精选推荐硕士研究生课 现代分子生物学 核酸研究进展
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3
核酸实验研究技术进展－ 1
杂交法的优点与缺点：
? 优点：? Dot blotting：简单实用，适于进行大样本数同时检测。
? Northern blotting：如果检测结果阳性，其可信度要远远高于
RT-PCR，因此被誉为评价基因转录的Golden Marker。
?
Southern blotting：对DNA病毒类病原体等的检测实用性很强。
B 食管癌细胞
SHEEC
18
核酸实验研究技术进展－ 1
? 通过 RT-PCR，结合条带光密度扫描分析，测定实验 标本中目标mRNA分子或目标cDNA分子的含量
19
核酸实验研究技术进展－ 1
例子：RT-PCR 检测SHEEC食管癌细胞与永生化食管上皮 细胞SHEE中 NGAL基因转录mRNA相对含量实验结果
化学发光法
NGAL ?
6
例三：
Northern blotting 检测缺 氧复氧条件下心 肌细胞EGR1 基 因转录mRNA 实 验结果
同位素法 EGR1 ?
核酸实验研究技术进展－ 1
7
核酸实验研究技术进展－ 1
确保杂交法实验成功的八个关键点： ? 关键点1：确保实验方案设计合理。 ? 关键点2：确保探针的特异性充分。 ? 关键点3：确保检测的灵敏度足够高。 ? 关键点4：确保样本质量合格。 ? 关键点5：确保实验试剂质量合格。 ? 关键点6：确保实验过程规范。 ? 关键点7：对于编码序列的cDNA，要确保没有RNA的干扰。 ? 关键点8：几种杂交法，或杂交法与其它方法联合使用，相互印证，
? 缺点：? Dot blotting：由于在同一斑点位置，除了目标核酸分子
外，同时还存在其它的成千上万种不同的核酸分子，而这些核酸
分子有可能会与探针分子部分结合，这会促进探针分子与目标核
酸分子的结合，因此将可能导致阳性结果放大，甚至是假阳性结
果。 ? Northern blotting：对低拷贝mRNA有时检测不出来，容
24
核酸实验研究技术进展－ 1
? 通过 Southern blotting ，结合条带光密度扫描分 析，测定实验标本中目标DNA分子的含量
25
核酸实验研究技术进展－ 1
? 通过 Southern blotting ，结合条带光密度扫描分 析，测定实验标本中目标DNA分子的含量
26
核酸实验研究技术进展－ 1
9
核酸实验研究技术进展－ 1
例子：
RT-PCR检测 SHEEC食管癌 细胞NGAL 基因 转录mRNA实验 结果
SM
NGAL ? 600bp
S: 食管癌细胞SHEEC
M: DNA marker
10
核酸实验研究技术进展－ 1
确保PCR法实验成功的八个关键点： ? 关键点1：确保实验方案设计合理。 ? 关键点2：确保引物的特异性充分。 ? 关键点3：确保样本质量合格。 ? 关键点4：确保实验试剂质量。 ? 关键点5：确保实验过程规范。 ? 关键点6：确保PCR变性、退火和延伸温度适度。 ? 关键点7：对于编码序列cDNA，要确保没有RNA的干扰。 ? 关键点8：几种PCR法，或PCR法与其它方法联合使用，相互印证，
确保实验结果可靠。
8
核酸实验研究技术进展－ 1
2) PCR法：序列已知，同时还要合成一对特异性引物。 ? 优点：? 实验的灵敏度很高，理论上可检测实验生物系统
中所存在的1个拷贝目标核酸分子。? 阴性结果的可信度很 高。 ? 缺点：由于容易存在样本污染情况，与此同时，毕竟在实验 过程中存在着目标核酸分子拷贝数人为放大这样一个事实， 因此，其阳性结果的可信度不如Northern boltting 或 Southern boltting。
40
核酸实验研究技术进展－ 1
TaqMan Probes的优点： ? 定量关系准确。随着扩增循环数增加，TaqMan探针释
放出来的荧光基团成倍增加，荧光强度与扩增产物的 数量呈正比关系。 ? TaqMan探针特别适合于病毒定量、基因转录水平定量、 癌细胞基因微突变检测等。 ? 敏感性高。 ? 特异性高。 TaqMan Probes的缺点： ? 只适合于一个特定目标的检测。
27
核酸实验研究技术进展－ 1
原理： ? 以目标基因DNA为模板，利用32P-（放射法）或生物素（非放
射法）作为标记信号，体外转录合成反义RNA探针。 ? 将过量的反义RNA探针与样品总RNA杂交，然后进行核糖核酸
酶处理。未与探针杂交的单链RNA和过量的游离探针被降解， 而目标RNA则因与探针结合形成双链而被‘保护'。 ? 杂交双链进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，用放射自显影或化学发 光等方法确定目标RNA的量。
核酸实验研究技术进展－ 1
生物系统中mRNA或DNA等目标核酸分子的分析鉴定
必须回答如下三个基本问题： ? 目标核酸分子是否存在于实验标本中。 ? 实验标本中目标核酸分子的含量是多少。 ? 实验标本中目标核酸分子的序列如何；以及与其他实验标本
中的情况比较，目标核酸分子的序列是否有变化。
1
核酸实验研究技术进展－ 1
17
核酸实验研究技术进展－ 1
例子：cDNA microarray （反向 Dot blotting） 检测 SHEEC食管癌细胞与永生化食管上皮细胞SHEE中 NGAL基因转录mRNA相对含量实验结果
A 永生化食管 上皮细胞
SHEE
判断标准： B/A ? 2或 ? 0.5为显著性 差异表达
实际情况： B/A＝3.53
证明目标核酸分子是否存在于实验标本中的基本实验方法： 1）杂交法，2）PCR法，3）测序法。
2
核酸实验研究技术进展－ 1
1) 杂交法：序列已知，同时还要合成一个标记了的特异性探针。 ? Dot blotting：不经过电泳，直接把检测样本点在一个适宜载体
上，针对目标DNA分子或RNA分子进行杂交检测。 ? Southern blotting：在电泳后，针对目标DNA分子的杂交检测。 ? Northern blotting：在电泳后，针对目标RNA分子的杂交检测。 ? 目标DNA分子原位杂交检测。 ? 目标RNA分子原位杂交检测。
? 起始模板浓度的对数与Ct呈 线性关系，根据样品的Ct值 就可计算出样品中所含的初 始模板数。
核酸实验研究技术进展－ 1
3.00
ห้องสมุดไป่ตู้
2.50
2.00
n
R ¤ |
1.50
1.00
104 103 102 Threshold
0.50
0.00 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 Cycle
易导致假阴性结果。
4
例一： cDNA microarray 检测SHEEC食管 癌细胞NGAL 基因 mRNA转录实验 结果
反向 Dot blotting
核酸实验研究技术进展－ 1
5
例二：
Northern blotting检测 SHEEC食管癌 细胞NGAL 基因 转录mRNA实验 结果
核酸实验研究技术进展－ 1
12
核酸实验研究技术进展－ 1
目标片段边缘序列的测定结果有时不准确例子
13
核酸实验研究技术进展－ 1
Poly A tail
14
核酸实验研究技术进展－ 1
15
测定实验标本中目标核酸分子的含量
核酸实验研究技术进展－ 1
16
核酸实验研究技术进展－ 1
? 通过 Dot blotting，结合斑点光密度扫描分析， 测定实验标本中目标mRNA分子、目标cDNA分子或 目标DNA分子的含量
41
分子信标 (发夹型杂交探针)
环（15-30bp）
核酸实验研究技术进展－ 1
环与目标序列互补
FAM
荧光基团
Texas Red
茎(5-7bp)
茎由互补配对的序 列组成
淬灭剂
42
分子信标工作原理
光 荧光基团
环
茎 淬灭剂
＋
光
发出荧光
核酸实验研究技术进展－ 1
单链DNA 模板
探针与DNA模板杂交
43
核酸实验研究技术进展－ 1
22
核酸实验研究技术进展－ 1
例一：Northern blotting 检测SHEEC食管癌细胞与永生化食管上皮 细胞SHEE中 NGAL 基因转录mRNA相对含量实验结果（化学发光）
NGAL ?
AB
AB
500 400 300 200 100 -
AB
GAPDH ?
AB
100 80 60 40 20 -
确保实验结果可靠。
11
核酸实验研究技术进展－ 1
3) 测序法：通过电泳等手段已知实验生物系统中目标核酸的大 致大小，而且是对照生物系统中不存在，或者两者相比在含 量上可能有显著差别，然而序列未知。
? 优点：? 可信度最高。? 对于解析鉴定未知核酸分子序列片 段是必需的手段。
? 缺点：目标片段边缘序列的测定结果有时不准确，在读原初 测序图时要格外小心。
A: 食管癌细胞SHEEC B: 永生化食管上皮细胞SHEE
23
核酸实验研究技术进展－ 1
例二：Northern blotting 检测缺氧复氧条件下心肌细胞EGR1 基 因转录mRNA 相对含量实验结果(同位素标记法)
1 2 34 5 1 2345
EGR1 ?
? -Actin ?
1 正常 2 缺氧复氧 3 缺氧复氧＋溶剂对照 4 缺氧复氧＋F2 5 缺氧复氧＋钙离子拮抗剂
淬灭剂
TAMRA DABCYL
39
TaqMan Probes工作原理
荧光基团
淬灭剂 游离的探针
核酸实验研究技术进展－ 1
光
能量转移
另一波长的荧光
Taq
探针与目标序列配对 ，荧光基团与荧光淬灭
剂相邻，不发生特异荧光
光
发出特异荧光
延伸时，Taq酶水解探针，荧光基团与荧
Taq
光淬灭剂分离，发出特异荧光。
增反应中每一次循环的产物进行适时跟踪定量分析
31
real time PCR 的扩增曲线
核酸实验研究技术进展－ 1
32
核酸实验研究技术进展－ 1
PE公司在同一台PCR仪上对相同模板进行96次扩增的扩增曲线图
Ct值极具重现性
33
Ct与初始模板的关系
? 固定循环数后，荧光信号值 与模板数成正比
? 固定荧光信号值后，循环数 与初始模板数成反比。初始 模板数越多, 荧光信号达到 阈值时所需要的循环数(Ct 值)越少
28
核酸实验研究技术进展－ 1
29
核酸实验研究技术进展－ 1
适时荧光定量 PCR Real time fluorescent quantitation PCR
30
核酸实验研究技术进展－ 1
适时荧光定量PCR与常规PCR的本质区别 ? 常规PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行定性定量或半定
量分析 ? 适时荧光定量PCR技术：通过一个特殊的荧光探针，对PCR扩
未结合的SYBR green I
37
SYBR Green I的优点 ? 价格相对便宜 ? 使用简便 ? 可以用于不同的模板 ? 灵敏度很高 SYBR Green I的缺点 ? 特异性较差
核酸实验研究技术进展－ 1
38
TaqMan Probes
荧光素
FAM
TET
JOE
HEX
与目标序列互补
VIC
核酸实验研究技术进展－ 1
ABM
ABM
NGAL ? 600bp
GAPDH ? 226bp
A: 永生化食管上皮细胞SHEE B: 食管癌细胞SHEEC
M: DNA marker
20
两个问题： 反转录PCR实验是否需要探针 ？ 反转录PCR的特异性如何保证 ？
核酸实验研究技术进展－ 1
21
核酸实验研究技术进展－ 1
? 通过 Northern blotting，结合条带光密度扫描分 析，测定实验标本中目标mRNA分子的含量
34
常用的定量PCR荧光探针 ? SYBR Green I ? Taqman水解探针 ? 分子信标
核酸实验研究技术进展－ 1
35
核酸实验研究技术进展－ 1
SYBR Green I ? 结合到双链DNA的小沟部位 ? 只有和双链DNA结合后才发荧光
36
SYBR Green I 工作原理
核酸实验研究技术进展－ 1
核糖核酸酶保护分析 Ribonuclease Protection Assay (RPA) ? 核糖核酸酶保护分析（Ribonuclease Protection Assay，RPA）
是一种 较好的mRNA定量检测技术。 ? RPA的各项实验指标均优于Northern Blotting。 ? 运用RPA可实现对目标RNA分子的高通量定量检测。
分子信标优点： ? 分子信标能特异性地检测目标DNA ? 分子信标可用于单核苷酸多态性的检测 ? 特别适用于检测点突变
分子信标的缺点 ? 只能用于一个特定的目标 ? 设计困难 ? 价格较高
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ABI Prism 7700
核酸实验研究技术进展－ 1
核酸实验研究技术进展－ 1
杂交法的优点与缺点：
? 优点：? Dot blotting：简单实用，适于进行大样本数同时检测。
? Northern blotting：如果检测结果阳性，其可信度要远远高于
RT-PCR，因此被誉为评价基因转录的Golden Marker。
?
Southern blotting：对DNA病毒类病原体等的检测实用性很强。
B 食管癌细胞
SHEEC
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核酸实验研究技术进展－ 1
? 通过 RT-PCR，结合条带光密度扫描分析，测定实验 标本中目标mRNA分子或目标cDNA分子的含量
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核酸实验研究技术进展－ 1
例子：RT-PCR 检测SHEEC食管癌细胞与永生化食管上皮 细胞SHEE中 NGAL基因转录mRNA相对含量实验结果
化学发光法
NGAL ?
6
例三：
Northern blotting 检测缺 氧复氧条件下心 肌细胞EGR1 基 因转录mRNA 实 验结果
同位素法 EGR1 ?
核酸实验研究技术进展－ 1
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核酸实验研究技术进展－ 1
确保杂交法实验成功的八个关键点： ? 关键点1：确保实验方案设计合理。 ? 关键点2：确保探针的特异性充分。 ? 关键点3：确保检测的灵敏度足够高。 ? 关键点4：确保样本质量合格。 ? 关键点5：确保实验试剂质量合格。 ? 关键点6：确保实验过程规范。 ? 关键点7：对于编码序列的cDNA，要确保没有RNA的干扰。 ? 关键点8：几种杂交法，或杂交法与其它方法联合使用，相互印证，
? 缺点：? Dot blotting：由于在同一斑点位置，除了目标核酸分子
外，同时还存在其它的成千上万种不同的核酸分子，而这些核酸
分子有可能会与探针分子部分结合，这会促进探针分子与目标核
酸分子的结合，因此将可能导致阳性结果放大，甚至是假阳性结
果。 ? Northern blotting：对低拷贝mRNA有时检测不出来，容
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核酸实验研究技术进展－ 1
? 通过 Southern blotting ，结合条带光密度扫描分 析，测定实验标本中目标DNA分子的含量
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核酸实验研究技术进展－ 1
? 通过 Southern blotting ，结合条带光密度扫描分 析，测定实验标本中目标DNA分子的含量
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核酸实验研究技术进展－ 1
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核酸实验研究技术进展－ 1
例子：
RT-PCR检测 SHEEC食管癌 细胞NGAL 基因 转录mRNA实验 结果
SM
NGAL ? 600bp
S: 食管癌细胞SHEEC
M: DNA marker
10
核酸实验研究技术进展－ 1
确保PCR法实验成功的八个关键点： ? 关键点1：确保实验方案设计合理。 ? 关键点2：确保引物的特异性充分。 ? 关键点3：确保样本质量合格。 ? 关键点4：确保实验试剂质量。 ? 关键点5：确保实验过程规范。 ? 关键点6：确保PCR变性、退火和延伸温度适度。 ? 关键点7：对于编码序列cDNA，要确保没有RNA的干扰。 ? 关键点8：几种PCR法，或PCR法与其它方法联合使用，相互印证，
确保实验结果可靠。
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核酸实验研究技术进展－ 1
2) PCR法：序列已知，同时还要合成一对特异性引物。 ? 优点：? 实验的灵敏度很高，理论上可检测实验生物系统
中所存在的1个拷贝目标核酸分子。? 阴性结果的可信度很 高。 ? 缺点：由于容易存在样本污染情况，与此同时，毕竟在实验 过程中存在着目标核酸分子拷贝数人为放大这样一个事实， 因此，其阳性结果的可信度不如Northern boltting 或 Southern boltting。
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核酸实验研究技术进展－ 1
TaqMan Probes的优点： ? 定量关系准确。随着扩增循环数增加，TaqMan探针释
放出来的荧光基团成倍增加，荧光强度与扩增产物的 数量呈正比关系。 ? TaqMan探针特别适合于病毒定量、基因转录水平定量、 癌细胞基因微突变检测等。 ? 敏感性高。 ? 特异性高。 TaqMan Probes的缺点： ? 只适合于一个特定目标的检测。
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核酸实验研究技术进展－ 1
原理： ? 以目标基因DNA为模板，利用32P-（放射法）或生物素（非放
射法）作为标记信号，体外转录合成反义RNA探针。 ? 将过量的反义RNA探针与样品总RNA杂交，然后进行核糖核酸
酶处理。未与探针杂交的单链RNA和过量的游离探针被降解， 而目标RNA则因与探针结合形成双链而被‘保护'。 ? 杂交双链进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，用放射自显影或化学发 光等方法确定目标RNA的量。
核酸实验研究技术进展－ 1
生物系统中mRNA或DNA等目标核酸分子的分析鉴定
必须回答如下三个基本问题： ? 目标核酸分子是否存在于实验标本中。 ? 实验标本中目标核酸分子的含量是多少。 ? 实验标本中目标核酸分子的序列如何；以及与其他实验标本
中的情况比较，目标核酸分子的序列是否有变化。
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核酸实验研究技术进展－ 1
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核酸实验研究技术进展－ 1
例子：cDNA microarray （反向 Dot blotting） 检测 SHEEC食管癌细胞与永生化食管上皮细胞SHEE中 NGAL基因转录mRNA相对含量实验结果
A 永生化食管 上皮细胞
SHEE
判断标准： B/A ? 2或 ? 0.5为显著性 差异表达
实际情况： B/A＝3.53
证明目标核酸分子是否存在于实验标本中的基本实验方法： 1）杂交法，2）PCR法，3）测序法。
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核酸实验研究技术进展－ 1
1) 杂交法：序列已知，同时还要合成一个标记了的特异性探针。 ? Dot blotting：不经过电泳，直接把检测样本点在一个适宜载体
上，针对目标DNA分子或RNA分子进行杂交检测。 ? Southern blotting：在电泳后，针对目标DNA分子的杂交检测。 ? Northern blotting：在电泳后，针对目标RNA分子的杂交检测。 ? 目标DNA分子原位杂交检测。 ? 目标RNA分子原位杂交检测。
? 起始模板浓度的对数与Ct呈 线性关系，根据样品的Ct值 就可计算出样品中所含的初 始模板数。
核酸实验研究技术进展－ 1
3.00
ห้องสมุดไป่ตู้
2.50
2.00
n
R ¤ |
1.50
1.00
104 103 102 Threshold
0.50
0.00 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 Cycle
易导致假阴性结果。
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例一： cDNA microarray 检测SHEEC食管 癌细胞NGAL 基因 mRNA转录实验 结果
反向 Dot blotting
核酸实验研究技术进展－ 1
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例二：
Northern blotting检测 SHEEC食管癌 细胞NGAL 基因 转录mRNA实验 结果
核酸实验研究技术进展－ 1
12
核酸实验研究技术进展－ 1
目标片段边缘序列的测定结果有时不准确例子
13
核酸实验研究技术进展－ 1
Poly A tail
14
核酸实验研究技术进展－ 1
15
测定实验标本中目标核酸分子的含量
核酸实验研究技术进展－ 1
16
核酸实验研究技术进展－ 1
? 通过 Dot blotting，结合斑点光密度扫描分析， 测定实验标本中目标mRNA分子、目标cDNA分子或 目标DNA分子的含量
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分子信标 (发夹型杂交探针)
环（15-30bp）
核酸实验研究技术进展－ 1
环与目标序列互补
FAM
荧光基团
Texas Red
茎(5-7bp)
茎由互补配对的序 列组成
淬灭剂
42
分子信标工作原理
光 荧光基团
环
茎 淬灭剂
＋
光
发出荧光
核酸实验研究技术进展－ 1
单链DNA 模板
探针与DNA模板杂交
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核酸实验研究技术进展－ 1
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核酸实验研究技术进展－ 1
例一：Northern blotting 检测SHEEC食管癌细胞与永生化食管上皮 细胞SHEE中 NGAL 基因转录mRNA相对含量实验结果（化学发光）
NGAL ?
AB
AB
500 400 300 200 100 -
AB
GAPDH ?
AB
100 80 60 40 20 -
确保实验结果可靠。
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核酸实验研究技术进展－ 1
3) 测序法：通过电泳等手段已知实验生物系统中目标核酸的大 致大小，而且是对照生物系统中不存在，或者两者相比在含 量上可能有显著差别，然而序列未知。
? 优点：? 可信度最高。? 对于解析鉴定未知核酸分子序列片 段是必需的手段。
? 缺点：目标片段边缘序列的测定结果有时不准确，在读原初 测序图时要格外小心。
A: 食管癌细胞SHEEC B: 永生化食管上皮细胞SHEE
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核酸实验研究技术进展－ 1
例二：Northern blotting 检测缺氧复氧条件下心肌细胞EGR1 基 因转录mRNA 相对含量实验结果(同位素标记法)
1 2 34 5 1 2345
EGR1 ?
? -Actin ?
1 正常 2 缺氧复氧 3 缺氧复氧＋溶剂对照 4 缺氧复氧＋F2 5 缺氧复氧＋钙离子拮抗剂
淬灭剂
TAMRA DABCYL
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TaqMan Probes工作原理
荧光基团
淬灭剂 游离的探针
核酸实验研究技术进展－ 1
光
能量转移
另一波长的荧光
Taq
探针与目标序列配对 ，荧光基团与荧光淬灭
剂相邻，不发生特异荧光
光
发出特异荧光
延伸时，Taq酶水解探针，荧光基团与荧
Taq
光淬灭剂分离，发出特异荧光。
增反应中每一次循环的产物进行适时跟踪定量分析
31
real time PCR 的扩增曲线
核酸实验研究技术进展－ 1
32
核酸实验研究技术进展－ 1
PE公司在同一台PCR仪上对相同模板进行96次扩增的扩增曲线图
Ct值极具重现性
33
Ct与初始模板的关系
? 固定循环数后，荧光信号值 与模板数成正比
? 固定荧光信号值后，循环数 与初始模板数成反比。初始 模板数越多, 荧光信号达到 阈值时所需要的循环数(Ct 值)越少
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核酸实验研究技术进展－ 1
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核酸实验研究技术进展－ 1
适时荧光定量 PCR Real time fluorescent quantitation PCR
30
核酸实验研究技术进展－ 1
适时荧光定量PCR与常规PCR的本质区别 ? 常规PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行定性定量或半定
量分析 ? 适时荧光定量PCR技术：通过一个特殊的荧光探针，对PCR扩
未结合的SYBR green I
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SYBR Green I的优点 ? 价格相对便宜 ? 使用简便 ? 可以用于不同的模板 ? 灵敏度很高 SYBR Green I的缺点 ? 特异性较差
核酸实验研究技术进展－ 1
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TaqMan Probes
荧光素
FAM
TET
JOE
HEX
与目标序列互补
VIC
核酸实验研究技术进展－ 1
ABM
ABM
NGAL ? 600bp
GAPDH ? 226bp
A: 永生化食管上皮细胞SHEE B: 食管癌细胞SHEEC
M: DNA marker
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两个问题： 反转录PCR实验是否需要探针 ？ 反转录PCR的特异性如何保证 ？
核酸实验研究技术进展－ 1
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核酸实验研究技术进展－ 1
? 通过 Northern blotting，结合条带光密度扫描分 析，测定实验标本中目标mRNA分子的含量
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常用的定量PCR荧光探针 ? SYBR Green I ? Taqman水解探针 ? 分子信标
核酸实验研究技术进展－ 1
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核酸实验研究技术进展－ 1
SYBR Green I ? 结合到双链DNA的小沟部位 ? 只有和双链DNA结合后才发荧光
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SYBR Green I 工作原理
核酸实验研究技术进展－ 1
核糖核酸酶保护分析 Ribonuclease Protection Assay (RPA) ? 核糖核酸酶保护分析（Ribonuclease Protection Assay，RPA）
是一种 较好的mRNA定量检测技术。 ? RPA的各项实验指标均优于Northern Blotting。 ? 运用RPA可实现对目标RNA分子的高通量定量检测。
分子信标优点： ? 分子信标能特异性地检测目标DNA ? 分子信标可用于单核苷酸多态性的检测 ? 特别适用于检测点突变
分子信标的缺点 ? 只能用于一个特定的目标 ? 设计困难 ? 价格较高
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ABI Prism 7700
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