脐带血分离protocol

脐带血分离protocol
2012-3-17 更新
密度梯度离心
1.估算脐血样本的体积并做相应标记；
2.脐带血单个核细胞计数：10μL脐血+190μL3％冰乙酸（稀释20倍），计数
板计数细胞，得出浓度和有核细胞总数；
3.若脐血浓度为≦1×107个/ml，不用稀释，否则用PBS溶液稀释脐血浓度至约
1×107/ml；
4.颠倒几次充分混匀Ficoll-PaguePREMIUM，用移液枪吸取
Ficoll-PaguePREMIUM 15ml至50ml离心管内；
5.小心将30ml稀释的血样品加到Ficoll-PaguePREMIUM上(滴加血液时一定要
轻柔，避免加入的血液与Ficoll液相混合,确保二者分层清晰）；
6.离心：400g，30min，200C，↗Max ↘Slow；
7.用吸管将单个核细胞层移到无菌的离心管中（离心后分为四层,从上至下依次
为:血浆、单个核细胞层、Ficoll、红细胞与多核细胞，注意此时要轻拿轻放，切勿将已分层的液体重新混合。

吸取少量血浆不会影响结果，但需避免吸入大量Ficoll）
单个核细胞计数并留样
1.将收集的单个核细胞均分至新的50ml离心管中，每管10ml,加3倍（30ml）
平衡盐溶液PBS,混匀后离心：400g，10min，200C，↗Max ↘Max，弃上清；
2.先用1mlACK充分重悬，再补加9mlACK，混匀后室温静置10min，添加PBS
溶液至50ml，上下颠倒混匀；
3.离心：400g，10min，200C，↗Max ↘Max，弃上清；
4.先用1mlPBS充分重悬，再补加9mlPBS，并对单个核细胞计数：10μL细胞悬
液+90μL台盼蓝（即稀释10倍，稀释后立即计数）；
5.用无菌进口1.5mlEP管保存脐血筛查用细胞（标注日期、脐血编号），每袋血
样留2份样本，每份4×106个；
6.离心：400g，10min，200C，↗Max ↘Max，弃上清；
磁珠分选
1.
a)若细胞总数＜2×107 ，用100μL磁珠buffer 重悬细胞；
b)若细胞总数为2×107 ～2×108，用磁珠buffer将细胞重悬到终浓度为2×108
个/ml；
c)若细胞总数为2～5×108，用1ml磁珠buffer 重悬细胞；
2.以100μL/ml细胞悬液的比例添加EasySep Positive Selection Cocktail
（e.g.1ml细胞悬液添加100μL Cocktail），混匀细胞，室温静置15min；
3.以50μL/ml细胞悬液的比例添加EasySep磁珠，用枪头上下吹吸至少五次
使溶液混匀（切记不要vortex）；室温静置10min；
4．添加磁珠buffer使细胞悬液总体积为2.5ml，用枪头上下吹吸2～3次混匀，
然后将细胞悬液转移至流式管中，，并在管壁上标注2.5ml刻度线。

将流式管插入磁铁中静置5min；
5.拿起磁铁，用手颠倒磁铁及其内部流式管将上清液（CD34阴性细胞）倒入
50ml离心管中，保持倒置动作2～3秒，然后将磁铁转回竖直状态（当仍有液滴停留在管口时，切记不要摇动磁铁使液滴流出）；
6.将流式管取出，重复4～5步骤两次（总共需要使细胞悬液在磁铁中静置5min
×3=15min）；
细胞冻存
1.用1ml磁珠buffer将流式管中CD34阳性细胞重悬；
2.分别对CD34阳性和阴性细胞计数，一般情况需用台盼蓝稀释10倍：10μL
细胞悬液+90μL 1×台盼蓝；
3.离心：400g，10min，200C，↗Max ↘Max，弃上清；
4.冻存：solutionⅠ（IMDM）+solutionⅡ（80％FBS+20％DMSO）重悬。

CD34+
细胞数＜4×106 只冻一管，细胞数＞4×106 按4×106 个/管冻存。

CD34-细胞＜4×107 只冻一管，细胞数＞4×107 按4×107 个/管冻存置于冻存盒中，-800C冻存，后移至液氮中。

注：
●磁珠分选时间优化：因为只有一个磁铁，当有多个脐血样本，待第一个样本
加完cocktail室温静置15min后，再紧接着向第二个样本中加cocktail，同时向第一个样本中加入磁珠，而不要将cocktail同时加入各个脐血样本中。

当第一个样本在磁铁上静置5min×3=15min后，第二个样本也正好完成加入磁珠后静置10min的步骤，即第一个样本磁珠分选完成后，第二个样本也正好能上磁铁，其他的样本按上述方法依次类推。

●磁珠buffer配制：PBS+2％FBS+1mMEDTA
如配制50ml磁珠buffer,需要FBS1ml,0.5MEDTA 100μL,用PBS定容到50ml。

●冻存管上的标注务必详细准确，字迹清晰。