中药指纹图谱建立的原则和步骤修订版

中药指纹图谱建立的原

则和步骤

Company number：【WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998】

（一）建立指纹图谱的一般原则

中药指纹图谱的建立，应以系统的化学成分研究和药理学研究为依托，体现系统性、特征性和稳定性三个基本原则。唯此，才能保证指纹图谱的标准化、规范化、客观化，从而便于推广和应用。

1.系统性是指指纹图谱中反映的化学成分应包括该中药有效部位所含大部分成分，或指标性成分的全部，如中药两头尖中抗肿瘤的有效成分为皂苷类化合物，则其指纹图谱应尽可能地反映其中的皂苷类成分；银杏叶的有效成分是黄酮类和银杏内酯类，则其指纹图谱可采用两种方法，针对这两类成分分别分析，达到系统全面的目的。

2.特征性是指指纹图谱中反映的化学信息（如保留时间）应具有较强的选择性，这些信息的综合结果，将能特征性地区分中药的真伪与优劣，成为中药自身的“化学条码”。如北五味子的HPLC指纹图谱和TLC指纹图谱，不仅包括多种的五味子木脂素类成分，而且具有许多未知类成分，这些成分的峰位顺序、比值在一定范围内是固定的，并且随药材品种不同而产生差异，依此可以很好地区别其来源、产地，判别药材的真伪优劣。

3.稳定性是指所建立的指纹图谱在规定的方法、条件下的耐用程度，即不同操作者、不同实验室所重复做出的指纹图谱应在所允许的误差范围内，以体现其通用性和实用性。因而要求包括样品制

备、分析方法、实验过程、数据采集、处理、分析等全过程都要规范化操作，同时，还应建立相应的评价机构，对其进行客观评价。

（二）建立指纹图谱的一般步骤

1.方案设计与思路

（1）研究对象的确定

在调研有关文献、新药申报资料(质量部分和工艺部分)及其它研究结果的基础上，尽可能的详尽地了解药材、中间体及成品中所含成分的种类及其理化性质，综合分析后找出成品中的药效成分或有效成分，作为成品和中间体指纹图谱的研究对象，即分析检测目标。例如，黄芪含黄酮、皂苷及多糖三类有效组分，黄芪多糖注射液及其中间体的指纹图谱则以多糖为研究对象，黄芪原药材的指纹图谱应把黄酮、皂苷及多糖作为研究对象。

复方注射剂应根据君臣佐使的原则，以君药、臣药中的有效成分作为指纹图谱的研究对象，佐使药中的成分可采用其它指纹图谱方法进行辅助、补充研究。

（2）研究方法的选择

研究方法应根据研究对象的物理化学性质来选择。大多数化合物可采用HPLC。例如黄芪中黄酮、皂苷、多糖等。挥发性成分应采用GC。例如鱼腥草中的鱼腥草素、土木香中的土木香内酯、异土木香

内酯和二氢土木香内酯等。某些有机酸经甲酯化后亦可用GC分析。采用上述方法难以分离检测的成分，可考虑使用TLC和CE。一个中药制剂的指纹图谱可以同时采用多种方法进行研究。选择方法时，还需考虑药品检验系统复核时的设备、技术等因素。

（3）研究内容

根据国家食品药品监督管理局《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》(暂行)的规定，主要研究内容有原药材、中间体、注射剂的指纹图谱，涉及样品名称、来源、制备、测定方法、指纹图谱及技术参数等。

2.样品的收集

这是最初也是最关键的步骤。至少要收集10个批次样品。注意样品的代表性。

(1)切不可将同一批次样品分散成数个批次，充当样品。

(2)原药材尽可能固定产地(GAP基地药材，地道药材)、采收期和炮制方法。对光线稳定，疗效稳定，无临床不良反应的药材批次应重点选择。

(3)中间体、注射剂样品的收集应重点选择工艺稳定、疗效稳定、无不良反应的批次。

(4)留样应不少于实验用量的3倍。

3.供试品溶液的制备(样品的预处理)

（1）药材供试液的制备

根据所含成分的理化性质，通过溶剂提取、液液萃取、沉淀、吸附等方法，分离富集样品。例如，黄芪中黄酮类成分通过碱的萃取、皂苷类通过大孔吸附树脂吸附；苦参中总生物碱通过阳离子交换树脂分离；挥发性样品常用水蒸气蒸馏法制备。

样品富集后，还需通过氧化铝预柱、C18预柱、硅胶预柱、聚酰胺预柱等，除去色素等杂质，最后通过微孔滤膜，供HPLC测试。

（2）中间体供试液制备

可针对有效成分处理，并参照原药材的制备方法。

（3）注射剂供试液制备

液体注射剂一般无需特殊处理，可直接分析检测。

4.参照物的选择

一般选取样品中容易获得且含量较高的一个主要活性成分或指标成分作为参照物（S）。参照物主要用于指纹图谱技术参数的确定，如特征峰(共有峰)的相对保留时间，峰面积比值等。并有助于图谱的稳定性、重现性的考查。例如三七药材的指纹图谱中以三七皂苷R1为参照物。

由于指纹图谱比较复杂，内标物不易选择、插入，故一般不以内标物做为参照物。

5.实验方法和条件的选择

其目的是通过比较实验，从中选取相对简便易行的方法和条件，获取足以代表品种特征的指纹图谱，以满足指纹图谱的专属性、重现性和普遍适用性的要求。方法和条件须经过严格的方法学考察。例如稳定性试验，精密度试验，重现性试验等。

注意事项：供试液的制备和色谱分析时均须定量操作，以保证图谱在整体特征上进行半定量(差异程度或相似程度)的比较。

指纹图谱分析不同于含量测定，提高其分离度应以不牺牲色谱的整体特征为前提，故不应孤立地苛求分离度达到含量测定的要求。

采用HPLC和GC制定指纹图谱，记录时间一般为1小时。(实测2小时)

6.对照指纹图谱及其技术参数的建立

(1)测得的大量色谱数据需经分析和数据处理，才能获得对照指纹图谱(拟合指纹图谱)及其技术参数，以此作为药品指纹图谱检验的依据。

(2)技术参数主要包括总峰面积、共有峰序号、参照峰(S)、共有峰相对保留时间(RRT)，共有峰峰面积比(RA)，非共峰面积等。RRT=RTi/RTs RA=Ai/As

共有峰亦称特征峰（包括参照峰），系指所有被检批次中均含有的相同色谱峰，主要来源于样品中主要有效成分或指标成分。共有峰的化学归属，可采用对照品加入法或HPLC/DAD/MS/MS联用技术进行鉴别，后者可在无对照品的情况下使用。

例复方丹参注射液指纹图谱应有9个特征峰

相对保留时间／分钟(峰序号)：

0．145(1)0．186(2)0．298(3)0．378(4)0．425(5)0．499(6)0．59 4(7)1．000(s原儿茶醛)1．145(8)

峰面积比值：0．059(1)0．064(2)0．036(3)±30％(4)

0．054(5)0．297±25％(6)0．055(7)1．000(s原儿茶醛)0．040(8)

7.药材、中间体和注射剂指纹图谱的相关性

注射剂中各特征峰均可在药材及中间体指纹图谱中得到追踪，中间体与注射剂的指纹图谱应非常接近，药材图谱中的色谱峰应比