GST pull-down实验技术

transferase) 融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体
上的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合 蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合 物混合时就可被吸附而分离。
Western Blot
GST pull-down原理：


基本原理：
假定A蛋白和B蛋白可能有相互作用，将纯化的融合GST 标签的A蛋白和纯化的B蛋白以及能特异结合GST的 Sephrose 4B beads 孵育一定时间，充分洗涤未结合的蛋 白，煮沸beads进行SDS-PAGE电泳，通过Western blotting 检测，可以看见GST-A和B分别对应的条带,表明A和B因 相互作用而被GST-A pull-down；而GST对照组始终仅有 一个条带。

7、12000 rpm/min，4℃离心10min，将上清转移至新的离心管， 加DTT至终浓度1mmol/L。
Western Blot
1.2 GST-A融合蛋白的纯化

1、 在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积的50%Glutathione
Sepharose 4B，4℃缓慢摇动，反应30~60min；
4℃缓慢摇动，反应30~60min；

2、 3000 rpm/min，4℃离心5min，弃上清。该Ni-NTA珠子上结 合了His-B融合蛋白。

3、在管中加入预冷的200微升Wash Buffer（沿壁加入，小心勿 剧烈，以免打断珠子与蛋白的连接），轻晃悬浮珠子，将珠子
洗涤一次， 3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清;

4、重复步骤3三次（最后一次以小枪头吸净珠子表面液体，吸 净但不吸走珠子），即获得结合有GST-A融合蛋白的Sepharose；
Western Blot
1.2 GST-A融合蛋白的纯化

5、如果用于检测，在Sepharose 加入15~20微升1×蛋白电泳上
样缓冲液，于沸水中煮5~10min。

4、加入预冷的200微升缓冲液对Sepharose进行洗涤（沿壁加入， 不要直接冲击Sepharose，随后轻柔晃动，使Sepharose重悬即可;
Western Blot
3. 体外蛋白的结合

5、3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清（注意不要扰动底层
的Sepharose）；

GST pull-down 实验技术
主讲：段志强
Western Blot

GST pull-down原理 GST pull-down实验流程

Western Blot
GST pull-down原理：

GST pull down 是一种在体外研究蛋白质相互作用的
方法。

原理：
利用DNA重组技术将已知蛋白与GST (Glutathione S

4、重复步骤3三次（最后一次以小枪头吸净珠子表面液体，吸 净但不吸走珠子），即获得结合有His融合蛋白的Ni-NTA；
Western Blot
1.1.2 (His)-B融合蛋白的纯化

5、加入适量体积Elution Buffer，不必吹打，晃动洗脱蛋白。
3000 rpm/min，4℃离心5mຫໍສະໝຸດ Baidun，吸净上清，His-B融合蛋白即在
（如需要该步沉淀能保存在-80℃）；
Western Blot
1.1 GST-A融合蛋白的表达

5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬，并加入PMSF；

6、冰上超声沉淀重悬液：5S 间隔5S 至悬液透明（一般可容性
蛋白：10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬液超声6~9min可透明）;
的真核表达载体上，进行细胞转染；

2、转染后36~48h，取出细胞，用预冷PBS洗2遍; 3、加入适量体积1×RIPA（含PMSF），于冰上或4℃裂解细胞 10~30min;

4、 12000 rpm/min，4℃离心5min，取上清保存在-80℃或进行
下一步实验。
Western Blot
3. 体外蛋白的结合

1、 将结合有GST-A融合蛋白的Sepharose 4B悬浮在适量体积缓
冲液中，加入20~30微升含有B蛋白的溶液（原核表达或真核表
达产物），同时采用结合有GST蛋白的Sepharose 作为阴性对照；

2、 在水平摇床上4℃晃动4~8h； 3、3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清（注意不要扰动底层 的Sepharose）；

2、将过夜培养物按1:100比例接入200ml LB(Amp＋) ，220 rpm， 30℃培养至OD600=0.4-0.6;

3、以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋 白（IPTG 0.5mM，20℃，200 rpm培养10~16小时）;

4、诱导适当时间后，4℃，5000 rpm/min离心10min后弃上清

6、12000 rpm/min离心5min，取上清做SDS-PAGE和WB检测。
Western Blot
2. B蛋白的制备
B蛋白的来源：

1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达与纯化
1.2 (HA/Myc/Flag)-B融合蛋白的真核表达

Western Blot
1.1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达

1、活化冻存菌种His和His-B：按1: 50比例将表达蛋白的冻存菌
液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；

2、将过夜培养物按1:100比例接入200ml LB(Amp＋) ，220rpm， 30℃培养至OD600=0.4-0.6;

3、以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋 白（IPTG 0.5mM，28℃，200 rpm培养10~16小时）;
Western Blot
1. GST-A融合蛋白的制备

1.1 GST-A融合蛋白的表达

1.2 GST-A融合蛋白的纯化
Western Blot
1.1 GST-A融合蛋白的表达

1、活化冻存菌种GST和GST-A：按1: 50比例将表达蛋白的冻存
菌液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
蛋白：10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬液超声6~9min可透明）;

7、12000 rpm/min，4℃离心10min，将上清转移至新的离心管， 加DTT至终浓度1mmol/L。
Western Blot
1.1.2 (His)-B融合蛋白的纯化

1、 在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积的Ni-NTA珠子，

4、诱导适当时间后，4℃，5000 rpm/min离心10min后弃上清
（如需要该步沉淀能保存在-80℃）；
Western Blot
1.1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达

5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬，并加入PMSF；

6、冰上超声沉淀重悬液：5S 间隔5S 至悬液透明（一般可溶性
Western Blot
GST pull-down 示意图
Western Blot
GST pull-down应用

用于验证两个已知蛋白的相互作用 筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白
Western Blot
GST pull-down流程

GST-A融合蛋白的制备
• B蛋白的制备
• 体外蛋白的结合 • Western blot检测
上清中；

6、如果用于检测，取10微升样品，加入10微升1×蛋白电泳上 样缓冲液，于沸水中煮5~10min；

7、12000 rpm/min离心5min，取上清做SDS-PAGE和WB检测。
Western Blot
1.2 (HA/Myc/Flag)-B融合蛋白的真核表达

1、将编码B蛋白的ORF克隆到编码标签蛋白（如HA/Myc/Flag）
6、重复步骤5三次;
7、吸干Sepharose上面的液体后，加入20~30微升1 ×蛋白电泳
上样缓冲液，沸水浴4min，冻存于-20℃备用；

8、做SDS-PAGE和Western blot检测另一个蛋白。
Western Blot
4. Western blot检测
谢谢大家！

2、 3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清。该Sepharose上结合 了GST-A融合蛋白。

3、在管中加入预冷的200微升PBS（沿壁加入，小心勿剧烈，以 免打断珠子与蛋白的连接），轻晃悬浮珠子，将Sepharose洗涤
一次， 3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清;