细胞分子模型(1)
细胞生物学习题含答案
细胞生物学习题含答案一、单选题（共100题，每题1分，共100分）1.要探知细胞内某一蛋白质的表达水平，可以通过（）实现A、原位分子杂交B、Western blotC、Northern blotD、Southern blot正确答案：B2.细胞分裂的哪个阶段可以观察到孟德尔自由组合定律的证据（）A、减数分裂后期ⅠB、减数分裂后期ⅡC、有丝分裂中期D、有丝分裂后期正确答案：A3.广泛分布于无脊椎动物中的锚定连接形式是（）A、半桥粒B、桥粒C、黏着斑D、黏着带E、隔状连接正确答案：E4.要产生不同组织类型的细胞需通过（）A、有丝分裂B、细胞去分化C、细胞增殖D、细胞分化E、减数分裂正确答案：D5.微丝参与细胞分裂过程的阶段是( )A、前期B、后期C、前中期D、胞质分裂E、中期正确答案：D6.端粒序列属于（）A、单一序列B、复制起始序列C、中度重复序列D、高度重复序列正确答案：D7.对动物细胞有丝分裂的下列叙述，哪一项是正确的（）A、所有的动物细胞都一直在进行有丝分裂B、分裂产生的子细胞染色体数目相同C、分裂产生的子细胞染色体数目不同D、分裂产生的子细胞染色体数目和受精卵不同E、胞质分裂中在细胞中部形成细胞板，直接间隔形成2个子细胞正确答案：B8.微管蛋白的异二聚体上有核苷三磷酸（）的结合位点。
A、UTPB、CTPC、GTPD、ATP正确答案：C9.下列中哪种是由微丝为主要成分构成的细胞结构？A、肌肉的细肌丝，微绒毛，纤毛，细胞皮层B、肌肉的细肌丝，肌肉的粗肌丝，微绒毛，stress fiberC、细胞皮层，微绒毛，stress fiber，胞质分裂环D、肌肉的粗肌丝，微绒毛，stress fiber，胞质分裂环正确答案：C10.关于rRNA正确的表述是（）A、有反密码子B、携带指导蛋白质翻译的遗传信息C、参与构成核糖体D、易降解正确答案：C11.下述哪种细胞最易分裂（）A、脂肪细胞B、心肌细胞C、神经元D、肝细胞E、胃、肠上皮细胞正确答案：E12.矽肺的形成是由于（）A、溶酶体酶耗竭B、溶酶体内PH下降C、溶酶体酶缺乏或缺陷D、溶酶体膜脆性下降E、溶酶体酶释出正确答案：E13.形态、分布、理化性质等高度异质性的细胞器是（）A、线粒体B、次级溶酶体C、初级溶酶体D、粗面内质网正确答案：B14.通道蛋白（）A、运输时需要能量B、对运输的物质没有选择性C、逆浓度梯度转运物质D、是跨膜蛋白构成的亲水通道正确答案：D15.微粉干涉显微镜的光源采用（）A、日光B、偏振光C、激光D、荧光正确答案：B16.细胞的生命特征有（）A、以新陈代谢为基础B、生长发育繁殖的基础C、具有遗传性D、具有进化性E、以上都是正确答案：E17.已知某物质在细胞膜两侧的分布情况为：细胞内的浓度高于细胞外的浓度。
细胞膜的分子生物学
质膜外表面的蛋白 寡糖链结合
共价键与磷脂酰肌醇相连的
3 膜糖类
细胞外被（cell coat)：膜糖类以糖蛋白或糖脂的形 式均匀分布在生物膜的非胞质面。
功能：有助于蛋白质在膜上的定位与固定，参与细 胞识别及与周围环境的相互作用。
细 胞 被 脂 双 层
细胞内
二、细胞膜的特性
（一）细胞膜的不对称性(asymmetry) 1. 膜脂分布的不对称
钠钾泵机制
（2）钙泵（Ca2+-ATP酶）ATP直接供能
通常细胞内钙离子浓度（10-7M）显著低于 细胞外钙离子浓度（10-3M），这种浓度差 由钙泵维持。
位置：质膜和内质网膜上
每分解一个ATP分子，泵出2个Ca2+。
例：肌质网（sarcoplasmic reticulum）上的 钙离子泵 ，肌细胞膜去极化后引起肌质网 上的钙离子通道打开，大量钙离子进入细 胞质，引起肌肉收缩之后由钙离子泵将钙 离子泵回肌质网。
磷脂酰肌醇(PI) 鞘磷脂(SM)
磷脂的分子结构
甘油磷脂：以甘油为骨架，甘油分子的1、2位 羟基分别与脂肪酸形成酯键， 3位羟基与磷酸 形成酯键。磷酸基团分别与胆碱、乙醇胺、丝 氨酸或肌醇结合，即形成甘油磷脂分子的头部。
鞘磷脂（SM）：以鞘氨醇代替甘油。鞘磷脂及其 代谢产物神经酰胺等参与各种细胞活动，如细胞 分化、凋亡和增殖。
㈠ 简单扩散（simple diffusion）
影响因素：
分子量越小 脂溶性越强 非极性比极性分子
过脂双层膜速率越快
特点：
①沿浓度梯度扩散 高-低 ②不需要提供能量 ③不需要膜蛋白协助
二、易化扩散
也称促进扩散（facilitated diffusion）。 特点： ①转运速率高； ②运输速率同物质浓度成
动物细胞的物理模型-概述说明以及解释
动物细胞的物理模型-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述动物细胞是构成动物生物体的基本单位，它们通过各种细胞器和分子组织成为复杂的结构。
研究动物细胞的组成、形态和结构是细胞生物学领域的重要研究方向之一。
然而，要深入了解和解释动物细胞的功能和行为，仅仅通过观察细胞的形态和结构是远远不够的。
随着科学技术的发展和理论的不断深化，提出了动物细胞的物理模型的概念。
物理模型是指通过建立数学或物理方程来描述和解释现象、系统或实体，从而加深人们对其本质和内在规律的理解。
在细胞生物学中，动物细胞的物理模型旨在通过数学建模和计算模拟，重现和描述细胞内部和外部的物理过程和相互作用。
动物细胞的物理模型研究可以帮助我们理解许多生物学现象，例如细胞的形变、细胞内分子的运动和传输、细胞的力学性质等。
通过建立适当的物理模型，我们可以预测和解释细胞内的力学特性、细胞运动的方式和细胞对外部刺激的响应。
这有助于我们更好地理解细胞的工作方式以及生物体的生理过程。
本文将围绕动物细胞的物理模型展开深入探讨。
首先，我们将介绍动物细胞的组成和结构，包括细胞膜、细胞质和细胞核等重要组成部分。
然后，我们将详细讨论动物细胞的形态与结构，探究各种细胞器的形态特征和功能。
接着，我们将阐述动物细胞的物理模型在细胞生物学领域的重要性，并展望其在未来的应用前景。
通过对动物细胞的物理模型的研究，我们可以更好地理解和解释生物体的各种复杂生理现象，为生物医学和生物技术领域的发展提供理论和实践的指导。
1.2 文章结构本文的主要目的是探讨动物细胞的物理模型，为此，文章将按照以下结构展开讨论。
首先，在引言部分，我们将对整篇文章进行概述，介绍动物细胞的基本概念与重要性，以及为何需要研究动物细胞的物理模型。
通过概述的介绍，读者能够对文章的内容有一个整体的把握。
接下来，正文部分将详细探讨动物细胞的组成和形态结构。
在2.1节中，我们将介绍动物细胞的组成，包括细胞膜、细胞质和细胞核等重要组成部分。
《细胞分子生物学》PPT课件
信号转导途径
信号转导途径的组成
信号转导途径通常由受体、信号转导分子和效应分子三个部分组 成。
常见的信号转导途径
包括MAPK途径、PI3K/Akt途径、JAK/STAT途径等。
信号转导途径的特点
各种信号转导途径具有不同的特点，如选择性、级联反应、可调节 性等。
信号转导与疾病
1 2
信号转导与肿瘤
许多肿瘤的发生和发展与信号转导异常有关，如 EGFR、K-Ras等基因突变引起的信号转导异常。
细胞信号转导是指细胞通过胞膜或胞内受体感受外界信号 刺激，进而将信息传递至细胞内，引起细胞功能改变的过 程。
信号转导的分类
根据信号分子的性质，信号转导可分为亲缘性信号转导和 远缘性信号转导。
信号转导的生物学意义
信号转导是细胞Leabharlann 应环境变化，维持正常生理功能的重要 方式，对细胞的生长、发育、代谢和分化等过程具有重要 调控作用。
细胞衰老是指细胞在生 理和生化方面发生一系 列改变，导致其功能逐 渐衰退的过程。
细胞衰老的特征
细胞衰老时，细胞周期 停滞，细胞体积减小， 细胞器减少，细胞内色 素沉积，细胞膜通透性 改变等。
细胞衰老的机制
细胞衰老涉及多种机制 ，包括基因组不稳定、 端粒缩短、表观遗传改 变、线粒体功能障碍等 。
细胞凋亡
细胞器的相互关系
各种细胞器在结构上相互连接，功能 上相互配合，共同完成细胞的各项生 理功能。同时，它们之间也存在动态 的联系和互动，如物质的合成、加工 、运输和降解等过程都需要各种细胞 器的协同作用。
03
基因与蛋白质
基因结构与功能
01
02
03
基因组成
基因由DNA组成，具有编 码遗传信息的特性。
第二章 细胞膜
脂质双层中胆固醇分子与磷脂分子的关系
糖脂
广泛分布在所有细胞膜上的含有糖基的 脂类。 所有的糖脂均位于膜的外面，其作用可 能是作为某些大分子的受体，与细胞识别 及信息传导有关。
（二）膜蛋白：细胞膜上的蛋白质的统称。 膜蛋白是细胞膜功能的主要承担者。 根据蛋白质在膜中的位置及与脂类分离 的难易，分为： 外在膜蛋白 内在膜蛋白
需转运蛋白
消耗能量
钙泵 协同运输
被动运输是物质由高浓度一侧经细 胞膜转运到低浓度一侧的运输方式，不 需消耗能量。 主动运输是指细胞膜上的载体蛋白 利用能量将物质逆浓度梯度（或化学梯 度）由浓度低的一侧向浓度高的一侧的 跨膜运输方式。
例如：如“ 钠-钾泵” （ Na+-K+-ATP酶、简称钠泵） （1）“ 钠-钾泵”的本质：具有ATP酶活性的膜蛋白。 （2）“ 钠-钾泵” 的作用：逆浓度差跨膜转运Na+ 、K+ 。 消耗1个ATP ，泵入2个K + ，泵出3个Na +。
钙离子泵（又称Ca2+－ATP酶）
作用：维持细胞内低钙浓度（胞内钙浓度10-7M， 胞外10-3M）；钙泵在肌质网内储存Ca2+ ，对调节 肌细胞的收缩与舒张至关重要。 位置：质膜、内质网膜 类型：
P型离子泵，每分解一ATP，泵出2个Ca2+ 。位于
肌质网上的钙离子泵占肌质网膜蛋白质的90%。
1.3Na+结合到结合位点上 2.酶磷酸化 3.酶构象变化， 3Na+释放到细胞外 4.2K+结合到位点上 5.酶去磷酸化 6.2K+释放到细胞内，酶构象恢复原始状态。
“
钠-钾泵” 的生理意义：
1）维持低Na+高K+的细胞内环境；
高一生物必修1_分子与细胞_阅读材料：细胞膜的结构模型
细胞膜的结构模型19世纪中叶K.W.Mageli发现细胞表面有阻碍染料进入的现象，提示膜结构的存在；1899年E.Oveiton发现脂溶性大的物质易入胞，推想应为脂类屏障。
1925年荷兰人E.Gorter和F.Grendel用丙酮抽提红细胞膜结构，计算出红细胞膜平铺面积约为其表面积的两倍，提出脂质双分子层模型.成立前提：a.红细胞的全部脂质都在膜上；b.丙酮法抽提完全；c.RBC平均表面积估算正确。
（70%~80%偏低）；40年后Bar重复这一试验发现红细胞膜平铺面积应不是70%～80%，而是1.5倍还有蛋白质表面，同时干膜面积是99μm2，湿膜面积则为145μm2。
两项误差相抵，结果基本正确。
根据细胞的生理生化特征，曾先后推测质膜是一种脂肪栅、脂类双分子层和由蛋白质-磷脂-蛋白质构成的三夹板结构。
同时电镜观察也证实质膜确实呈暗-明-暗三层结构。
随后冷冻蚀刻技术显示双层膜中存在蛋白质颗粒；免疫荧光技术证明质膜中蛋白质是流动的。
据此S.J.Singer等人在1972年提出生物膜的流动镶嵌模型，结构特征是：生物膜的骨架是磷脂类双分子层，蛋白质分子以不同的方式镶嵌其中，细胞膜的表面还有糖类分子，形成糖脂、糖蛋白；生物膜的内外表面上，脂类和蛋白质的分布不平衡，反映了膜两侧的功能不同；脂双层具有流动性，其脂类分子可以自由移动，蛋白质分子也可以在脂双层中横向移动。
尽管目前还没有一种能够直接观察膜的分子结构的较为方便的技术和方法，但从研究中30年代以来提出了各种假说有数十种，其中得到较多实验事实支持而目前仍为大多数人所接受的是美国的S.J.Singer和G.L.Nicholsom于1972年提出的流体镶嵌模型（fluid mosaic model）。
这一假想模型的基本内容是：膜的共同结构特点是以液态脂质双分子层为基架，其中镶嵌着具有不同分子结构、因而也具有不同生理功能的蛋白质，后者主要以α-螺旋或球型蛋白质的形式存在。
细胞膜的结构模型与细胞功能
02
在细胞膜上载体的帮助下，通过消耗ATP，将某种物质逆浓度梯度进行转运的过程。
03
逆浓度梯度转运；
04
耗能（ATP） 。
05
细胞生理
主动转运 （据提供能量方式）
01
02
03
04
原发性主动转运
继发性主动转运
直接利用ATP水解产生的能量进行离子的跨膜转运。如Na＋的转运
05
能量不是直接来自ATP的水解，来自膜外的高势能Na＋。
1、片层结构模型
细胞的表面张力显著低于油-水界面的表面张力，因此，细胞膜不可能是单纯由脂类构成的，可能还吸附有蛋白质。
1935年J. Danielli和H. Davson提出了第一个膜的分子结构模型——片层结构模型 。
2、单位膜模型
1959年，J.D.Robertson用电镜观察细胞膜，发现细胞膜呈三层式结构。内外两侧为电子密度高的暗线，中间为电子密度低的明线，即所谓“两暗一明”，进而提出单位膜模型。
20世纪初，Irving Langmuir 将红细胞的脂提取后铺展在Langmuir 水盘(Langmuir Trough)的水面上，研究了脂的展层行为，提出脂单层的设想。
1925 年，E. Gorter & F. Grendel 用有机溶剂提取了人类红细胞质膜的脂类成分，将其铺展在水面，测出膜脂展开的面积二倍于细胞表面积，因而推测细胞膜由双层脂分子组成。
（3）卵磷脂与鞘磷脂比值：
卵磷脂越高流动性越强。
（4）膜蛋白的影响：
卵磷脂
脂肪酸不饱和程度高，相变温度低。
鞘磷脂
脂肪酸饱和程度高，相变温度高。
（二）膜蛋白分子在质膜中的运动
利用细胞融合技术观察蛋白质运动
细胞生物学第四章总结
第一节细胞膜的化学组成与分子结构一、细胞膜的化学组成（1）细胞膜的基本骨架——膜脂1、膜脂有3种类型，分别为磷脂、胆固醇、糖脂，其中磷脂构成膜脂的基本成分。
2、磷脂分为甘油磷脂和鞘磷脂，甘油磷脂以甘油为骨架，而鞘磷脂以鞘氨醇代替甘油。
3、胆固醇在动物膜中含量较多，在膜中散布与磷脂分子之间，胆固醇分子对调节膜的流动性和加强膜的稳定性有重要的作用。
4、糖脂位于质膜的非胞质面，糖基暴露于细胞表面，由脂类和寡糖构成，普遍存在于原核和真核细胞膜表面。
不同类型糖脂的区别在于其极性头部的不同。
5、膜脂都是两亲性分子，具有亲水的极性头部和疏水的非极性尾部。
可能形成球状分子团和双分子层两种形式，但大多自动形成双分子层结构。
（2）细胞膜功能的决定物质——膜蛋白1、根据功能将膜蛋白分成转运蛋白、酶、连接蛋白、受体蛋白。
根据与脂双层结合的方式将膜蛋白分为内在膜蛋白、外在膜蛋白、脂锚定蛋白。
2、在不同细胞中膜蛋白的含量和种类差别很大。
3、内在膜蛋白：又称跨膜蛋白，两亲性分子，分为单次跨膜、多次跨膜和多亚基跨膜蛋白3种类型。
内在膜蛋白跨膜结构域是与膜脂结合的主要部位，可为α-螺旋、β-折叠片结构构象。
常用去垢剂分离内在膜蛋白。
外在膜蛋白：又称外周蛋白，完全位于脂双层之外，简介与膜结合，为水溶性蛋白，与膜结合较弱。
脂锚定蛋白：又称脂连接蛋白，位于膜的两侧，以共价键与脂双层内的脂分子结合。
（3）覆盖于膜表面的膜糖类：膜糖类大多数以低聚糖或多聚糖形式共价结合于膜蛋白上形成糖蛋白，或者以低聚糖链共价结合于膜脂上形成糖脂。
二、细胞膜的特性（1）、流动性1、膜脂的流动性：膜脂双分子层是二维流体，，具有晶体结构，。
膜脂分子能够进行多种运动，包括侧向扩散运动（主要）、翻转运动、旋转运动、伸缩和振荡运动和烃链的旋转异构运动。
2、膜蛋白的运动性：膜蛋白的运动方式主要是侧向扩散和旋转运动，移动速度较慢，旋转运动比侧向运动更为缓慢。
实际上不是所有的膜蛋白均能自由运动，膜蛋白周围磨制的相态对其运动性有很大影响。
细胞结构模型
• 内膜：线粒体内部的膜系统
• 代谢过程：脂肪酸和某些氨基酸的代谢
• 基质：线粒体内部的液体部分
• 细胞凋亡：细胞程序性死亡过程中的能量供应
• 嵴：线粒体内的膜褶皱
高尔基体的结构与功能
高尔基体的结构
• 扁平囊：高尔基体的主要结构
• 大囊泡：高尔基体内的运输囊泡
• 小囊泡：高尔基体内的分泌囊泡
高尔基体的功能
• 细胞器功能：针对细胞器功能的药物设计
02
药物筛选
• 细胞模型：基于细胞结构的药物筛选模型
• 高通量筛选：基于细胞结构的高通量筛选技术
• 虚拟筛选：基于细胞结构的虚拟筛选技术
03
药物作用机制
• 药物靶点激活：药物作用过程中的靶点激活机制
• 信号传导途径：药物作用过程中的信号传导途径
• 细胞结构变化：药物作用过程中的细胞结构变化
细胞膜系统的分子机制
细胞膜系统的生物学应用
• 膜蛋白的研究：膜蛋白的结构和功能
• 药物靶点：针对膜蛋白和膜脂的药物设计
• 膜脂的研究：膜脂的类型和功能
• 疾病模型：细胞膜系统的疾病研究和治疗
• 膜融合和膜转运：膜结构的动态变化和物质转运
• 生物材料：细胞膜系统的生物材料应用
04
细胞信号传导途径
细胞信号传导的基本概念
• 细胞识别：识别自身和非自身细胞
细胞膜的特性
• 流动性：磷脂双分子层的动态变化
• 不对称性：膜内外成分分布不均
• 膜厚度：维持细胞膜的稳定性和功能
细胞质的组成与功能
细胞质的组成
• 水分：细胞质的主要成分
• 蛋白质：细胞质中的主要功能分子
• 核酸：细胞质的遗传信息载体
生物物理名词解释
方法：将待提纯蛋白质放在透析袋中放在蒸馏水中进行 2） 超过滤：原理：利用压力和离心力，强行使其他小分子和水通过半透膜，而蛋 白质留在膜上 3） 等电点沉淀：原理：不同蛋白质具有不同的等电点，当蛋白质混合物调到其中 一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来. 4） 盐析与盐溶 ：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐 溶.当离子强度增加，足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为 盐析
10. 蛋白质折叠问题为什么受到重视？它与疾病有什么关系？ 几乎所有的生命活动都是蛋白质完成的，而蛋白质链只有折叠成天然结构才有活性。 生命是从折叠开 始的。蛋白质折叠被称为第二套遗传密码。很多疾病，比如疯牛病、克鲁病等都与蛋白质的错误折叠有 关。
11. 生物分子间的作用力主要有哪些，各有什么特点?蛋白质相互作用的主要特点? 非共价键的作用；离子键、氢键、范德华力、疏水键。信息的传递及利用极大地依赖弱的非共价键。它们 不仅决定着生物大分子的三维结构，还决定着这些结构如何与其它结构相互作用。 生物分子作用力特点：分子的结合与解离
液态镶嵌模型的主要内容是什么，主要强调了哪两个特性？ 基本内容：磷脂双分子层构成膜的基本支架。蛋白质分子有的镶嵌在磷脂双分子层表面，有的部分或全部 嵌入磷脂双分子层中，有的横跨整个磷脂双分子层（体现了膜结构内外的不对称性）。磷脂分子是可以运 动的，具有流动性。大多数的蛋白质分子也是可以运动的。大多数的蛋白质分子也是可以运动的。 流动性和不对称性
7. 蛋白质的二级结构是如何产生的？研究二级结构的意义？ 二级结构是指多聚体分子主链（也称骨架）空间排布的规律性。 二级结构的产生源于骨架中基团围绕共价键旋转而获得的非刚性。二级结构是生物大分子空间结构的一个 重要方面，生物大分子在不同状态，不同环境条件或与其他分子相互作用时，常常反应在二级结构的变化 上，因此通过对二级结构的研究有助于对分子环境和作用的了解。
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(4) FLIPR ( fluorescent imaging plate reader) • FlIPR96和FLIPR384是由MolecularDevices公 司开发的针对活细胞荧光检测钙流的技术 • 检测荧光信号快速、准确，可达到亚秒级水平， 允许短暂信号的检测，尤其适用于钙指示剂检 测胞内钙 • 均质、动态、细胞水平的荧光检测方法 • 用于胞内钙离子、钠离子、膜电位和pH的检测 • 但因由水冷的氩激光提供激发能量，用冷的 CCD成像系统检测，受到光源限制，染料多为 Fluo-3/AM和calcium green
Transflour 技术
• Transflour 技术，适用于各种GPCR (Gi, Gs, Gq, G12/13 )受体功能研究，原理为不同的GPCR受体与配 体相互作用时激活特定的G蛋白Gα亚单元，导致相关 的下游信号的级联激活 • 胞浆衔接子( adaptor)蛋白Arrestin，在几乎所有的 GPCR受体脱敏过程中发挥作，从胞浆转位至胞膜与受 体结合形成复合体，随后GPCR受体和其特定G蛋白解 偶联导致受体脱敏；Arrestins蛋白还介导受体的胞 浆内化并与之结合，内化受体或形成颗粒状蛋白散布 于胞浆中,重新循环发挥功能或在溶酶体中降解 • 利用Arrestin蛋白的转位、结合和内化，将报告基因 和Arrestin蛋白表达成融合蛋白，作为GPCR受体功能 研究的指示蛋白，用于细胞水平的高通量筛选
(3) 多指标、多靶点、多通道检测是现今细胞水平 高通量筛选技术的核心和关键 • 光显微荧光成像技术是进行多指标检测的基础 • 多指标、多靶点检测有助于发现药物作用的新途 径，深入认识药物作用的机制 • 为筛选具有互补的多靶点作用机制的单一治疗药 物提供了手段和工具 (4) 实时动态检测和可视化 • 对活细胞进行荧光标记，荧光成像技术， • 分子水平的实时动态检测和可视化研究 • 自动图像分析和数据量化分析
(5)细胞模型的材料来源较容易 • 用于药物筛选的细胞：正常细胞、转基因和 病理细胞等 • 多数生物性物质均可通过转基因的方法由细 胞表达 (6)分子生物学和细胞生物学手段 • 特别是基因芯片技术 • 发现疾病有关基因,克隆 • 建立稳定细胞株 • 大规模药物筛选
目前： (1) 微量化，超高通量化 1 536孔板，荧光方 法可达3 456－9 600孔 • 微量化技术是实行超高通量筛选( uHTS)的基 础 • 载体微孔板硬度、自动化加样精度 • 检测系统 • 数据分析系统 (2) 均质检测：一步加入
• 受体筛选模型 • 受体与放射性配体结合模型：将受体、配体、 被测物及必要的辅助因子一起加入到缓冲溶 液中温孵 • 达到平衡后过滤, 滤纸上残留的即为结合的 放射性配体,通过液体闪烁计数来测量 • 灵敏度高、特异性强 • 适合大规模筛选
• • • •
酶筛选模型: 筛选作用于酶的药物 主要观察药物对酶活性的影响 酶的反应底物和产物皆可作为检测指标,由此 确定反应速度
(5) FMATTM ( fluometric microvolume assay technology) • 由PE Bio system开发 • 基于荧光发光团Cy5，以红色的633nm氦/氖激 光为光源的多孔板扫描技术 • 可有效扣除背景，灵敏度较高、均质的活细 胞检测 • 用于细胞因子调控表达、GPCR、核受体、蛋 白-蛋白相互作用、蛋白-核酸相互作用的功 能性测定 • 如用FMAT技术改良的ELISA 一步法的FLISA技 术
CellCardTM系统：新的多通道(multip lexed)HCS筛 选技术，由Vitra Bioscience公司开发 • 可在96孔板单孔中实现对多个细胞系或多靶点的同 时检测，是一种基于多通道的全自动影像系统 • 可在单一检测中应用多参数检测，可定量单一细胞 类型中多个细胞内事件或对多个细胞类型实行同一 检测，在获得样品活性的同时得到样品对不同细胞 株上设计的不同靶点的选择性信息 • 关键点为CellCard Carrier微载体技术，允许多种 细胞株在96孔板的同一孔中进行生长并检测 • 优点：增大检测容量，提高检测数据质量，节省时 间，降低成本 • 对细胞培养的要求很高，培养环境必须适合所有被 检细胞株生长
• 检测范围：靶点激活、细胞分裂及凋亡、蛋白 转位、细胞活力、细胞迁移、受体内化、细胞 毒性、细胞周期和信号转导；监测细胞器、活 性物质释放(一氧化氮、活性氧、胞内钙离子) 等 • 用于药靶的证实和药物初筛, 尤宜于诸如GPCR 功能性研究，药物多靶点研究，癌症的综合研 究，多指标形态学观察，激酶级联反应，信号 转导途径的研究等 • 如用HCS对细胞水平的17种蛋白同时进行了检 测
3 荧光检测分析技术 • 定量读取荧光密度；单次实验中同时获得其他荧光特性， 如荧光寿命、极化、淬灭，提高筛选的有效性，可快速、 多参数地评价样品和靶之间的相互作用 (1)极化荧光( fluorescence polarization, FP) 分析 生物体系中分子间相互作用，根据荧光标记的小分子在 游离和与大分子结合靶标2种状态时的极化荧光值不同 而区分 优点： • 不用分离荧光标记物，反应在均相溶液中进行 • 检测时间不会影响结果 • 高灵敏性、高稳定性、可重复性 • 操作简便，假阴性或假阳性率低 • 用于细胞水平的膜受体如GPCR、核受体调节剂的HTS筛 选，如促肾上腺皮质激素2α亚型受体(CRF2αR)的功能 分析中cAMP的直接检测
第３节 常用技术
1 细胞水平重组技术 • 重组技术是细胞水平高通量常用技术手段 • 经典方法是通过重组基因在宿主细胞基因组 的随机整合而产生稳定细胞株 • 不足：重组基因的定位不可预测，表达水平 受重组位点的影响，基因拷贝数不确定，阳 性克隆的产生率低，筛选时间长等 • 现用游离体载体( episomal vector)：转染 效率高，阳性克隆筛选速度快
2 报告基因技术 • 将靶基因连接到细胞上，通过激活或抑制靶 基因导致报告基因的表达，通过比色、荧光 或发光的方法检测 • 简便，如荧光素酶( luciferase)和β-半乳 糖苷酶报告基因系统，不需裂解分离可直接 均质检测 • 用于活体细胞的报告基因多是绿色荧光蛋白 (GFP)，适于活体细胞检测，被称为生物传 感蛋白
细胞分子模型
第1节 概述
细胞分子模型与动物模型的区别： 动物模型 • 优点： • 传统的筛选方法 • 直接反映治疗效果、不良反应、毒性作 用 • 预测临床价值、应用前景 • 不足： • 筛选效率低，并非均有疾病模型，动物 个体差异，成本高
细胞、分子水平药物筛选模型 • 优点： • 耗材少 • 药物作用机制明确 • 筛选规模大，高通量筛选 • 已成为药物筛选的主要方法 • 快速、微量、大规模为特征的高通量筛选
(3)荧光相关光谱( fluorescence correlation spectroscopy，FCS) • 超高通量筛选检测技术，通过共焦镜提供高聚激发 光，消除背景可实现单分子检测 • 共聚焦光学系统可实现输出信号的微量化分析 • 可评价单个分子的荧光信号，提供荧光粒子的扩散 特征信息 • 可进行多参数、多维荧光检测 • 监测分子结合时的相互作用如进行受体结合分析和 其他分子事件 • 采用FCS用于活细胞筛选GPCR调节剂，在3 456孔板， 最小测活体积小于2μL
(2)荧光共振能量转移( fluorescence resonance energy transfer, FRET) 指非放射性能量在适当 能量给予体和接受体之间转移 • 当供体激发态能量满足光学和空间上的要求时，其能 量能有效转移给受体，导致受体发射荧光 • 供体和受体空间距离的变化能显著影响能量的有效转 移效率 • 荧光底物设计和人工合成： • 细胞筛选用的β-内酰胺酶(β-lactamase)报告基因 检测系统采用的荧光底物就是基于FRET的原理，合成 底物CCF4，为１分子头孢菌素联上１分子7-羟基香豆 素和１分子荧光素( fluorescein)。当体系无配基激 活时，底物完整，激发香豆素发射530 nm绿光；如加 入所研究受体的特异性配基，报告基因系统激活，表 达β-lactamase，裂解底物，破坏了FRET，激发香豆 素发射460 nm 蓝光。用于GPCR受体-催产素受体 ( hO-TR)的筛选 • 采用FRET原理设计淬灭型底物进行激酶的筛选
优点： • GFP自发荧光，且荧光稳定；不需其他的底 物和辅因子；GFP与其他蛋白嵌合后不影响 其自身荧光特性 • GFP及其变体：用于实时动态研究体内或细 胞水平的蛋白定位和转位，蛋白的降解，蛋 白-蛋白的相互作用，细胞骨架动力学，细 胞周期，检测目的基因表达变化 • β-内酰胺酶，水解荧光能量共振转移 ( FRET)底物CCF4 /AM行定量检测，或作为 核因子调节的指示蛋白，用于受体功能筛选
4 荧光影像( fluorescence imaging)技术 (1)高内涵筛选( high content screening, HCS) • 指在保持细胞结构和功能完整性的前提下，同 时检测被筛样品对活细胞形态、生长、分化、 迁移、凋亡、代谢途径及信号转导各个环节的 影响，单一实验中获取大量相关信息，确定样 品生物活性和潜在毒性 • 应用高分辨率的荧光数码影像系统，在细胞水 平上检测多个指标的多元化、功能性筛选技术 • 获得被筛样品对固定化或动态细胞产生的多维 立体和实时快速的生物效应信息
(3)时间分辨荧光能量传递分析法( time resolvedfluorescence resonance energy transfer, TREF or TR-FRET) • 双标记方法 • 原理是在长寿荧光镧系复合物和共振能量受体之间 的长范围能量传递 • 液态条件下进行，不需固定相支持和分离步骤，不 需对试剂进行特殊处理 • 优点：减少背景，使长期存在的供体和受体信号随 时间显示很高的敏感性 • 用于蛋白与蛋白结合分析、受体配体结合分析等 • 用长寿荧光金属铕作供体成分，用另一个荧光分子 XL665 (一个改型别藻蓝蛋白的片断)作为受体进行 了β-分泌酶抑制剂的细胞水平筛选