(完整版)疟原虫检验技术
疟原虫的镜检技术
厚血膜间日疟小滋养体 形态
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厚血膜恶性疟小滋养体形态
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厚血膜恶性疟小滋养体
• 恶性疟环状体在 发育不同阶段， 其个体大小有很 大变化。注意粗 环与间日疟环状 体的区别。
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厚血膜间日疟大滋养体 形态
厚血膜裂殖体 形态
• 裂殖体 间日疟原虫、恶性疟原虫的裂殖 体前期及成熟殖体，除虫体略为缩小着色 较深外，均与薄血膜相似。
恶性疟裂殖体
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厚血膜间日疟裂殖体 形态
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厚血膜恶性疟裂殖体 形态
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疟原虫的镜检技术
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疟疾的实验室诊断技术
疟原虫的镜检技术 1.血片制作与染色。 2.厚、薄血膜中各期疟原虫的形态结构及其鉴
别要点。
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厚血膜中疟原虫的形态
在厚血膜中，各期疟 原虫的体积都略为 缩小，其中只有大、 小滋养体的形态有 较大改变，而裂殖 体和配子体的形态 则无明显变化。
点彩。
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间日疟大滋养体呈阿米 巴样运动，胞浆常断裂几 块或缩成圆形，核和疟色 素均被包在胞浆之中，着 色深，只隐约可见红色的 核和黄绿色的疟色素。胞 浆可皱缩断裂成几个块状 ，大小不一，似互不连接 。核位于胞浆之中或外边 。疟色素分布不均匀。有 些仅见胞浆和疟色素而核 看不清楚。
大滋养体
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疟原虫检验技术
仪器使用记录
建立仪器使用记录，包括 使用日期、使用时间、使 用人员等信息，以便追踪 问题。
室内质控和室间质评参与情况
室内质控
改进措施
建立室内质控体系，定期对实验操作 过程进行监控和评估，确保实验结果 的准确性和可靠性。
根据室内质控和室间质评结果，及时 总结经验教训，对实验操作进行优化 和改进。
室间质评
疟原虫特点
疟原虫是一种单细胞寄生生物，具有 寄生性、致病性和传播性。其生命周 期包括在人体内进行无性繁殖和在按 蚊体内进行有性繁殖两个阶段。
疟原虫生活史及传播途径
生活史
疟原虫在人体内寄生在红细胞中，通过裂体增殖方式进行无性繁殖。当按蚊叮咬 感染者时，疟原虫进入按蚊体内进行有性繁殖，形成子孢子。当按蚊再次叮咬人 时，子孢子侵入人体红细胞，开始新一轮的无性繁殖。
具有重要意义。
评估治疗效果
定期监测患者血液中疟原虫密度 变化，可评估抗疟药物的治疗效
果。
疟原虫检验在流行病学调查中应用
疫情监测
通过检测人群中的疟原虫感染率，可了解疟疾在特定地区的流行 状况，为制定防控策略提供依据。
传染源追踪
对确诊疟疾病例进行个案调查，了解其感染来源和传播途径，有助 于追踪传染源，阻断传播链。
人群免疫水平评估
通过检测人群中的疟原虫抗体水平，可评估人群的免疫状况，为制 定免疫策略提供参考。
新技术新方法在疟原虫检验中应用前景
基因诊断技术
01
利用PCR、基因测序等技术检测疟原虫基因，提高诊断敏感性
和特异性，有助于早期发现和鉴别诊断。
免疫学方法
02
发展高灵敏度、高特异性的免疫学检测方法，如ELISA、胶体金
法等，提高疟疾的诊断效率。
疟原虫检验技术
加强技术研究和应用
加强疟原虫检验技术的研究和应用，提高诊断和治疗水平。
推广普及适宜技术
推广普及适宜技术，降低技术应用成本，提高基层医疗机构的疟疾防治水平。
加强国际合作
加强与国际组织和相关国家的合作，共同推进疟疾防治工作，提高全球范围内疟疾控制的效果。
01
02
03
THANK YOU.
谢谢您的观看
从最初的化学预防到现在的综合防控，防控策略不断发展和完善。
02
疟原虫检验技术分类
血片染色镜检
通过在显微镜下观察染色血片，检测疟原虫ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ种类和数量。
活体染色镜检
利用活体染色剂对患者的血细胞进行染色，然后在显微镜下观察疟原虫的活动情况。
显微镜检查
免疫荧光抗体技术
通过将荧光素标记的抗体与患者血清中的疟原虫抗原结合，然后在荧光显微镜下观察并计数。
优点
直接观察疟原虫形态，定位准确；可同时观察几种不同种类的疟原虫；样品容易获取，操作相对简单；费用较低。
缺点
需要有经验的检验员才能准确识别疟原虫；无法区分死菌和活菌；无法鉴定疟原虫的种类；需要时间较长，无法快速检测。
显微镜检查的优缺点
优点
可以检测出感染疟疾后机体产生的特异性抗体，用于诊断和流行病学调查；可以判断出感染疟疾的时间；样品容易获取，操作相对简单。
缺点
抗体检测存在假阳性或假阴性；无法准确判断抗体的种类和来源；无法判断感染疟疾的种类；血清学检测需要时间较长。
血清学检查的优缺点
可以检测出疟原虫的核酸，具有更高的特异性和灵敏度；可以准确鉴定疟原虫的种类；可以判断出疟原虫的基因型；样品容易获取，操作相对简单。
优点
无法区分死菌和活菌；分子生物学检测需要较高的技术和设备支持；检测费用相对较高；对于样品的质量和保存条件要求较高。
疟原虫检验技术
具有较高的灵敏性和特异性，可用于早期诊断和流行病学调查。
优点
恶性疟原虫免疫荧光染色法
优点
具有较高的灵敏性和特异性，可用于早期诊断、药物治疗监测和流行病学调查等。
原理
以疟原虫特异性DNA片段作为引物，通过聚合酶链反应扩增特异性DNA片段，然后将扩增产物进行电泳分析，以检测疟原虫的存在。
局限性
不同种疟原虫的DNA序列存在差异，因此需要针对不同种疟原虫设计不同的引物。
聚合酶链反应（PCR）
对疟原虫的基因序列进行分析，可了解疟原虫的种群结构、遗传变异和抗药性。
核酸序列分析
分子生物学检验
体外培养法
将患者血液中的疟原虫接种到按蚊细胞或其它传代细胞系中，进行体外培养，用于分离和鉴定疟原虫。
体内培养法
将患者血液中的疟原虫接种到按蚊体内，进行体内培养，用于分离和鉴定疟原虫。
流行病学调查
通过对疟疾疫源地进行分析，找出传染源和传播途径，有助于制定针对性的防控措施，控制疫情扩散。
疫源地分析
流行病学调查与疫源地分析
结论与展望
06
疟原虫检验技术的重要性和意义
疟原虫检验技术是疟疾诊断、治疗和防控的关键手段，对于减少疟疾传播、保护人民健康具有重要意义。
疟原虫检验技术的发展和应用，有助于提高疟疾防治效果，降低疟疾发病率和死亡率，为国家和人民节省了大量医疗资源和社会成本。
xx年xx月xx日
疟原虫检验技术
目录
contents
疟原虫检验概述疟原虫检验技术分类各种疟原虫检验技术介绍疟原虫检验技术的应用范围与局限性疟原虫检验的实际应用案例结论与展望
疟原虫检验概述
01
疟原虫检验是指通过实验室手段对患者的血液、组织、排泄物等进行检查，以确诊疟疾感染和评估病情严重程度。
抓住疟疾的原凶——疟原虫的检测
抓住疟疾的原凶——疟原虫的检测说到疟疾，肯定很多人都有听说过，但是对于这一疾病以及如何检测却知之甚少。
那么，下文中将会为大家介绍疟疾这一疾病及疟原虫的检验方法，也希望能帮助到更多的人们。
1什么是疟疾？疟疾的发生主要是疟原虫感染所导致，雌性按蚊体内可能会携带疟原虫，而这些蚊虫叮咬人体后会导致疟原虫感染，使人出现疟疾。
三日疟原虫、卵形疟原虫、诺氏疟原虫、恶性疟原虫以及日疟原虫这五种疟原虫均有可能会引发疟疾。
一般在蚊虫叮咬之后的两周时间左右，患者会出现一系列症状，刚开始时会有较轻的发热、头痛、打冷颤症状，也有一些患者会出现间歇性发冷、发热或是恶心、呕吐、腹泻的情形，恶性疟疾还可能会发展为重症病例，此时患者就会出现意识障碍或昏迷，还有可能会出现严重的并发症，比如说肝肾损伤、脑损伤、肺水肿、休克、溶血，一些患者甚至会因此而丧命。
2疟原虫的检测方法有哪些？2.1厚、薄血膜法这一检验方法敏感性较高，且操作比较方便，可对疟原虫的种类进行鉴别，因此现阶段也被广泛应用在疟疾这一疾病的检验中。
厚、薄血膜法检验时先要进行血片的制作，一般需要采集患者耳垂处的血液，也可在手指末端或足跟取血，取血之后涂制血膜，一般情况每张载玻片上需要做一个薄血膜和一个厚血膜，完成制作后在玻片上写上受检者号码，血膜自然干燥后进行染色，完成染色后将一滴香柏油加在血膜上，之后再利用显微镜进行检查，根据疟原虫的形态，来确定患者的感染类型是属于三日疟、间日疟还是恶性疟，亦或是属于混合感染，确定检查结果后医生会结合患者具体情况科学制定治疗方案。
2.2疟原虫快速诊断试纸（RDT）检测方法疟原虫快速试验试纸检测方法出结果速度较快，且操作比较方便，因此如果在日常出现了疟疾的相关症状也可采取这一方式进行检测。
使用这一方式进行疟原虫检测时，要遵循如下规定，一是此项检测方法仅用于体外诊断，二是在执行化验分析时应当佩戴一次性手套，完成检验之后要认真的清洗双手，三是在样本处理的过程中，避免吸烟或是进食。
疟原虫检验技术
采血量
一般需要50-100微升全血，用于 制作厚薄涂片。
粪便样本采集
采集时间
通常在出现症状后3-10天采集。
采集方法
使用干净容器，收集患者粪便的脓血部分或黏液 部分，避免采集尿液。
采集量
至少需要5克粪便，用于制作涂片。
组织样本采集
采集时间
01
在患者死亡后尽快采集病变组织样本。
采集方法
02
使用手术刀或活检钳采集病变组织样本，避免采集过多健康组
保存涂片或切片，并使用固定液进行固定 ，以防止样本变质或损坏。
04
疟原虫检验技术应用
诊断及病情监测
诊断
通过疟原虫检验技术，医生可以准确诊断患者是否感染疟原虫，以及感染的疟 原虫种类。这对于早期发现、预防和治疗疟疾至关重要。
病情监测
疟原虫检验技术可以帮助医生监测患者的病情变化，以及判断治疗效果。通过 定期检查患者的血液或其他体液样本，医生可以评估疟疾的感染程度和治疗效 果。
技术合作
开展技术合作，共同研发新的疟原虫检验技术和设备，提 高全球疟疾防控的技术水平。
经验交流
定期组织经验交流会议，分享各国在疟疾防控和治疗的成 功案例和经验，促进相互学习与借鉴。
资金支持
呼吁国际组织、政府和企业提供资金支持，帮助发展中国 家加强疟疾防控能力建设，推动全球范围内控制和消除疟 疾的进程。
免疫学方法
间接荧光抗体法
检测血清中是否存在疟原虫抗 体，用于诊断疟原虫感染。
酶联免疫吸附试验
通过酶与抗体或抗体的结合，检测 样本中是否存在疟原虫抗原。
免疫印迹法
用于检测和鉴定疟原虫的特异性抗 原。
分子生物学方法
DNA探针法
利用特异性的DNA探针，检测样本中是否存在疟原虫的DNA序列 。
疟原虫检验技术概要
-血片制作、染色及疟原虫形态鉴别
黔东南州疾控中心检验vivax，P.v] 恶性疟原虫 [P．Falciparum,P.f] 三日疟原虫[P．Malariae,P.m] 卵形疟原虫[P．Ovale,P.o] 我国主要是间日疟原虫和恶性疟原虫；另 二种少见，近年偶见国外输入病例。 其它疟原虫 诺氏疟原虫(Plasmodium nowlesi)
时间越久，厚血膜越不易脱血，染色效果也差。
疟原虫镜检
● 疟原虫厚、薄血膜镜检优缺点 ● 疟原虫密度计数方法 ● 人体四种疟原虫的形态特征
原虫镜检---金标准
●当前分子生物学、血清学技术快速发展, 但是厚薄血片的检查仍被认为是不可替 代的确诊疟疾的 “金标准”
●显微镜检查是唯一可查到原虫实体并鉴 别4种人体疟原虫
直至甘油加完，将研磨的染液倒入棕色瓶中，在 研钵中加 入少许甲醇清洗研钵，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗 ，反复数次，直至甲醇用完。盖好瓶盖，将染液充分摇匀， 置于室内，每天晃动数分钟，存放一周后经过滤即可使用。 保存时间越长染色效果越好。
●整个染色液配制时间不能少于5个小时
血片的染色
染色用水和冲洗用水配制
疟原虫密度计算
计算疟原虫密度的三种方法： ● 白细胞原虫密度计数法 (厚血膜 WHO) 优点：可作为定性和定量分析 ● 半定量计数法 (厚血膜) 优点：方法简便 缺点：只能定性，不宜作为定量分析 ● 红细胞感染密度计算法 (薄血膜)
采血部位：耳垂或无名指， 取血方法：通常在耳垂取血， 先用75%酒精棉球消毒取血部位 ，待酒精干后，用左手拇指和 食指紧捏耳垂上方或无名指指 尖，右手持消毒针迅速刺入皮 肤，不宜过深或过浅。然后用 右手中指轻轻挤压出血。厚血 膜血量约一粒米大小,薄血膜血 量为厚血膜的一半或1/3。
疟原虫镜检技术
疟原虫镜检技术血片制作与染色一、血片制作（一）所需器材1、载玻片：玻片使用前应清洗。
新玻片应先浸入有液态洗涤剂的清水中10~20分钟，然后用干净棉巾逐个擦拭，再用清水冲洗干净，晾干，最后用干净、柔软的棉巾将玻片擦亮。
用于特殊的目的时，最后可将玻片浸泡在95％酒精中5~10分钟，再将玻片擦干擦亮。
已用过的玻片应先浸泡于洗涤剂溶液中1~2天，或浸泡于煮沸的5％肥皂水中1~2小时，再移到新配置的洗涤剂溶液中1~2小时，逐个擦去玻片上旧的血膜痕迹，用清水漂洗干净，再将玻片擦干擦亮。
洗净的玻片每10~20张用白纸包好放入塑料袋内，保存于干燥环境中备用。
2、采血针：使用一次性釆血针。
3、玻片盒：为防止污染和苍蝇吸食血膜，新制作的血膜应放在玻片盒中，厚血膜放置时要保持水平，直到充分干燥。
4、75％酒精棉球：用于采血前后的消毒。
5、记号笔或铅笔：用于玻片上书写号码。
（二）采血部位及取血方法采血部位以耳垂较为合适，也可在手指末端采血，婴儿可从拇趾或足跟取血。
先用75％酒精棉球消毒取血部位后，以一次性采血针迅速刺入取血部位1~2mm深，然后用左手大拇指、食指和右手中指协同挤出血滴。
（三）涂制血膜取玻片2张，1张作载片，1张作推片（具有光滑边缘）。
用右手拇指和食指夹持推片侧缘中部，用推片的左下角刮取血液4~5μl，再用该端中部刮取血液1~1.5μl。
将左下角的血滴涂于载片的中央偏右处，由里向外划圈涂成直径为0.8~1cm的圆形厚血膜（厚度以1个油镜视野内可见到5~10个白细胞为宜）。
用干棉球抹净玻片角上的血渍，然后将推片下缘平抵载玻片的中线，当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持25°～35°角，从右向左迅速向前推成舌状薄血膜，制成的薄血膜应在玻片上形成平铺的血细胞，细胞之间互相接触而不相互重叠。
每张载玻片上分别做1个薄血膜，1个厚血膜。
取干净玻片及推片各一张，用右手大拇指和食指夹持推片侧缘中部，用推片的左下角刮取血液4～5μl（约火柴头大小），再用该端中部刮取血液1～1.5μl。
疟原虫检验技术
疟原虫检验技术一、疟原虫的生物学特征疟原虫是一类单细胞真核生物，寄生在人类和其他脊椎动物的红细胞内。
常见的疟原虫种类包括恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫等。
疟原虫的生活史包括在人体内的无性生殖和在蚊体内的有性生殖两个阶段。
在人体内，疟原虫经历了肝细胞内的红外期和红细胞内的红内期发育过程。
了解疟原虫的生物学特征对于选择合适的检验方法具有重要意义。
二、疟原虫检验技术的分类1、显微镜检查法这是疟原虫检验的经典方法，包括薄血膜涂片和厚血膜涂片检查。
薄血膜涂片用于疟原虫形态学观察，可鉴定疟原虫的种类；厚血膜涂片则提高了疟原虫的检出率。
在显微镜下，观察疟原虫的形态、大小、细胞核和细胞质的特点，以及疟色素的分布等，从而确定是否感染疟原虫以及感染的种类。
2、免疫学检测法（1）抗原检测利用免疫层析技术检测患者血液中的疟原虫抗原。
这种方法操作简便、快速，适用于现场检测和大规模筛查。
（2）抗体检测检测患者血清中的特异性抗体。
但由于抗体在感染后一段时间才会产生，且抗体检测不能区分现症感染和既往感染，因此在疟疾诊断中的应用相对有限。
3、分子生物学检测法（1）PCR 技术通过扩增疟原虫特定的基因片段来检测疟原虫。
具有高度的敏感性和特异性，能够检测到极低浓度的疟原虫核酸。
（2）核酸杂交技术利用标记的核酸探针与疟原虫核酸进行杂交，从而检测疟原虫。
4、其他检测方法（1）血常规检查疟疾患者可能会出现贫血、白细胞减少等血常规异常。
（2）血生化检查部分疟疾患者可能会有肝肾功能损害，通过血生化检查可以了解相关情况。
三、显微镜检查法的操作步骤1、采血通常采集患者的末梢血或静脉血。
2、制作血涂片薄血膜涂片：将一滴血液滴在载玻片的一端，用推片以 30°－45°角均匀地推成薄而均匀的血膜。
厚血膜涂片：取较多的血液滴在载玻片上，用推片制成较厚的血膜。
3、固定和染色薄血膜涂片自然干燥后，用甲醇固定，然后用吉姆萨染液或瑞氏染液染色。
疟原虫检验技术
疟原虫检验技术1）薄血膜（thin blood film）制作方法（1）采血：临床上取病人耳垂或指尖血（2）操作方法：取病人末梢血1滴，置载玻片的中部，使推片和玻片保持30～40度夹角，将血滴在推片边缘展开后，匀速向前推动，即形成舌状血膜。
2）厚血膜（thick blood film）制作方法（1）采血同薄血膜法（2）操作方法：厚血膜可置于薄血膜的另一端。
取病人末梢血2-3滴，自里向外顺着一个方向徐成直径约1cm大小，厚薄均匀的血膜。
厚、薄血膜间用蜡笔画线分开。
充分晾干后，滴加蒸馏水于厚血膜上溶血，将水倾去，晾干后与薄血膜一起染色。
3）固定、染色（1）瑞氏染色：先用蜡笔在血膜两端划上线，以防染液外溢。
瑞氏染液为甲醇溶液，血膜不需预固定、此染色法快速，适于临床检验，但较易褪色，保存时间不长。
滴加瑞氏染液数滴，使之覆盖血膜，约1～2min后血膜被染液中的甲醇固定，再加与染液等量的缓冲液或蒸馏水，轻摇载玻片，使染液与稀释液混匀，3～5min后用缓冲液或自来水从玻片一端冲洗，晾干后镜检。
4）注意事项(1）玻片要洁净，无油脂。
血量适中，推速均匀，以防血膜过厚、过薄或出现条状横纹。
血片在干燥过程中，避免灰尘或苍蝇脱吸。
(2）厚薄皿膜制备在一张载玻片时，应注意在厚血膜溶血前必须先用甲醇固定薄血膜，以避免接触水而使薄血膜上的红细胞溶解。
厚血膜溶血时间不可太长，不要振荡，以防血膜脱落。
(3）染液是甲醇溶液，切忌混入水滴，否则发生沉淀，妨碍染色，故染液发现有沉淀时不可再用。
(4）滴加染料切忌太多，否则染料残渣粘在血膜上无法洗净，影响检查。
加水后必须与染料充分混合，否则发生染色不均。
冲洗血膜时应流水直接将染液冲去，避免染料粘着血膜。
疟原虫血涂片镜检技术规范
附件3疟原虫血涂片镜检技术规范一、吉氏液染色--光学显微镜（油镜）检查同时涂制薄血膜和圆形厚血膜，薄血膜须用甲醇固定，用吉氏染色液（Giemsa stain）进行染色。
吉氏染液用pH7.0-7.2的水配成3%的稀释液，可将血片插入染色缸内染色，或用滴管将稀释液滴在厚、薄血膜上，染色30min，若需快速染色，可在2ml水中加吉氏染液3滴，染色6min 。
对临床诊断为脑型疟者，宜用快速染色法，以便能尽快获得确诊依据。
现症患者至少检查100个厚血膜视野，带虫者应查完整个厚血膜，未发现疟原虫才判为阴性。
薄血膜可用于原虫形态鉴定。
以薄血膜中平均每100个红细胞中的原虫数，或厚血膜中平均每100个白细胞范围内的原虫数，推算每微升血中的原虫密度。
染色血片中的原虫核呈红色，胞浆呈兰色。
除环状体外，其他各期均可查见褐色的疟色素。
除恶性疟病例外，均可查见各期疟原虫。
一般恶性疟病例，仅查见环状体，或可见配子体。
但脑型疟病例，不仅原虫密度高，查见的环状体比一般的粗大，而且可查见大滋养体和裂殖体，疟色素呈黑褐色，这些特点对明确诊断很有帮助。
还有一点值得注意，在非洲感染的非重症恶性疟病例，其环状体往往比国内一般恶性疟病例所见的环状体粗大，胞浆较多，与间日疟原虫小滋养体相似，容易误判为间日疟原虫，但也不能同时查见大滋养体和裂殖体，这一点有别于间日疟原虫感染。
二、瑞氏液染色-光学显微镜（油镜）检查同时制作厚、薄血膜，用瑞氏染液（Wright stain）进行染色。
在厚血膜上加清水2-3滴溶去血红蛋白，染色效果较好。
染色时，先在薄血膜上直接加约1ml瑞氏液染色2min，然后在薄血膜上加与染液等量的水稀释，并引到厚血膜上共染5-6min。
其他参见吉氏液染色法。
三、荧光素吖啶橙染色-荧光显微镜检查要求涂制成直径为1.2-1.5cm的亚厚血膜，不宜过薄。
须用甲醇固定薄血膜，用清水溶去厚血膜的血红蛋白。
吖啶橙1g加pH6.5-7.0磷酸缓冲液100ml配制成1%吖啶橙母液。
疟原虫的镜检技术
正确使用显微镜步骤
01
02
03
04
05
将载玻片放在载物台上， 用压片夹固定。
转动转换器，将低倍物镜 对准通光孔。
调节光圈和反光镜，使视 野亮度适宜。
转动粗准焦螺旋，使镜筒 缓缓下降，直到物镜接近 载玻片。
一只眼注视目镜内，同时 逆时针方向转动粗准焦螺 旋，使镜筒缓缓上升，直 到看清物像为止。再略微 转动细准焦螺旋，使看到 的物像更加清晰。
结果判断失误
应结合临床症状和其他检查结果进 行综合判断，避免误诊或漏诊。
06
镜检技术在疟疾防控中应用前景
提高镜检技术准确性和效率
01
02
03
改进显微镜设备
采用高分辨率、高对比度 的显微镜，提高疟原虫检 测的准确性。
优化镜检流程
建立标准化的镜检操作流 程，减少人为因素对结果 的影响，提高检测效率。
05
常见误区及问题解决方法
涂片制作中常见问题
涂片过厚或过薄
染色时间不足或过长
应掌握适当的涂片厚度，过厚会影响 观察，过薄则可能漏检。
应严格控制染色时间，确保疟原虫着 色清晰。
血液未充分干燥
涂片后应等待血液完全干燥，否则在 染色过程中可能导致颜色不均匀。
观察过程中常见问题
02
Hale Waihona Puke 0103显微镜使用不当
100%
流行病学调查
通过对人群进行疟原虫检测，可 以了解疟疾的分布情况、流行趋 势和传播途径等信息，为制定防 治策略提供依据。
80%
药物疗效评价
在治疗过程中进行疟原虫检测， 可以观察药物的疗效和患者的恢 复情况，及时调整治疗方案。
02
镜检技术原理及方法
疟原虫实验报告
一、实验目的1. 了解疟原虫的生命周期及繁殖过程。
2. 掌握疟原虫的培养、观察及计数方法。
3. 研究疟原虫在不同环境条件下的生长状况。
二、实验材料1. 疟原虫虫种：恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）。
2. 实验仪器：显微镜、载玻片、盖玻片、滴管、吸管、酒精灯、恒温培养箱等。
3. 实验试剂：RPMI-1640培养液、胎牛血清、青霉素、链霉素等。
三、实验方法1. 疟原虫的培养（1）取恶性疟原虫的感染红细胞，加入含有青霉素和链霉素的RPMI-1640培养液，过滤除菌。
（2）将过滤后的感染红细胞接种于96孔培养板，每孔100μl。
（3）将培养板置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养，每隔24小时更换新鲜培养液。
2. 疟原虫的观察与计数（1）在显微镜下观察恶性疟原虫的形态、大小、运动方式等特征。
（2）使用计数板对恶性疟原虫进行计数，计算每毫升培养液中疟原虫的数量。
3. 不同环境条件下的疟原虫生长状况研究（1）设置不同温度（25℃、30℃、35℃、40℃）的培养条件，观察疟原虫的生长状况。
（2）设置不同CO2浓度（5%、10%、15%、20%）的培养条件，观察疟原虫的生长状况。
（3）设置不同胎牛血清浓度的培养条件，观察疟原虫的生长状况。
四、实验结果1. 疟原虫的培养恶性疟原虫在37℃、5%CO2的恒温培养箱中生长良好，每隔24小时更换新鲜培养液，观察其繁殖过程。
2. 疟原虫的观察与计数在显微镜下观察到恶性疟原虫呈椭圆形，大小约为10μm×5μm，具有典型的疟原虫形态特征。
通过计数板计数，计算每毫升培养液中疟原虫的数量。
3. 不同环境条件下的疟原虫生长状况（1）温度对疟原虫生长的影响：在25℃、30℃、35℃、40℃的温度条件下，疟原虫的生长速度逐渐加快，数量逐渐增加。
（2）CO2浓度对疟原虫生长的影响：在5%、10%、15%、20%的CO2浓度条件下，疟原虫的生长速度逐渐加快，数量逐渐增加。
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薄血膜再取一小滴血.将血置 于第一张玻片离厚血膜适 当远的地方.将 推片的边 缘紧贴载玻片，轻轻上下 移动，使血液沿边缘散开， 然后匀速地向前推进，形 成薄而平铺的薄血膜
外观吉氏染色血片
偏酸 标准
偏碱
染色质量影响因素
➢配置完吉氏原液时必须过滤除去杂质颗粒，有助 于提高镜检质量； ➢染液稀释后使用时间：原液必须临用时稀释，随 配随用； ➢染液的稀释浓度； ➢染色时间。
染色质量影响因素
➢染色稀释用水: PH7.0-7.2清洁水。
用水过酸，可致感 染的RBC上的点彩 染不出来；
恶性疟 P.falciparum
● 分布热带、亚热带，是非洲的重要疾病
● 我国流行区域为云南省和海南省
● 四种疟原虫中致病力最强，无免疫力者 感染后出现急性症状,不及时治疗可危及 生命（脑型疟）
间日疟 P.vivax
● 遍布全球温带地区及大片热带地区。在热 带非洲，特别是西非则很少见
● 间日疟原虫分布于我国大部分地区,主要是中部地区 ● 病程良性, 有复发
间日疟（P. vivax ）
鉴定要点
1. 红细胞明显涨大 2. 薛氏点明显 3. 成熟环状体粗大 4. 滋养体胞浆有阿
米巴样伪足 5. 血片中可见各期
的原虫形态 6. 成熟裂殖体约含
12-24个裂殖子
2. Intermittent fever; arrived from India 2 months ago.
原虫镜检---金标准
●当前分子生物学、血清学技术快速发展, 但是厚薄血片的检查仍被认为是不可替 代的确诊疟疾的 “金标准”
●显微镜检查是唯一可查到原虫实体并鉴 别4种人体疟原虫
疟原虫厚、薄血膜镜检优缺点
优点 缺点
用途
厚血膜
薄血膜
血量多，面积小，原虫 检出率高
经甲醇固定，红细胞完 整，原虫形态改变不大，
第三步：采集血样
采血部位：耳垂或无名指，
取血方法：通常在耳垂取血， 先用75%酒精棉球消毒取血部位 ，待酒精干后，用左手拇指和 食指紧捏耳垂上方或无名指指 尖，右手持消毒针迅速刺入皮 肤，不宜过深或过浅。然后用 右手中指轻轻挤压出血。厚血 膜血量约一粒米大小,薄血膜血 量为厚血膜的一半或1/3。
第四步：血片制作
每微升血白细胞数 = 疟原虫数/μl血。 ➢ 如果不知患者的白细胞数，则每微升血以8000个
白细胞计数(国际标准) 。
白细胞原虫密度计数法
➢ 从血膜的左上角开始，横向。 ➢ 计数1个视野后，每次间隔5个视野,再计数。
厚血膜
白细胞原虫密度计数方法
× 不需要计数的视野
● 需要进行白细胞、疟 原虫计数的视野 如果该视野无原虫，则 计数白细胞数
2. 常见慧星状 ( 也称齿轮状)
3. 环粗大
4. 薛氏点明显 5. 成熟滋养体类
似三日疟原虫 但更粗大 6. 成熟裂殖体约 含6-12个裂殖 子
18. Recent trip to Southern India- headaches and vaguely unwell.
类型
周围血 中发育 阶段
● 看到第一个原虫开始 计数
白细胞疟原虫计数法
●例如 计数200 WBC中有135个疟原虫，在不知患 者白细胞数的情况下，以每微升血8 000个白细 胞计数, 由此计算出每微升血液疟原虫密度为：
135（计数的疟原虫数）÷200（计数的白细胞）x 8000（每微升血白细胞数） =5400 / μl
答：该患者的疟原虫密度为5400 / μl。
碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞）
红细胞
红细胞是双面凹 的圆饼状
边缘较厚，而中 间较薄
血小板
5 12
3 4 6
各种血细胞模式图
1.红细胞 2.嗜酸性粒细胞 3.嗜碱性粒细胞 4.中性粒细胞
7 5.淋巴细胞
6.单核细胞 7.血小板
疟原虫的基本形态特征
➢ 疟原虫基本构造为细胞质(胞浆)、核和疟色素；
如：Pv R+T++S5G少
这种方法简便，缺点是计数的疟原虫数受血膜厚薄 影响，只能定性，不宜作定量分析。
如何确定疟原虫血片为阴性
● 检查全部厚血膜视野未查见疟原虫 ● 最少检查100个厚血膜视野未查见
疟原虫（临床病人）
疟原虫镜检
人体四种疟原虫的分布
感染人的疟原虫有四种:
恶性疟原虫 P. falciparum 间日疟原虫 P. vivax 三日疟原虫 P. malariae 卵形疟原虫 P. ovale
吉氏染液(原液)的配置
吉氏染粉 (Azure B type) 甘油 (纯) 甲醇 (纯)
5g 250ml 250ml
●吉氏粉放入研钵中，加少量甘油充分研磨, 然后边加边磨， 直至甘油加完，将研磨的染液倒入棕色瓶中，在 研钵中加 入少许甲醇清洗研钵，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗 ，反复数次，直至甲醇用完。盖好瓶盖，将染液充分摇匀， 置于室内，每天晃动数分钟，存放一周后经过滤即可使用。 保存时间越长染色效果越好。
半定量计数法
用厚血膜每个视野中所观察到疟原虫的平均数粗略地估 算出疟原虫密度。此方法将密度分为6级： 1.全厚血膜查见疟原虫数在10个以内，记录实际数字 2.全厚血膜查见疟原虫数在10个以上，但平均每个视野 不到1个虫，记录“少” 3.平均每个视野1～5个虫，记录“＋” 4.平均每个视野6 ～ 10个虫，记录“++” 5.平均每个视野11 ～ 100个虫，记录“+++ ” 6.平均每个视野100个虫以上，记录“++++ ”。
● 半定量计数法 (厚血膜) 优点：方法简便 缺点：只能定性，不宜作为定量分析
● 红细胞感染密度计算法 (薄血膜)
白细胞原虫密度计数法
➢ 镜检厚血膜，按视野顺序，记录200个白细胞中的 疟原虫数，如果原虫密度较低（200个白细胞中小 于100个疟原虫），可增加白细胞，计数500个。
➢ 密度单位:原虫数/μl ➢ 计算公式：疟原虫数 ÷ 计数的白细胞数 × 患者
三日疟（P.malariae）
诊断要点
➢红细胞不涨大或略小 ➢环状体中等大小，核较大 ，胞浆粗厚 ➢胞浆不活跃呈带状形成熟 滋养体呈菊花状,内含6-12 个裂殖子 ➢雌雄配子体小于正常红细 胞，色素呈深褐色 ➢常可查见各阶段的疟原虫
卵形疟（P. ovale ）
鉴定要点
1. 红细胞正常或 略涨大
内容提纲
➢ 血片制作与染色 ➢ 疟原虫计数 ➢ 疟原虫的基本形态特征
血片制作
➢ 第一步：载玻片的清洗 用加有洗洁精或洗衣粉的热水洗涤，清水
冲洗后凉干，浸于95% 的乙醇中1小时以上
用绸布擦干置干燥环境中保存。
第二步：患都信息的核实
采集血样涂片时，首先要核对患者的 姓名和年龄并在玻片的右侧编号
➢ 血片制作场所要保持清洁，以免尘埃沾污血膜，防止苍蝇 等舔食血膜；
➢ 制成的血片在未干前不能倾斜放置，待其自然干燥，不要 加热，加热会使原虫变形，影响镜检结果．
血片染色
两种染色方法:
●吉氏染色法
1. 染色原液配制 2. 门诊快染、慢染 3. 成批染色和溶血染色
● 瑞氏染色法
WHO推荐使用吉氏染色法
●整个染色液配制时间不能少于5个小时
血片的染色
染色用水和冲洗用水配制
常用中性的蒸馏水或经煮沸过滤的冷开水 用pH7.0～pH7.2的缓冲液。
血片染色
薄血膜的固定
厚血膜充分干燥, 用甲醇固定薄血膜， 平放待干 （要点：甲醇不能 触碰到厚血膜）
血片染色
操作1 （快染） 量筒内 量2ml缓冲液(PBSPH7.0) 或净水，直接滴加吉氏原 液7滴，混匀，滴入待染标 本的厚薄血膜上，染色 10min，清水缓缓冲洗，晾 干（血膜朝内面）镜检。
红细胞形态
大小
点彩
疟原虫形态 胞浆
疟色素
裂殖子数
恶性疟原 虫
间日疟原 虫
环状体 配子体
各期滋 养体 裂殖体 配子体
正常大 小
涨大,可 达正常 的 1.5-2 倍常见２个核， 体中明显
一个红细胞内 常有2个以上 的原虫
阿米巴样滋养 体，浅蓝色， 活泼
疟原虫检验技术
-血片制作、染色及疟原虫形态鉴别
黔东南州疾控中心检验科 潘雪雪
寄生人体的四种疟原虫
间日疟原虫 [P. vivax，P.v] 恶性疟原虫 [P．Falciparum,P.f] 三日疟原虫[P．Malariae,P.m] 卵形疟原虫[P．Ovale,P.o]
我国主要是间日疟原虫和恶性疟原虫；另 二种少见，近年偶见国外输入病例。 其它疟原虫 诺氏疟原虫(Plasmodium nowlesi)
薄血膜 厚血膜
制片过程图示
标签
标准的疟疾厚薄血膜片
●厚血膜血量不宜过多或过少 ●薄血膜平整,无皱折和空泡.显微镜下红细胞单层排列
标签
血片的制作
×
×
×
×
×
√
血片制作影响因素
➢ 载玻片必须清洁无油污，理想的薄血膜是一层血细胞均匀 分布不重叠、无裂缝、无皱折和空泡，血膜末端呈舌状；
➢ 厚血膜厚度以一个油镜视野内可见5-10个白细胞为宜；
➢ 原虫：经吉氏或瑞氏染色：核呈红色，胞质呈 兰色，疟色素为本色；
➢ 细胞浆：蓝色或深蓝色，随着虫体发育长 大，细胞浆逐渐增多；
➢ 核：呈鲜红色，呈圆形或椭圆形。核的结
构致密，只有在个别发育阶段较为疏松，