中）清洗以终止蛋白酶K的消化作用，甘 氨酸是蛋白酶K的抑制剂。为保持组织结构，通常 用4%多聚甲醛再固定。 • Burns等（1987）报告应用胃蛋白酶（Pepsin） 20～100μg/ml（用0.1n HCl 配）37℃、30min进 行消化，所获实验结果优于蛋白酶K。
• 早期应用的主要是DNA探针 • Temin在70年代研究致癌RNA病毒时制备了 cDNA探针（complementary DNA），其基 本原理是以RNA为模板，经逆转录酶 （reverse transcriptase）又称为RNA指 导的DNA聚合酶催化产生的。该酶以RNA为 模板，按照RNA的核苷酸顺序合成DNA，这 一途径与一般遗传信息流的方向相反，故 称逆转录。cDNA是指互补于mRNA的DNA分 子。
• 上述生物素标记技术又叫酶促生物素标记技术。 另一种叫光促生物素标记核酸技术（1985） ， 该技术是用光敏生物素（Photobiotin）标记核 酸。目前应用的光敏生物素有乙酸盐和补骨脂素 生物素，它们都是由三个部分组成：光敏基团、 连结臂和生物素。在强光下，不需酶反应，光敏 生物素的光敏基团即可与核酸中的碱基相结合。 • 光敏生物素标记核酸，方法简单，灵敏度也不低， 但标记效率不高，每100～150个碱基才能标记一 个生物素，对于短的基因探针特别是寡核苷酸探 针不宜使用，以免因标记数过少而影响灵敏度。
核酸探针的分类
• 核酸探针根据标记方法的不同可粗略分 为放射性探针和非放射性探针两类。 • 根据探针的核酸性质不同可分为DNA探针、 RNA探针、cDNA探针、cRNA探针和寡核苷 酸探针等。 • DNA探针还有单链DNA（Single stranded, ssDNA）和双链DNA（Double stranded, dsDNA）之分。
• RNA探针是将特异性的cDNA片段插入含有RNA聚合 酶启动子的转录性载体。 • 这类载体包括pSP64和pSP65，它们具有不同的启 动子在多克隆位点的各侧。Psp64和pSP65在sP6 启动子的多克隆位点的方向是不同的。通过改变 外源基因的插入方向或选用不同的RNA聚合酶， 可以控制RNA的转录方向，即以哪条DNA链为模反 转录RNA。从而可以得到与mRNA同序列的同义RNA 探针（Sense probe）和与mRNA互补的反义RNA探 针（antisense probe），又称互补RNA探针 （complementary RNA probe , cRNA）。 • 通常用同义RNA探针做为反义RNA探针的阴性对照。 • 由于RNA探针是单链分子，所以它与靶序列的杂 交反应极高。有报告认为其杂交率高于DNA探针 的8倍。
原位杂交技术 in situ hybridization
核酸分子杂交技术
在研究DNA分子复制原理的基础上发展起
来的一种技术。两条核苷酸单链片段，通 过氢键结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或 RNA-RNA双链分子 按其作用方式可大致分为两种：固相杂交 和液相杂交 液相杂交是指参加反应的两条核酸链都游 离在溶液中。液相分子杂交技术包括吸附 杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复 性速率液相分子杂交等
• 多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐（acetic anhydride）和三乙醇胺（tri－ ethanolamine）中以减低静电效应，减少 探针对组织的非特异性背景染色。 • 有的作者除在室温下浸于上述溶液10min外， 还在预热37℃的50%甲酰胺/2×SSC液中预 杂交15min，然后用2×SSC，0.30mol/l NaAc/0.030mol/L枸橼酸钠液中浸15min。 • 但也有报道乙酸酐和三乙醇胺液的处理并 不能起到减低背景的目的，不能改善ISHH 的信/噪比例。
• 2．增强组织的通透性和核酸探针的穿透性 • 此步骤根据应用固定剂的种类、组织的种类、 切片的厚度和核酸探针的长度而定。 • 增强组织通透性常用的方法如应用稀释的酸 洗涤、去垢剂（detergent）或称清洗剂Triton X-100、酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白 酶、胶原蛋白酶和淀粉酶（diastase）等。 • 这种广泛的去蛋白作用无疑可增强组织的通 透性和核酸探针的穿透性，提高杂交信号，但同 时也会减低RNA的保存和影响组织结构的形态， 因此，在用量及孵育时间上应慎为掌握。
培养细胞
原位杂交组织化学技术发展
• 1961年，Hall 液相核酸杂交技术 • 1969年，Gall 和Pardue 用爪蟾核糖体基因探针 与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞 的核仁中。 • 1969年，Buongiorno-Nardelli和Amaldi John 利 用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因 定位，创造了原位杂交细胞或组织化学技术。 • Orth（1970）应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA 探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首 次用原位杂交检测了病毒DNA在细胞中的定位，但 当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞，探 针均采用同位素标记。