乙醇热回流提取工艺

目的探讨柑桔皮总黄酮的提取及鉴别方法,以充分利用柑桔皮植物资源。方法采用改进的乙醇热提取工艺，对影响总黄酮提取率的主要因素进行了分析,并对所提取的黄酮类物质进行验证。结果柑桔皮提取黄酮类成分的最佳条件为：乙醇浓度70%；提取温度70℃；料液比1∶10；提取时间70 min；提取3次。在该条件下提取率可达到3.02%。结论该方法是提取柑桔皮黄酮类物质的有效途径。

【关键词】总黄酮；提取；柑桔皮；提取条件

Abstract:ObjectiveTo establish the methods for the extraction and identification of flavonoids from the leaves of Ficus microcarpa L. f ..MethodsMain factors influencing the extraction of flavonoids from the leaves of Orange Peel . were studied by single factor experiments.ResultsOptimized conditions for the extraction of flavonoids was obtained as ethanol concentration70% ；extraction temperature 70℃；material to solvent 1∶1 0，extraction time 70 min，and extraction for three times . Yield of total flavonoids reached 3.02% under this condition.ConclusionThis method is ideal to withdraw the flavonoids of Orange Peel.

Key words:Flavonoids； Extraction； Orange Peel； Extraction conditions

黄酮类(flavontes)化合物是植物光合作用产生的一大类化合物，已知的此类化合物约有两千多种，有以黄酮(2-苯基色酮)为母核的一类黄色色素和黄酮的同分异构体及其还原产物，还包括黄酮醇类、异黄酮类、儿茶素类、双黄酮类及其衍生物。柑桔是我国一大果品资源，1998年我国柑橘产量达1 010万吨，到2005年产量达到1 200万吨。而桔皮占柑桔的20%～25%，每年约有240～300万吨的桔皮生产出来［1］。桔皮中含有黄酮类化合物、叶黄素和芳香油等物质，具有理气、健脾、化痰等功效。研究表明，黄酮类有效成分对治疗冠心病、老年性痴呆、脑血栓、神经系统疾病和消除自由基、抗炎、抑菌、抗癌等方面有显著效果,无毒副作用,并以此开发出多种药品和保健食品［1～7］。

黄酮类作为桔皮的主要药用成分，改进桔皮总黄酮提取工艺,对降低提取成本,提高和稳定提取效率显得尤为重要。本实验以广西桔皮为原材料,采用改进的乙醇热回流提取工艺，旨在最佳条件下获得最佳提取效果。

1 器材

自然干燥的桔皮、无水乙醇(AR) 、95 %乙醇(AR) 、2550紫外可见分光光度计(日本岛津)、芦丁对照品(中国药品生物制品检定所) 。RE-2000 型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，SHB-Ⅲ循环式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)。

2 方法

2.1 桔皮总黄酮成分提取工艺及实验安排研究桔皮中黄酮类化合物提取方法时，一般采用溶剂直接提取后浓缩。而笔者在实验过程中发现，桔皮叶中所含的脂溶性色素等物质会使显色法测定总黄酮时产生浑浊现象，造成很大误差。因此，本实验采用石油醚脱脂，冷却静置，过滤除去叶绿素后再测定总黄酮（工艺如下）。

桔皮干粉——石油醚脱脂——冷却静置——过滤沉淀——除尽过滤——滤液——测定总黄酮并计算提取率

2.2 总黄酮的鉴别

2.2.1 三氯化铝反应取样品溶液点在滤纸上，滴加1%三氯化铝乙醇溶液，吹干。在可见光下呈淡黄色，在紫外光下有明显黄色荧光斑点。

2.2.2 乙酸镁反应取样品溶液点在滤纸上，滴加1%乙酸镁甲醇溶液，加热干燥，紫外光下呈黄褐色斑点。

2.3 总黄酮的测定

2.3.1 测定方法依据以芦丁为对照品测定柑桔皮中总黄酮的含量，加入铝离子试剂，同时控制适宜pH值，使黄酮化合物与铝盐形成络合物，在可见光区能获得稳定的特征吸收峰。

2.3.2 对照品溶液制备精密称取芦丁对照品0.008 0 g , 60%乙醇定容至200 ml ,制成40 μg·ml-1 贮备液备用。

2.3.3 供试品溶液制备将各正交实验所得提取液合并，回收滤液，每个样品液中取0.5 ml 加显色剂60%定容置25 ml量瓶中，精密移取0.5 ml定容置10 ml量瓶中备用。

2.3.4 标准曲线的制备分别精密移取芦丁对照品储备液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ，6.0，7.0 ml，于25 ml量瓶中，加入0. 50 mol·L-1NaNO2 溶液1. 00 ml , 摇匀, 5 min 后, 加入0. 30 mol·L-1 AlCl3 溶液1.00 ml , 摇匀, 加入1. 00 mol·L-1NaOH 溶液5.00 ml , 60% 乙醇水溶液定容至刻度, 配制成系列芦丁乙醇标准溶液。用1 cm比色皿在波长500 nm 处测其吸光度。以吸光度值为纵坐标，质量浓度为横坐标进行回归，得方程A=0.013 4C-0.002 7，r=0.999 3。

3 结果

3.1 温度对总黄酮提取率的影响随着温度的升高，溶剂的粘度减小，分子运动速度加快，回流提取液的扩散系数增加，促使浸提速度加快。固定乙醇浓度70%、料液比1∶10，提取时间1 h，变化提取温度。不同提取温度对总黄酮提取率的影响见图2。从图2可以看出，温度到达70℃之前，随温度的升高，总黄酮提取率增加非常明显；但超过70℃后增长缓慢，75℃提取率达到最大，温度超过80℃时，提取液的活性成分将会遭到破坏。因此，温度最好不要超过75℃，应选70℃为宜。另外，温度过高，易造成溶剂的损失，提取效果反而下降。

3.2 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响黄酮类物质易溶于丙酮、水、醋酸乙酯、乙醇等极性较大的溶剂中。乙醇无毒，对天然药材细胞具有穿透能力，对许多成分溶解性能好且能抑制酶的催化作用，因此，本研究采用乙醇为提取溶剂。在温度70℃下，料液比1∶10，提取1 h，回流提取1次时，乙醇浓度对总黄酮的提取效果见图3。乙醇浓度在70%以前，提取率总是随着乙醇浓度的增加而增加，之后慢慢变小。可能是由于总黄酮包括黄酮苷和苷元，黄酮苷在水和乙醇中都易溶解，但苷元的水溶性较差，而70% 乙醇对黄酮苷和苷元都有较好的溶解性。因此，70%的乙醇提取桔皮总黄酮的效果最好。

3.3 提取时间对总黄酮提取率的影响固定乙醇浓度70%，提取温度70℃，回流提取1次，料液比1∶10，不同提取时间对总黄酮提取率的影响见图4。提取时间决定着生产的周期，是生产工艺研究中一个十分重要的影响因素，它决定着生产成本和能源的消耗。从图4可以看出，黄酮类化合物的提取率在70 min以后增长趋于平缓。时间过长，延长生产周期，会增加生产成本和能源消耗。所以，提取时间以70 min为宜。

3.4 料液比对总黄酮提取率的影响固定乙醇浓度70%，提取温度70℃，回流提取1 h，回流提取1次，变化料液比，不同料液比对总黄酮提取率的影响见图5。从图5可以看出，随着溶剂量的增加，总黄酮的提取率逐渐升高，到10倍量时基本上达到最高，一般来说，料液比越高，提取率也越高。在本实验中，黄酮的提取率随料液比的增加逐步升高，到1∶10基本达到最大值，随后则变化不大。但是料液比过大，给后处理工序增加困难，而且增加生产成本，在保证提取效果的同时，应尽量减少溶剂用量和降低蒸发浓缩负荷，因此料液比以不超过1∶10为宜。

3.5 提取次数对总黄酮提取率的影响固定乙醇浓度70%、提取时间1 h，料液比固定1∶10，温度70℃，变化提取次数。不同提取次数对总黄酮提取率的影响见图6。从图6中可以看出，回流提取次数的增加，总黄酮的提取率增加。当提取1次时明显不如浸提3次的效果好。浸提3次以上时，它们的提取率增加缓慢，效果不明显。随浸提次数增加，其它杂质的溶出增加量也会有所增加，增加溶剂的回收和造成溶剂的损失，且生产周期增加，这是不经济的。因此，桔皮总黄酮的回流提取次数以3次为宜。

4 结论

采用改进的提取工艺,以乙醇为溶剂提取桔皮叶中的黄酮类物质，工艺上增加对脂溶性成