实验七、血清胆固醇的定量测定(磷硫铁法)

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实验七、血清胆固醇的定量测定(磷硫铁法)
实验目的:
掌握磷硫铁法测定血清胆固醇的原理、方法及临床意义。

实验原理:
总胆固醇的测定有化学比色法(磷硫铁法和邻苯二甲醛法)和酶学方法(试剂盒)两类。

本实验采用磷硫铁法测定血清胆固醇含量。

用无水乙醇提取血清中的胆固醇,再与硫磷铁试剂作用,产生颜色反应,呈色度与胆固醇含量成正比,可用比色法测定血清中胆固醇含量。

血清经无水乙醇处理,蛋白质被沉淀,胆固醇及其酯溶解在无水乙醇。

在乙醇提取液中,加磷硫铁试剂,胆固醇及其酯与试剂形成比较稳定的紫红色化合物,此物质在560nm 波长处有特征吸收峰,可用比色法作胆固醇的定量测定。

正常血清中胆固醇的含量有随年龄增大而增加的趋势,其平均正常值在110~220mg/100ml。

胆固醇含量在400mg/100ml内,与A(或OD)值呈良好线性关系。

实验讲授:
722型分光光度计的使用
722型分光光度计的使用
测量原理
分光光度法测量的理论依据是伯郎—比耳定律:当容液中的物质在光的照射和激发下,产生了对光吸收的效应。

但物质对光的吸收是有选择性的,各种不同的物质都有其各自的吸收光谱。

所以根据定律当一束单色光通过一定浓度范围的稀有色溶液时,溶液对光的吸收程度A与溶液的浓度c(g/l)或液层厚度b (cm) 成正比。

其定律表达式A = abc(a是比例系数)。

当c的单位为mol/l时,A = εbc,比例系数用ε表示,称为摩尔吸光系数。

其单
位为L·mol-1·cm-1,它是有色物质在一定波长下的特征常数。

T (透光率) = I/I0 A (吸光度) = -lgT 或 A = K·C·L (比色皿的厚度)
测定时,入射光I, 吸光系数和溶液的光径长度不变时,透过光是根据溶液的浓度而变化的,即“K”为常数。

比色皿厚度一定,“L”、“I0”也一定。

只要测出A即可算出“C”。

《分光光度计的表头上,一行是透光率,一行是吸光度。


722型分光光度计的使用
1、将灵敏度旋钮调至“1”档(信号放大倍率最小)。

2、开启电源,指示灯亮,选择开关置于“T”,波长调至到测试用波长。

仪器预热20分钟。

3、打开试样室(光门自动关闭),调节透光率零点旋钮,使数字显示为000.0。

(调节100%T旋钮),盖上试样室盖,将比色皿架处于蒸馏水校正位置,使光电管受光,调节透光率100%旋钮使数字显示100.0。

如显示不到100.0,则可适当增加微电流放大的倍数。

(增加灵敏度的档数同时应重复(3)调节仪器透光率的“0”位)但尽量使倍率置于低档使用。

这样仪器会有更高的稳定性。

4、预热后,按(3)连续几次调整透光率的“0”位和“100%”的位置,待稳定后仪器可进行测定工作。

吸光度“A”的测量
将选择开关置于A 。

调节吸光度调零旋钮,使得数字显示为零,然后将被测样品移入光路,显示值即为被测样品的吸光度值。

浓度C的测量
将选择开关由“A”旋至“C”,将已标定浓度的样品放入光路,调节浓度旋钮,使得数字显示为标定值,将被测样品放入光路即可读出被测样品的浓度值。

使用方法
(1)预热仪器将选择开关置于“T”,打开电源开关,使仪器预热20分钟。

为了防止光电管疲劳,不要连续光照,预热仪器时和不测定时应将试样室盖打开,使光路切断。

(2)选定波长根据实验要求,转动波长手轮,调至所需要的单色波长。

(3)固定灵敏度档在能使空白溶液很好地调到“100%”的情况下,尽可能采用灵敏度较低的挡,使用时,首先调到“1”挡,灵敏度不够时再逐渐升高。

但换挡改变灵敏度后,须重新校正“0%”和“100%”。

选好的灵敏度,实验过程中不要再变动。

(4)调节T=0% 轻轻旋动“0%”旋钮,使数字显示为“00.0”,(此时试样室是打开的)。

(5)调节T=100% 将盛蒸馏水(或空白溶液,或纯溶剂)的比色皿放入比色皿座架中的第一格内,并对准光路,把试样室盖子轻轻盖上,调节透过率“100%”旋钮,使数字显示正好为“100.0”。

(6)吸光度的测定将选择开关置于“A”,盖上试样室盖子,将空白液置于光路中,调节吸光度调节旋钮,使数字显示为“.000”。

将盛有待测溶液的比色皿放入比色皿座架中的其它格内,盖上试样室盖,轻轻拉动试样架拉手,使待测溶液进入光路,此时数字显示值即为该待测溶液的吸光度值。

读数后,打开试样室盖,切断光路。

重复上述测定操作1-2次,读取相应的吸光度值,取平均值。

(7)浓度的测定选择开关由“A”旋置“C”,将已标定浓度的样品放入光路,调节浓度旋钮,使得数字显示为标定值,将被测样品放入光路,此时数字显示值即为该待测溶液的浓度值。

(8)关机实验完毕,切断电源,将比色皿取出洗净,并将比色皿座架用软纸擦净。

注意事项:
1、测量完毕,速将暗盒盖打开,关闭电源开关,将灵敏度旋钮调至最低档,取出比色皿,将装有硅胶的干燥剂袋放入暗盒内,关上盖子,将比色皿中的溶液倒入烧杯中,用蒸馏水洗净后放回比色皿盒内。

2、每台仪器所配套的比色皿不可与其它仪器上的表面皿单个调换。

仪器:
722分光光度计、台式离心机、试管及试管架、刻度吸量管或移液器等。

试剂:
(1)10%三氯化铁溶液:10gFeCl3.6H2O (A.R) 溶于磷酸 (A.R),定容至100ml。

储于棕色瓶,冷藏。

(2)磷硫铁试剂:取10%FeCl3溶液1.5ml于100ml棕色容量瓶内,加浓硫酸 (A.R)至刻度。

(3)胆固醇标准储液:准确称取胆固醇80mg,溶于无水乙醇,定容至100ml。

(4)胆固醇标准溶液:将储液用无水乙醇准确稀释10倍即得。

每毫升含0.08mg胆固醇。

(5)无水乙醇 (A.R)、无水乙醇 (A.R)。

操作
(1)吸取血清0.1ml于干燥离心管,先加无水乙醇0.4ml,摇匀后再加无水乙醇2.0 ml,摇匀,10分钟后离心(3000rpm 离心5 min),上清液备用(分两次加入乙醇的目的是使作用完全)。

(2)取干燥试管3支,编号,分别加入无水乙醇1.0ml(空白管)、胆固醇标准溶液1.0ml(标准管)、上述乙醇提取液1.0ml(样品管),各管皆加入磷硫铁试剂1.0ml,摇匀,10分钟后,分别转移至0.50 cm光径的比色杯内,用分光光度计560nm比色。

硫磷铁试剂须沿管壁缓缓加入,与乙醇液分成两层,立即迅速振摇20次,放置10分钟(冷却至室温)后,于560nm 进行比色,以空白管调零读取各管吸光度。

计算
(1)通过制作标准曲线来求得血清胆固醇的含量。

(2)因胆固醇含量在400mg/100ml 内,与A (或OD )值呈良好线性关系,可由吸光值A 的比值求其含量1
212C C A A =,本实验即用此法。

(3)如按方法1使用血清为样品,亦可根据线性关系计算
血清胆固醇mg%=20004.010008.0100/1212⨯⨯⨯=
A A A A ml mg =血清胆固醇 A 2=标准液吸光值;A 1=样品液吸光值
注意事项:
1、颜色反应与加硫磷铁试剂混合时的产热程度有关,因此,所用试管口径及厚度要一致:加硫磷铁试剂时必须与乙醇分成两层,然后混合,不能边加边摇,否则显色不完全;硫磷铁试剂要加一管混合一管,混合的手法,程度也要一致;混合时试管发热,注意勿使管内液体溅出,以免损伤衣服、皮肤、眼睛。

2、所用试管和比色杯均须干燥,浓硫酸的质量很重要,放置日久,往往由于吸收水分而使颜色反应降低。

3、空白管应接近无色,如带橙黄色,表示乙醇不纯,应用去醛处理。

4、人血清胆固醇正常含量为2.8-5.9mmol/L(110-230mg/dl)。

计算公式中的0.026为mg/dl 转换成mmol/L 的系数。

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