微生物鉴定之生化实验大全

微生物鉴定之生化实验大全
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不同的细菌具有各自的独特的酶系统，因而对底物的分解能力各异，其代谢的产物也不相同。

这些代谢产物又具有不同的生物化学特性，可利用生物化学的方法测定这些代谢产物以鉴定细菌。

掌握各种生化反应的原理和应用是细菌鉴定的基础。

生理生化特性的测定主要根据Shirling＆Gottlieb《International Journal of Systematic Bacteriology》中鉴定的有关试验。

（一）碳水化合物代谢实验：
糖（醇、苷）类发酵实验
（1）原理：细菌分解糖的能力与该菌是否含有分解某种糖的酶密切相关，故分解糖的能力各不相同，细菌分解糖类后的终产物亦不一致，在含糖培养基中加入指示剂，若细菌分解糖则产酸或产酸产气，使培养基颜色改变，从而判断细菌是否分解某种糖或其他碳水化合物。

（2）基本培养基：在培养基中加入0.5%-1%的糖类（单糖、双糖、或者多糖）、醇类（甘露醇、肌醇）苷类（水杨苷、菊糖等）。

培养基可为液体、半固体、固体或微量生化管几种类型。

（3）实验方法：取某一种细菌的24h纯培养物分别接种到葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖等培养基内，37℃培养24h，观察结果并记录。

（4）结果判定
如果接种进去的细菌可发酵某种糖或醇，则可产酸，使培养基由紫色变成黄色，如果不发酵，则仍保持紫色。

如发酵的同时又产生气体，则在微量发酵管顶部积有气泡。

（5）应用：是鉴定细菌最主要最基本的实验，特别是对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。

氧化型与发酵型(O/F)的测定
（1）原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必需有氧的参加的，称为氧化型，细菌在分解葡萄糖的过程中，可以进行无氧降解的，称为发酵型。

发酵型细菌无论在有氧或者无氧的环境中都能分解葡萄糖。

不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。

这在区别微球菌与葡萄球菌、肠杆菌科成员中尤其有意义。

（2）培养基：培养基蛋白胨2g，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.3g，葡萄糖10g，琼脂3g，1％溴麝香草酚蓝3mL，蒸馏水1000mL。

将蛋白胨、盐、琼脂和水混合，加热溶解，校正pH至7.2，然后加葡萄糖和指示剂，加热溶解；分装试管，3～4mL/管；115℃，高压蒸汽灭菌20min，取出后冷却成琼脂柱。

（3）实验方法：挑取18～24h的幼龄斜面培养物，穿刺接种，每种细菌接种两管，于其中1管覆盖1mL灭菌的液体石蜡，37℃培养24小时或更长时间。

（4）结果判定。

β一半乳糖苷(ONPG)实验
（1）原理：有的细菌可以产生β一半乳糖苷酶，能分解邻－硝基酚－β－D－半乳糖苷，而生成黄色的邻－硝基酚，在很低浓度下也可以检测出。

（2）培养基：邻硝基酚β-半乳糖苷0.6g，0．01mol／L pH7．5磷酸缓冲液1 000mL，pH 7．5的灭菌1％蛋白胨水300mL。

先将前两种成分混合溶解，过滤除菌，在无菌条件下与1％蛋白胨水混合，分装试管，每管2～3mL，无菌检验后备用。

（3）实验方法：取一环细菌纯培养物接种在ONPG培养基上置37℃培养1～3h或24h，如有β－半乳糖苷酶，会在3h内产生黄色的邻硝基酚；如无此酶，则在24h内不变色。

七叶苷水解实验
（1）原理：有的细菌可以将七叶苷分解为七叶素和葡萄糖，七叶素与培养基中的枸橼酸铁的二价铁离子反应，生成黑色的化合物，使培养基呈黑色。

（2）应用：主要用于肠球菌与其它链球菌的鉴别，前者阳性，后者阴性，也可用于革兰氏阴性杆菌及厌氧菌的鉴
别。

甲基红实验
（1）原理：细菌分解培养基中的葡萄糖产酸，当产酸量大，使培养基的pH降至4．5以下时，加入甲基红指示剂而变红，为甲基红试验阳性。

若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其它物质（如醇、酮、醛、气体和水等）则培养基的PH值仍在PH6.2以上，故加入甲基红试剂呈黄色，为阴性。

（2）实验方法：一种细菌的24h培养物，接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，置37℃培养48～72h，取出后加甲基红试剂3～5滴，凡培养液呈红色者为阳性，橙色者为可疑，黄色者为阴性。

（3）应用：主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌，前者为阳性后者为阴性。

V-P实验
（1）原理：有些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸, 丙酮酸脱羧产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境中，被空气中的氧氧化为二乙酰,二乙酰与培养基内蛋白胨中精氨酸所含的胍基发生反应生成红色的化合物。

若培养基中的胍基含量过少，则可加入少量含胍基的化合物等。

（2）V-P 试剂：肌酸0.3%或原粉，40%的NaOH溶液。

（3）实验方法：接种实验菌于葡萄糖蛋白胨水培养基(与甲
基红实验相同)中，每次两个重复，置适温培养2-6d，取培养液和40%NaOH等量相混，加入少许肌酸，10min如培养液出现红色，即为实验阳性反应，有时需要放置更长时间才出现红色反应。

（4）应用：本实验常与甲基红实验一起用，因为前者阳性的细菌，后者通常为阴性。

(二) 蛋白质和氨基酸的代谢实验
明胶液化实验
（1）原理：某些可以产生一种胞外蛋白水解酶(明胶酶)，能使明胶分解为氨基酸，使明胶失去凝固能力而液化，因而使半固体的明胶培养基成为流动的液体。

（2）实验方法：取18-24h的斜面培养物穿刺接种，并有两支未接种的空白对照。

(3) 结果观察：于30℃培养20天后观察，明胶液化的为阳性。

由于室温下明胶培养基呈液状，因此在观察结果时，应将其放置于4℃的冰箱中30分钟后拿出观察。

若明胶仍能全部凝固，为阴性，有部分或全部不能凝固为阳性。

吲哚实验
（1）原理：某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸产生吲哚，当加入吲哚试剂(对二甲氨基苯甲醛)后则形成红色的玫瑰吲哚。

（2）培养基：蛋白胨水培养基。

（3）实验方法：将待检菌接种于富含色氨酸的蛋白胨水培养基中，35℃孵育24~48h，沿试管壁慢慢加入吲哚试剂，观察结果。

（4）结果：于两液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性。

（5）应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定，如大肠埃希菌与产气肠杆菌，肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌等的鉴别。

硫化氢试验
（1）原理：某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸产生硫化氢，硫化氢遇亚铁离子或铅离子则结合形成黑色沉淀物(硫化铁或硫化铅沉淀)。

（2）实验方法：将待检菌穿刺接种于醋酸铅培养基中，于35℃孵育24h -48h，观察有无黑色沉淀出现。

（3）结果：培养基变黑为阳性，不变为阴性。

（4）应用：主要用于鉴别肠杆菌科中属及种的鉴别，如沙门菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、爱德华菌属等为阳性，其它菌属大多为阴性。

但沙门菌属中亦有部分硫化氢阴性菌株，如甲型副伤寒、仙台、猪霍乱沙门菌等。

尿素分解试验
（1）原理：某些细菌具有尿素分解酶，能分解尿素产生大量的氨，使培养基呈碱性。

（2）培养基：尿素培养基。

（3）实验方法：将待检菌接种于尿素培养基，于35℃孵育18~24h小时观察结果。

（4）结果：培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，不变为阴性。

（5）应用：主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定。

奇异变形杆菌和普通变形杆菌脲酶阳性，另外雷氏普罗威登菌和摩根菌为阳性，而斯氏和产碱普罗威登菌阴性。

苯丙氨酸脱氨酶试验
（1）原理：测定细菌是否产生苯丙氨酸脱氨酶。

细菌产生的苯丙氨酸脱氨酶使苯丙氨酸脱氨后生成苯丙酮酸，加入氯化铁试剂后产生绿色反应。

（2）培养基：苯丙氨酸琼脂培养基。

（3）实验方法：将待检菌大量接种入苯丙氨酸琼脂培养基中，35℃孵育18~24h，滴加10% 三氯化铁试剂3~4滴，自斜面上方流下。

（4）结果：有绿色出现为阳性。

应立即观察结果，延长反应时间会引起退色。

（5）应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。

变形杆菌属、普罗威登菌属、摩根菌属均为阳性，肠杆菌科其它细菌均为阴性。

氨基酸脱羧酶试验
（1）原理：某些细菌可产生氨基酸脱羧酶，能分解氨基酸使其脱羧生成胺和二氧化碳。

由于胺的生成使培养基变为碱性，可用指示剂指示出来。

（2）培养基：氨基酸脱羧酶培养基和氨基酸对照培养基。

（3）实验方法：将待检菌分别接种于1支氨基酸(赖氨酸，鸟氨酸或精氨酸)脱羧酶试验管1支氨基酸脱羧酶对照管(无氨基酸)，各覆盖至少12.5px高度的无菌石蜡油，35℃孵育1~4d，每日观察结果。

（4）结果：对照管应为黄色，若为溴甲酚紫指示剂，则测定管呈紫色则为阳性，若测定管呈黄色为阴性。

若对照管呈现紫色则试验无意义，不能做出判断。

（5）应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴别。

如沙门菌属中除伤寒和鸡沙门菌外，其余沙门菌的赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶均为阳性。

志贺菌属除宋内和鲍氏志贺菌外，其他志贺菌均为阴性。

（三）碳源和氮源的利用实验
唯一碳源利用实验
（1）原理：在基础培养基只提供一种待检测碳源，若菌株生长则表明菌株能以此种碳源为唯一碳源，否则不能。

（2）培养基：基本培养基：(NH4)2HPO4 1 g；NaCl 1 g；MgSO4·7H2O 0.2 g；KH2PO4 0.5 g；琼脂20 g；蒸馏水1000 mL；pH 7.0-7.2。

各种碳源的终浓度如下：糖类及其衍生物(醇类，糖苷类等)：1%，w/v；多醇和甘油：1%，w/v；苯甲酸盐，二酸盐，其它单酸盐：0.1%，w/v。

糖类及其衍生物和多醇要求过滤除菌，盐类可加入培养基一起灭菌。

（3）实验方法：将纯的菌株接种到培养基后培养
14~28d，观察其生长情况，以不加碳源的培养基作对照。

能够生长为阳性。

唯一氮源利用实验
（1）原理：在基础培养基只提供一种待检测氮源，若菌株生长则表明菌株能以此种氮源为唯一碳源，否则不能。

（2）培养基：基础培养基：D-Glucose 1 g；
MgSO4·7H2O 0.05 g；NaCl 0.05 g；FeSO4·7H2O 0.001 g；KH2PO4 0.01 g。

不同氮源按0.5%的浓度加入。

（3）实验方法：将纯的菌株接种到培养基后培养
14~28d，观察其生长情况，以不加氮源的培养基作对照。

能够生长为阳性。

（四）各种酶类实验
氧化酶试验
（1）原理：氧化酶(即细胞色素氧化酶)，是细胞色素氧化酶系统中的最终呼吸酶。

具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物。

因此，本试验结果与细胞色素C
的存在有关。

（2）实验方法：菌落法：直接滴加试剂于被检菌落上；滤纸法：取洁净滤纸一小块，蘸取菌少许，然后加试剂；试剂纸片法：将滤纸片浸泡于试剂中制成试剂纸片，取菌涂于试剂纸上。

（3）结果：细菌在与试剂接触10秒内呈深紫色，为阳性。

无色为阴性。

为保证结果的准确性，分别以铜绿假单胞菌和大肠埃希菌作为阳性和阴性对照。

（4）应用：主要用于肠杆菌科细菌和假单胞菌属的鉴别，前者阴性，而后者阳性。

奈瑟菌属、莫拉菌属细菌也呈阳性反应。

过氧化氢酶试验(触酶试验)
（1）原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢成为水和原子态氧，继而形成氧分子，出现气泡。

（2）实验方法：取洁净玻片1张，用接种环挑取细菌，加3%过氧化氢数滴，立即观察结果。

（3）结果：若立即出现大量气泡为阳性。

无气泡为阴性。

（4）应用：革兰阳性球菌中，葡萄球菌和微球菌均产生过氧化氢酶，但链球菌科阴性，故该试验常用于革兰阳性球菌的初步分群。

硝酸盐还原实验
（1）原理：硝酸盐还原反应包括两个过程：一是在合成代
谢过程中，硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨，再由氨转化为氨基酸和细胞内其它含氮化合物；二是在分解代谢过程中，硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。

硝酸盐还原过程可因细菌不同而异。

有的细菌仅使硝酸盐还原为亚硝酸盐，如大肠埃希菌等；有的细菌可使其还原为亚硝酸盐和离子态的铵；有的细菌能使硝酸盐或亚硝酸盐还原为氮，如假单胞菌；有的细菌还可以将其还原产物在合成性代谢中完全利用。

（2）实验方法：将待检菌接种于硝酸盐培养基(内含小倒管)中，35℃孵育1~4d。

将甲、乙等量混合液(用时混合)(约0.1ml)加于试管内，立即观察结果。

（3）结果：出现红色为阳性反应。

若加入试剂后无颜色反应，可能是：①硝酸盐没有被还原，试验阴性；②硝酸盐被还原为氨和氮等其他物质而导致假阴性结果，这时应在试管内加入少许锌粉，如出现红色则表明试验确实为阴性。

若仍不产生红色，表明试验为假阴性。

若要观察是否有氮气产生，可于培养基管内加1只小导管，有气泡产生，则表示有氮气生成。

（4）应用：本试验广泛用于细菌鉴定。

肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐;铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌等假单胞菌属均可产生氮气;有些厌氧菌如韦荣菌等试验也为阳性。

淀粉酶实验
（1）原理：有些细菌具有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外淀粉酶，淀粉酶可以使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，淀粉水解后遇碘不在变蓝。

（2）培养基：淀粉琼脂培养基。

（3）实验方法：在淀粉培养基上接种实验菌株后，30℃培养1-2周后将平板取出，滴加少量卢戈氏碘液于平板上。

观察菌苔周围的培养基有无色透明圈出现。