生物质谱

基质(matrix)混合，此样品混合物随即滴于一平板
或载玻片上进行挥发，样品混合物残余水份和溶剂
的挥发使样品整合于格状晶体中，样品然后置于激
光离子发生器(lasersource)。激光作用于样品混合
物，使化学基质吸收光子而被激活。此激活产生的
能量作用于生物大分子（多肽），使之由固态ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ品
混合物变成气态。
当静电排斥力等于液滴的表面张力时，液滴便发生崩
解(库仑爆炸)，形成更小的液滴。如此形成的小液滴
以类似的方式继续崩解，于是，液滴中的溶剂迅速蒸
干，产生多电荷正离子，在质谱仪内被分析纪录。
Charged Droplets
+ + + + + - + - Evaporation
+
+ -+ ++
+ -+ ++
Ionization method
Tolerance for buffers, salts, and detergents
MW range
Mass assignment accuracy
Compatible with on-line LC/CE-MS
ESI
Low tolerance (≤20 mM) for nonvolatile buffers, alkali metal salts, detergents; online LC-MS used for contaminant removal
• 20世纪60年代 质谱技术在有机化合物小分子的结构测定中得 到应用，而对于大分子(分子量超过1000Da)、极性 分子和难气化的分子，则显得无能为力。
70年代
Macfarlane等人发明了一种被称作等离子体解吸
(Plasma desorption, PD)的离子化技术，使得质谱
测定分子量范围扩大到几千道尔顿。
density on each droplet increases. When this surface charge density reaches
the Rayleigh limit, the Coulombic repulsion is approximately equal to the surface tension, and the droplet explodes into smaller droplets.
instrumentation.
The electric field at the needle tip disperses the liquid by Coulombic forces into a fine spray of charged droplets. These droplets migrate in the field
第七章 生物质谱
第一节
生物质谱发展过程
质谱分析法(mass spectrometry)
将化合物形成离子和碎片离子，按其质荷比(Ｍ/
Ｚ值)的不同进行分离测定，来进行成分和结构分析
的一种分析方法。
用于分析生物大分子的质谱技术成为生物质谱。
Conventional mass spectrometers used for low volatile molecular weight samples that are introduced in the vapor phase are called singlefocusing mass spectrometers.
导致了新的软件和检测器的发展。
电喷雾离子化技术（electrospray ionization，ESI）
原理：在一个金属喷嘴的尖上加有2.5～6 kV高电压， 经强电场作用，样品溶液从针尖小孔喷出，成为一个 个带正电的液滴。在迎面吹来的热氮气流的作用下，
液滴表面溶剂蒸发，液滴变小，液滴的电荷密度骤增。
≥350 kDA
±0.01%-0.05% to 25 kDA
±0.05%-0.3% to 300 kDA
No
生物质谱两种主要电离方法比较
2.3 质量分析器
• 质量分析器能将带电离子根据其质荷比加以分离，
• 质量分析器的主要技术参数是：
质荷比的范围（质量范围）和分辨率。 • 质量分析器类型： 扇形磁分析器，四极杆分析器 离子阱分析器，飞行时间分析器 傅里叶变换分析器
toward the glass capillary inlet.
A flow of drying gas (typically N2 at 100 mL/s) evaporates the solvent from the droplets, so that their diameter decreases, and the surface charge
• 优点：解决了极性大、热不稳定的蛋白质与多肽 分子的离子化和大分子质量、一级结构和共价修 饰位点的测定问题。 • 缺点：样品中的盐类对样品结果影响很大，而且 单个分子带电荷不同可形成多种离子分子峰（重 叠峰），所以对混合物的图谱解析比较困难。
基质辅助激光解析电离(MALDI)
• 待检样品与含有在特定波长下吸光的发光团的化学
relative to the chamber walls and the cylindrical cathode surrounding it.
The liquid sample enters at a rate of 1–20 μL/ min through the needle, but lower flow rates (10–100 nL/min) are becoming more common in modern
≤150 kDA
±0.005%-0.01% to 50 kDA ±0.02%-0.03% to 150 kDA Yes
MALDI
High tolerance (≥50 mM) for alkali metal salts, phosphate, urea, etc.; tolerant of some nonionic detergents; intolerant of SDS
三级四极杆质量分析器
离子阱分析器
• 由两个端盖电极和位于它们之间的
类似四极杆的环电极构成。端盖电
极施加直流电压或接地，环电极施 加射频电压（RF），通过施加适当 电压就可以形成一个势能阱（离子 阱）。根据RF电压的大小，离子阱 就可捕获某一质量范围的离子。离 子阱可以储存离子，待离子累积到 一定数量后，升高环电极上的RF电 压，离子按质量从高到低的次序依 次离开离子阱，被电子倍增监测器 检测。
80年代初
Barber等人又引入了快原子轰击(fast atom
bombardment，简称FAB)电离技术，并成功地测定了
一个26肽的结构，从而使得质谱技术应用于蛋白质和
肽的结构测定这一设想变为现实。
• 80年代末
John Fenn 发明的电喷雾电离(electrospray ionization，ESI)和Hillenkamp等人发明的基质辅助激 光解吸电离(matrix assisted laser desorption
等形式进行分离；
• 检测器——用来接受、检测和记录被分离后的离子信号。
2.2 离子源
• 离子源的功能是将进样系统引入的气态样品分子 转化成离子。由于离子化所需要的能量随分子不 同差异很大，因此，对于不同的分子应选择不同 的离解方法。 • 给样品较大能量的电离方法为硬电离方法，而给 样品较小能量的电离方法为软电离方法，后一种 方法适用于不稳定或易电离的样品。
四极杆分析器
• 离子束在与棒状电极平行的轴上聚焦，一个直流
固定电压（DC）和一个射频电压（RF）作用在棒
状电极上，两对电极之间的电位相反。对于给定
的直流和射频电压，特定质荷比的离子在轴向稳 定运动，其他质荷比的离子则与电极碰撞湮灭。
• The quadrupole analyzer (or mass filter) is formed by four metal rods (usually high-grade steel), positioned precisely in each corner of an imaginary square. • Between diagonally opposed rods a direct current (dc) voltage is applied, with a superimposed radio frequency (rf) alternating field. Both dc and rf voltages are scanned. Ion trajectories across the quadrupole are complicated. Under given conditions of dc and rf, ions of only one m/z value will reach the detector. All other m/z ions possess unstable paths that impact on the rods.
ionization, MALDI)。使质谱分析生物大分子成为可能。
第二节 生物质谱仪及其相关技术
2.1 质谱仪组成
质谱仪由以下四部分组成：
• 进样系统——按电离方式的需要，将样品送入离子源的适当部
位；
• 离子源——用来使样品分子电离生成离子，并使生成的离子会
聚成有一定能量和几何形状的离子束； • 质量分析器——利用电磁场（包括磁场、磁场和电场的组合、 高频电场和高频脉冲电场等）的作用将来自离子源的离子束中 不同质荷比的离子按空间位置，时间先后或运动轨道稳定与否
由于多肽倾向于吸收单一光子，故多肽离子带
单一电荷.这些形成的多肽离子直接进入飞行时间
质量分析仪(TOF mass analyzer)。飞行时间质量
分析仪用于测量多肽离子由分析仪的一端飞抵另一
端探测器所需要的时间。TOF质量分析器被认为是
与MALDI的最佳搭配。
MALDI-TOF-MS
MALDI-MS特点
这种分子离子特点是带多个电荷。这些离子的形成是
靠吸附上或失去若干个质子而形成，所以在正离子或负离
子谱上会观察到(M+nH)n+或(M-nH)n-的峰。对于生物大分
子，在ESI谱上出来的往往是一组带不同电荷的分子离子 峰，根据仪器上记录下来的每个峰的质荷比及电荷数即可 算出分子量值。
ESI-MS优缺点
2.2.1 离子源类型
• 电子轰击电离(Electron Impact Ionization，EI)
• 化学离子化(Chemical Ionization，CI)
• 场电离，场解吸(Field Ionization FD，Field Desorption FD) • 快原子轰击(Fast Atom Bombardment，FAB) • 电喷雾电离(Electrospray Ionization，ESI) • 基质辅助激光解析电离(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization，MALDI)
• 大气压化学电离 (Atmospheric Pressure Chemical
Ionization，APCI)
常用的适用于生物大分子研究的质谱技术方 法包括FAB-MS、ESI-MS、MALDI-TOF-MS等，而其 中又以ESI-MS和MALDI-TOF-MS应用最为广泛，这 两个新技术明显增加了质谱范围和敏感度，从而
• 对于一些分子量较大或疏水性强的蛋白质，MALDI
比ESI更有效。
• MALDI能有效地分析较复杂的肽混合物或物理化学
性质相差较大的蛋白质混合物。只要能与所选择 的底物形成稳定的分散体系的样品都能用MALDI进 行分析。
• MALDI不受样品所含的添加物、缓冲液或盐的影响，
且灵敏度也比别的离子化方式高。
+
+
+
Rayleigh Limit Reached
+
+ ++ - -- + + -+
--+ + ++
+
+ + + +
+
+ +
+
++ +
准分子离子
+
其他离子
试样离子
ESI-MS
The hollow stainless steel needle is maintained at a few kilovolts (kV)