高效液相色谱的特点与仪器
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第二章 高效液相色谱法
high performance liquid chromatograph
第一节 高效液相色谱的
特点与仪器
feature and instrument of HPLC
一、高效液相色谱仪
instrument of HPLC
二、高效液相色谱法的 特点
feature of HPLC
三、流程及主要部件
2020/10/6
5.应用范围广 制 的品，天分适然H析4HP.P于 物仅分LL分 及C需C析析 各法几载速生 种不分液度物高受钟流快大分样到速分子品几可子化沸十达、合点分1~离物、钟10子。挥。m型原发l/m化则度in合上和，物相热完、对稳成不分定一稳子性个定量限样
大于400 的有机物都可用 HPLC 法分析。
2020/10/6
2020/10/6
二、高压输液泵
1. 高压泵性能
• 有足够的输出压力：压力范围250~400kg/cm2。
• 输出流量恒定：流量精密度应在1%，无脉动。 • 流量范围宽：分析仪器应在0.1 ~10.0ml/min。
制备仪器1~100ml/min。
• 抗溶剂的腐蚀：常用不锈钢和PEEK塑料。
三、进样装置
装入状态
采样环
进色谱柱 泵入溶剂 出口
2020/10/6
进样状态
四、柱高材：效一分般离采柱用不锈钢管和 PEEK 塑料。
柱型及尺寸：一般采用管内径1～6 mm，柱长 5～40 cm直型柱，标准柱型φ3.9 或 4.6mm ，L 15、
较低 。
2020/10/6
三、流程及主要部件
高效液相色谱仪的主要部件： 储液罐、高压输液泵、进样装置、色谱柱、检 测器、记录仪和数据处理装置。 工作流程
2020/10/6
一、储液罐及流动相的脱气
1. 储液罐 ➢ 溶剂在放人储液罐之前必须经过0.45μm滤膜过
滤：除去溶剂中的机械杂质，以防输液管道或进 样阀产生阻塞现象。
2020/10/6
(2) 恒压泵：常用气动泵 根据压力传导原理设计的，即 P1.SA=P2.SB P1 低压，推动大面积 SA，则在小面积 SB 活塞
输出大压力P2 。
特点：压力恒定，无脉动，液腔体积较大，更 换流动相不方便。当泵的负荷阻力小时可提供大的 输出流量，适于匀桨法填装柱子。
2020/10/6
➢ 除去其中溶解气体，防止流动相由柱流至检测器 时，因压力降低而产生气泡，而增加基线噪声。
➢ 使用荧光检测器，溶解在流动相中的氧气，会造 成荧光猝灭。
➢ 还会导致样品中某些组分被氧化或会使柱中固定 相发生降解而改变柱的分离性能。
2020/10/6
常用的脱气方法
➢ 吹氦脱气法，在0.1MPa下，以约60mL/min流 速通入流动相10~15min。此法适用于所有的溶剂 ，脱气效果较好，但价格较贵。
➢ 储液罐的材料应耐腐蚀 ：常用玻璃、氟塑料或 PEEK塑料 ，容积约为0.5~2.0L。
➢ 储液罐放置位置要高于泵体：以保持一定的输液 静压差。
➢ 使用过程储液罐应密闭：防溶剂蒸发引起流动相 组成变化，还可防止空气中O2、CO2重新溶于已 脱气的流动相中。
2020/10/6
2．流动相脱气 流动相在使用前必须进行脱气处理
HPLC的优点
123. 分选检离择测效性灵能 高 敏高 度高
GHCPL分C离广柱效泛效能采高较用，高流，灵动n敏相=度1可0检3以塔测控板器制/米，和，如改HU善PVL分（C离1可0的-9 达 选 g/m到择L性5）×。，10荧3~光3×检1测04器塔（板1/0米-11，g/m可L使）用。较短的柱子。
3．梯度洗脱装置 梯度洗提：在分离过程中按一定的程序连续改
变载液中溶剂的配比和极性。
通过载液极性改变来改变分离因素，改善分离 效果、缩短分析时间、改善峰形，提高分析精度。
➢ 高压梯度（内梯度） 两台高压泵，将两种
不同极性溶剂按一定比例 送入梯度混合室，混合后 进入色谱柱。
2020/10/6
2020/10/6
general process and main assembly of HPLC
2020/10/6
一、液相色谱仪器（ high performance
liquid chromatograph）
2020/10/6
Waters LC 2695
2020/10/6
IC 4500i
2020/10/6
二、高效液相色谱法的特点
百度文库
➢ 低压梯度（外梯度）: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种
不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。
2020/10/6
2020/10/6
三、进样装置
➢ 流路中为高压力工作状态； ➢ 通常使用耐高压的六通阀进样装置；
特点：耐高压，进样的重现性好，易于自动化， 易造成色谱峰柱前扩宽。
2020/10/6
2020/10/6
HPLC的局限性
➢ 分析成本高，宜引起污染。 ➢ 缺少高灵敏度的通用型检测器。 ➢ 不能替代GC完成沸程范围宽的石油产品的分
析。
2020/10/6
➢ 操作较GC复杂。
HPLC与GC比较
气相色谱 只能分析挥发性物质 不能用于热不稳定物质的分析
高效液相色谱 几乎可分析各种物质 可用于热不稳定物质的分析
• 泵死体积要小；以便迅速更换溶剂和梯度洗提。
2020/10/6
2. 高压泵分类： 恒流泵：输出流量恒定，与柱引起阻力无关。 恒压泵：输出压力恒定，与柱引起阻力无关。
(1) 恒流泵：常用往复式柱塞泵和注射泵。
特点：流量恒定，液腔体积小（0.1ml），更换 溶剂和梯度洗提方便，但有脉动，应用广泛。
2020/10/6
毛细管色谱可得到很高的柱效
色谱柱不能很长、柱效不会 很高
有很灵敏检测器和较灵敏的通用检测器 没有较灵敏的通用检测器
流动相为气体，无毒、易于处理
流动相有毒、费用较高
运行和操作容易 仪器制造难度较小
运行和操作较气相难 仪器制造难度较大
实际应用中，凡是能用GC分析的样品一般不
用HPLC，因为GC更快，更灵敏，更方便，且耗费
➢ 加热回流法，此法的脱气效果较好 。 ➢ 抽真空脱气法，用微型真空泵除去溶解气体， 降压至0.05~0.70MPa。 ➢ 超声波脱气法，流动相置放于超声波清洗器中 ，用超声波振荡10~15min。脱气效果最差。 ➢ 在线真空脱气法，真空脱气装置串接到储液系 统中，使流动相进入输液泵前连续真空脱气。此 法脱气效果最好，适于多元溶剂体系 。
high performance liquid chromatograph
第一节 高效液相色谱的
特点与仪器
feature and instrument of HPLC
一、高效液相色谱仪
instrument of HPLC
二、高效液相色谱法的 特点
feature of HPLC
三、流程及主要部件
2020/10/6
5.应用范围广 制 的品，天分适然H析4HP.P于 物仅分LL分 及C需C析析 各法几载速生 种不分液度物高受钟流快大分样到速分子品几可子化沸十达、合点分1~离物、钟10子。挥。m型原发l/m化则度in合上和，物相热完、对稳成不分定一稳子性个定量限样
大于400 的有机物都可用 HPLC 法分析。
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2020/10/6
二、高压输液泵
1. 高压泵性能
• 有足够的输出压力：压力范围250~400kg/cm2。
• 输出流量恒定：流量精密度应在1%，无脉动。 • 流量范围宽：分析仪器应在0.1 ~10.0ml/min。
制备仪器1~100ml/min。
• 抗溶剂的腐蚀：常用不锈钢和PEEK塑料。
三、进样装置
装入状态
采样环
进色谱柱 泵入溶剂 出口
2020/10/6
进样状态
四、柱高材：效一分般离采柱用不锈钢管和 PEEK 塑料。
柱型及尺寸：一般采用管内径1～6 mm，柱长 5～40 cm直型柱，标准柱型φ3.9 或 4.6mm ，L 15、
较低 。
2020/10/6
三、流程及主要部件
高效液相色谱仪的主要部件： 储液罐、高压输液泵、进样装置、色谱柱、检 测器、记录仪和数据处理装置。 工作流程
2020/10/6
一、储液罐及流动相的脱气
1. 储液罐 ➢ 溶剂在放人储液罐之前必须经过0.45μm滤膜过
滤：除去溶剂中的机械杂质，以防输液管道或进 样阀产生阻塞现象。
2020/10/6
(2) 恒压泵：常用气动泵 根据压力传导原理设计的，即 P1.SA=P2.SB P1 低压，推动大面积 SA，则在小面积 SB 活塞
输出大压力P2 。
特点：压力恒定，无脉动，液腔体积较大，更 换流动相不方便。当泵的负荷阻力小时可提供大的 输出流量，适于匀桨法填装柱子。
2020/10/6
➢ 除去其中溶解气体，防止流动相由柱流至检测器 时，因压力降低而产生气泡，而增加基线噪声。
➢ 使用荧光检测器，溶解在流动相中的氧气，会造 成荧光猝灭。
➢ 还会导致样品中某些组分被氧化或会使柱中固定 相发生降解而改变柱的分离性能。
2020/10/6
常用的脱气方法
➢ 吹氦脱气法，在0.1MPa下，以约60mL/min流 速通入流动相10~15min。此法适用于所有的溶剂 ，脱气效果较好，但价格较贵。
➢ 储液罐的材料应耐腐蚀 ：常用玻璃、氟塑料或 PEEK塑料 ，容积约为0.5~2.0L。
➢ 储液罐放置位置要高于泵体：以保持一定的输液 静压差。
➢ 使用过程储液罐应密闭：防溶剂蒸发引起流动相 组成变化，还可防止空气中O2、CO2重新溶于已 脱气的流动相中。
2020/10/6
2．流动相脱气 流动相在使用前必须进行脱气处理
HPLC的优点
123. 分选检离择测效性灵能 高 敏高 度高
GHCPL分C离广柱效泛效能采高较用，高流，灵动n敏相=度1可0检3以塔测控板器制/米，和，如改HU善PVL分（C离1可0的-9 达 选 g/m到择L性5）×。，10荧3~光3×检1测04器塔（板1/0米-11，g/m可L使）用。较短的柱子。
3．梯度洗脱装置 梯度洗提：在分离过程中按一定的程序连续改
变载液中溶剂的配比和极性。
通过载液极性改变来改变分离因素，改善分离 效果、缩短分析时间、改善峰形，提高分析精度。
➢ 高压梯度（内梯度） 两台高压泵，将两种
不同极性溶剂按一定比例 送入梯度混合室，混合后 进入色谱柱。
2020/10/6
2020/10/6
general process and main assembly of HPLC
2020/10/6
一、液相色谱仪器（ high performance
liquid chromatograph）
2020/10/6
Waters LC 2695
2020/10/6
IC 4500i
2020/10/6
二、高效液相色谱法的特点
百度文库
➢ 低压梯度（外梯度）: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种
不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。
2020/10/6
2020/10/6
三、进样装置
➢ 流路中为高压力工作状态； ➢ 通常使用耐高压的六通阀进样装置；
特点：耐高压，进样的重现性好，易于自动化， 易造成色谱峰柱前扩宽。
2020/10/6
2020/10/6
HPLC的局限性
➢ 分析成本高，宜引起污染。 ➢ 缺少高灵敏度的通用型检测器。 ➢ 不能替代GC完成沸程范围宽的石油产品的分
析。
2020/10/6
➢ 操作较GC复杂。
HPLC与GC比较
气相色谱 只能分析挥发性物质 不能用于热不稳定物质的分析
高效液相色谱 几乎可分析各种物质 可用于热不稳定物质的分析
• 泵死体积要小；以便迅速更换溶剂和梯度洗提。
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2. 高压泵分类： 恒流泵：输出流量恒定，与柱引起阻力无关。 恒压泵：输出压力恒定，与柱引起阻力无关。
(1) 恒流泵：常用往复式柱塞泵和注射泵。
特点：流量恒定，液腔体积小（0.1ml），更换 溶剂和梯度洗提方便，但有脉动，应用广泛。
2020/10/6
毛细管色谱可得到很高的柱效
色谱柱不能很长、柱效不会 很高
有很灵敏检测器和较灵敏的通用检测器 没有较灵敏的通用检测器
流动相为气体，无毒、易于处理
流动相有毒、费用较高
运行和操作容易 仪器制造难度较小
运行和操作较气相难 仪器制造难度较大
实际应用中，凡是能用GC分析的样品一般不
用HPLC，因为GC更快，更灵敏，更方便，且耗费
➢ 加热回流法，此法的脱气效果较好 。 ➢ 抽真空脱气法，用微型真空泵除去溶解气体， 降压至0.05~0.70MPa。 ➢ 超声波脱气法，流动相置放于超声波清洗器中 ，用超声波振荡10~15min。脱气效果最差。 ➢ 在线真空脱气法，真空脱气装置串接到储液系 统中，使流动相进入输液泵前连续真空脱气。此 法脱气效果最好，适于多元溶剂体系 。