细胞分子模型(1)

Transflour 技术
• Transflour 技术，适用于各种GPCR (Gi, Gs, Gq, G12/13 )受体功能研究，原理为不同的GPCR受体与配 体相互作用时激活特定的G蛋白Gα亚单元，导致相关 的下游信号的级联激活 • 胞浆衔接子( adaptor)蛋白Arrestin，在几乎所有的 GPCR受体脱敏过程中发挥作，从胞浆转位至胞膜与受 体结合形成复合体，随后GPCR受体和其特定G蛋白解 偶联导致受体脱敏；Arrestins蛋白还介导受体的胞 浆内化并与之结合，内化受体或形成颗Biblioteka Baidu状蛋白散布 于胞浆中,重新循环发挥功能或在溶酶体中降解 • 利用Arrestin蛋白的转位、结合和内化，将报告基因 和Arrestin蛋白表达成融合蛋白，作为GPCR受体功能 研究的指示蛋白，用于细胞水平的高通量筛选
(4) FLIPR ( fluorescent imaging plate reader) • FlIPR96和FLIPR384是由MolecularDevices公 司开发的针对活细胞荧光检测钙流的技术 • 检测荧光信号快速、准确，可达到亚秒级水平， 允许短暂信号的检测，尤其适用于钙指示剂检 测胞内钙 • 均质、动态、细胞水平的荧光检测方法 • 用于胞内钙离子、钠离子、膜电位和pH的检测 • 但因由水冷的氩激光提供激发能量，用冷的 CCD成像系统检测，受到光源限制，染料多为 Fluo-3/AM和calcium green
(2)共聚焦显微成像技术( fluorescence confocal microscope imaging) • 采用共聚焦激光微扫描，并结合数字化影像和光稳 荧光染料，特别适合于微量、快速的细胞水平生物 分子的多荧光标记检测，活细胞和亚细胞影像分析 和多维成像 • 共聚焦显微光学系统如EVOscreen系统,均质检测, 检测体积小而不损失信号质量 • 利用共聚焦的荧光技术有荧光共振能量转移 ( FRET) ,荧光寿命显微成像( fluorescence lifetime imaging microscopy , FLIM)，光漂白后 荧光复现FRAP ( fluorescent recovery after photobleaching) ,光漂白荧光损失FLIP ( fluorescence loss in photobleaching), FCS ( fluorescence correlation spectroscopy)等
• 检测范围：靶点激活、细胞分裂及凋亡、蛋白 转位、细胞活力、细胞迁移、受体内化、细胞 毒性、细胞周期和信号转导；监测细胞器、活 性物质释放(一氧化氮、活性氧、胞内钙离子) 等 • 用于药靶的证实和药物初筛, 尤宜于诸如GPCR 功能性研究，药物多靶点研究，癌症的综合研 究，多指标形态学观察，激酶级联反应，信号 转导途径的研究等 • 如用HCS对细胞水平的17种蛋白同时进行了检 测
• 受体筛选模型 • 受体与放射性配体结合模型：将受体、配体、 被测物及必要的辅助因子一起加入到缓冲溶 液中温孵 • 达到平衡后过滤, 滤纸上残留的即为结合的 放射性配体,通过液体闪烁计数来测量 • 灵敏度高、特异性强 • 适合大规模筛选
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酶筛选模型: 筛选作用于酶的药物 主要观察药物对酶活性的影响 酶的反应底物和产物皆可作为检测指标,由此 确定反应速度
(3)荧光相关光谱( fluorescence correlation spectroscopy，FCS) • 超高通量筛选检测技术，通过共焦镜提供高聚激发 光，消除背景可实现单分子检测 • 共聚焦光学系统可实现输出信号的微量化分析 • 可评价单个分子的荧光信号，提供荧光粒子的扩散 特征信息 • 可进行多参数、多维荧光检测 • 监测分子结合时的相互作用如进行受体结合分析和 其他分子事件 • 采用FCS用于活细胞筛选GPCR调节剂，在3 456孔板， 最小测活体积小于2μL
2 报告基因技术 • 将靶基因连接到细胞上，通过激活或抑制靶 基因导致报告基因的表达，通过比色、荧光 或发光的方法检测 • 简便，如荧光素酶( luciferase)和β-半乳 糖苷酶报告基因系统，不需裂解分离可直接 均质检测 • 用于活体细胞的报告基因多是绿色荧光蛋白 (GFP)，适于活体细胞检测，被称为生物传 感蛋白
背景： •药物的作用机制要从细胞水平去探索 •潜在的药物作用靶点数目和有待筛选的化合物数目增多 特点： •筛选规模和筛选速度更大 •筛选模型的检测技术能够更快速、全面反映被筛样品的生 物活性特征
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分子水平的药物筛选模型： 受体、酶、通道、基因、其他 标准的体外分子水平筛选 优点： 快速 微量 筛选结果准确、稳定，易于评价 不足： 只能对特定靶点的单指标检测 提供化合物对靶点作用的有限信息，无法对 化合物的生物活性进行综合评价 单纯的分子水平的高通量药物筛选技术已不 能满足新药发现的需要
(3)时间分辨荧光能量传递分析法( time resolvedfluorescence resonance energy transfer, TREF or TR-FRET) • 双标记方法 • 原理是在长寿荧光镧系复合物和共振能量受体之间 的长范围能量传递 • 液态条件下进行，不需固定相支持和分离步骤，不 需对试剂进行特殊处理 • 优点：减少背景，使长期存在的供体和受体信号随 时间显示很高的敏感性 • 用于蛋白与蛋白结合分析、受体配体结合分析等 • 用长寿荧光金属铕作供体成分，用另一个荧光分子 XL665 (一个改型别藻蓝蛋白的片断)作为受体进行 了β-分泌酶抑制剂的细胞水平筛选
细胞分子模型
第1节 概述
细胞分子模型与动物模型的区别： 动物模型 • 优点： • 传统的筛选方法 • 直接反映治疗效果、不良反应、毒性作 用 • 预测临床价值、应用前景 • 不足： • 筛选效率低，并非均有疾病模型，动物 个体差异，成本高
细胞、分子水平药物筛选模型 • 优点： • 耗材少 • 药物作用机制明确 • 筛选规模大，高通量筛选 • 已成为药物筛选的主要方法 • 快速、微量、大规模为特征的高通量筛选
第３节 常用技术
1 细胞水平重组技术 • 重组技术是细胞水平高通量常用技术手段 • 经典方法是通过重组基因在宿主细胞基因组 的随机整合而产生稳定细胞株 • 不足：重组基因的定位不可预测，表达水平 受重组位点的影响，基因拷贝数不确定，阳 性克隆的产生率低，筛选时间长等 • 现用游离体载体( episomal vector)：转染 效率高，阳性克隆筛选速度快
第２节 细胞水平药物筛选模型
• 细胞水平药物筛选模型：以细胞功能为 基础的筛选模型 (1) 完整细胞，活细胞自然条件下研究药 物对生命体功能的影响，接近体内的生 化过程，比较准确地了解药物的生物学 特性，提供生物相关信息，一次试验可 获得多个参数的高内涵信息
(2) 着眼于细胞整体的某些功能和信号转导途 径中的其他位点 • 在对每一个分子通路并不完全了解的情况下, 细胞水平筛选是唯一可用的方法 (3) 鉴定分子水平发现的化合物 (4) 观察被筛选样品对细胞的作用, 不反映药 物作用的具体途径和靶标, 只反映药物对细 胞生长过程的综合作用
(3) 多指标、多靶点、多通道检测是现今细胞水平 高通量筛选技术的核心和关键 • 光显微荧光成像技术是进行多指标检测的基础 • 多指标、多靶点检测有助于发现药物作用的新途 径，深入认识药物作用的机制 • 为筛选具有互补的多靶点作用机制的单一治疗药 物提供了手段和工具 (4) 实时动态检测和可视化 • 对活细胞进行荧光标记，荧光成像技术， • 分子水平的实时动态检测和可视化研究 • 自动图像分析和数据量化分析
3 荧光检测分析技术 • 定量读取荧光密度；单次实验中同时获得其他荧光特性， 如荧光寿命、极化、淬灭，提高筛选的有效性，可快速、 多参数地评价样品和靶之间的相互作用 (1)极化荧光( fluorescence polarization, FP) 分析 生物体系中分子间相互作用，根据荧光标记的小分子在 游离和与大分子结合靶标2种状态时的极化荧光值不同 而区分 优点： • 不用分离荧光标记物，反应在均相溶液中进行 • 检测时间不会影响结果 • 高灵敏性、高稳定性、可重复性 • 操作简便，假阴性或假阳性率低 • 用于细胞水平的膜受体如GPCR、核受体调节剂的HTS筛 选，如促肾上腺皮质激素2α亚型受体(CRF2αR)的功能 分析中cAMP的直接检测
4 荧光影像( fluorescence imaging)技术 (1)高内涵筛选( high content screening, HCS) • 指在保持细胞结构和功能完整性的前提下，同 时检测被筛样品对活细胞形态、生长、分化、 迁移、凋亡、代谢途径及信号转导各个环节的 影响，单一实验中获取大量相关信息，确定样 品生物活性和潜在毒性 • 应用高分辨率的荧光数码影像系统，在细胞水 平上检测多个指标的多元化、功能性筛选技术 • 获得被筛样品对固定化或动态细胞产生的多维 立体和实时快速的生物效应信息
(5)细胞模型的材料来源较容易 • 用于药物筛选的细胞：正常细胞、转基因和 病理细胞等 • 多数生物性物质均可通过转基因的方法由细 胞表达 (6)分子生物学和细胞生物学手段 • 特别是基因芯片技术 • 发现疾病有关基因,克隆 • 建立稳定细胞株 • 大规模药物筛选
目前： (1) 微量化，超高通量化 1 536孔板，荧光方 法可达3 456－9 600孔 • 微量化技术是实行超高通量筛选( uHTS)的基 础 • 载体微孔板硬度、自动化加样精度 • 检测系统 • 数据分析系统 (2) 均质检测：一步加入
CellCardTM系统：新的多通道(multip lexed)HCS筛 选技术，由Vitra Bioscience公司开发 • 可在96孔板单孔中实现对多个细胞系或多靶点的同 时检测，是一种基于多通道的全自动影像系统 • 可在单一检测中应用多参数检测，可定量单一细胞 类型中多个细胞内事件或对多个细胞类型实行同一 检测，在获得样品活性的同时得到样品对不同细胞 株上设计的不同靶点的选择性信息 • 关键点为CellCard Carrier微载体技术，允许多种 细胞株在96孔板的同一孔中进行生长并检测 • 优点：增大检测容量，提高检测数据质量，节省时 间，降低成本 • 对细胞培养的要求很高，培养环境必须适合所有被 检细胞株生长
(2)荧光共振能量转移( fluorescence resonance energy transfer, FRET) 指非放射性能量在适当 能量给予体和接受体之间转移 • 当供体激发态能量满足光学和空间上的要求时，其能 量能有效转移给受体，导致受体发射荧光 • 供体和受体空间距离的变化能显著影响能量的有效转 移效率 • 荧光底物设计和人工合成： • 细胞筛选用的β-内酰胺酶(β-lactamase)报告基因 检测系统采用的荧光底物就是基于FRET的原理，合成 底物CCF4，为１分子头孢菌素联上１分子7-羟基香豆 素和１分子荧光素( fluorescein)。当体系无配基激 活时，底物完整，激发香豆素发射530 nm绿光；如加 入所研究受体的特异性配基，报告基因系统激活，表 达β-lactamase，裂解底物，破坏了FRET，激发香豆 素发射460 nm 蓝光。用于GPCR受体-催产素受体 ( hO-TR)的筛选 • 采用FRET原理设计淬灭型底物进行激酶的筛选
优点： • GFP自发荧光，且荧光稳定；不需其他的底 物和辅因子；GFP与其他蛋白嵌合后不影响 其自身荧光特性 • GFP及其变体：用于实时动态研究体内或细 胞水平的蛋白定位和转位，蛋白的降解，蛋 白-蛋白的相互作用，细胞骨架动力学，细 胞周期，检测目的基因表达变化 • β-内酰胺酶，水解荧光能量共振转移 ( FRET)底物CCF4 /AM行定量检测，或作为 核因子调节的指示蛋白，用于受体功能筛选
(5) FMATTM ( fluometric microvolume assay technology) • 由PE Bio system开发 • 基于荧光发光团Cy5，以红色的633nm氦/氖激 光为光源的多孔板扫描技术 • 可有效扣除背景，灵敏度较高、均质的活细 胞检测 • 用于细胞因子调控表达、GPCR、核受体、蛋 白-蛋白相互作用、蛋白-核酸相互作用的功 能性测定 • 如用FMAT技术改良的ELISA 一步法的FLISA技 术