四氯化碳诱发大鼠肝脏蛋白质表达变化的分析
腹腔注射40%四氯化碳加食用白酒制备肝硬化大鼠模型
腹腔注射40%四氯化碳加食用白酒制备肝硬化大鼠模型发表时间：2017-02-20T16:02:02.513Z 来源：《医药前沿》2017年1月第3期作者：陈菲1 王建美1 盛柳青1 裘颖儿2[导读] 肝硬化是临床最常见的慢性肝病，在欧美等发达国家，因肝硬化致死人数仅次于恶性肿瘤、心血管病。
（1金华职业技术学院医学院浙江金华 321000；2金华食品药品检验所浙江金华 321000）【摘要】目的：腹腔注射40%四氯化碳加食用白酒制备肝硬化大鼠模型。
方法：40只雄性SD大鼠随机分为模型组(n=30)和对照组(n=10)。
模型组按2ml/kg剂量腹腔注射40%四氯化碳食用油溶液，每周2次，连续7周，对照组注射等量生理盐水，分别于4周末和7周末检测模型组大鼠肝功能及组织病理学变化。
结果：模型组大鼠血清肝功能丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶显著增高，至第7周时可观察到大鼠肝组织出现结节状增生的假小叶，为典型肝硬化病理表现。
模型组动物成活率为75%，造模成功率为81%。
结论：该方法可成功地建立大鼠肝硬化实验模型，可用于相关实验研究。
【关键词】四氯化碳；腹腔注射；大鼠；肝硬化；食用白酒【中图分类号】R965.3 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）03-0077-02肝硬化是临床最常见的慢性肝病，在欧美等发达国家，因肝硬化致死人数仅次于恶性肿瘤、心血管病、脑血管病和意外事故，居死亡原因第5位，在美国中年人中则为位居第4位的死亡原因。
国内每年死于肝硬化及并发症的患者达50万，主要原因是病毒性肝炎肝硬化导致[1-2]。
四氯化碳是重要的化工原料和有机溶剂，对肝、肾有严重损害作用，其可在体内转变为自由基，扰乱肝细胞膜上类脂质的代谢，引起肝细胞坏死，是经典的实验性肝损伤动物模型所用外源性化合物。
本实验通过腹腔注射四氯化碳加食用白酒制备肝硬化大鼠模型，以期为研究治疗肝硬化的药物提供实验动物模型。
针刺对四氯化碳致大鼠肝纤维化中PPARγ表达的影响
鼠实验性肝 纤 维 化 ， 察针 刺 对 肝功 能 指标 以及关 键 因子 观 Ｐ Ａ ＾的蛋 白与基 因表达是否产生影 响。 Ｐ Ｒｙ
１ 材料 与 方 法
伤之后 组 织 修 复 过 程 中 的代 偿 反 应 ， 现 为肝 星 状 细 胞 表 （Ｓ） Ｈ Ｃ 增殖活化并导致细胞外 基质 （ Ｃ 的大 量沉积 ， 脏 Ｅ Ｍ） 肝
１２ 试剂 ．
四氯化碳 为国产分 析纯 、 橄榄 油 （ 山东鲁花 集 团
化 。
１ １ 动物 分 组 ．
清洁级 Ｓ Ｄ大 鼠 ４ ６只 ， 性 ， 重 （ ０ 雄 体 ２０±
２ ） ， 由上 海斯 莱克 公 司 提供 ， 可证 号 ： Ｃ Ｋ（ ） ０７ ０ ｇ（ 许 Ｓ Ｘ 沪 ２０— ００ ） ０ ５ 给与标准的光照周期 （４ｈ光照 、０ｈ黑夜 ） 室内温度 １ １ ，
ｃｕ ｉ ｎ Ａｃ ｐ ｎ ｔｒ ａ ｎ ａ ｃ ｈ ｘ ｒ ｓ ｉｎ ｏ Ｐ ｉ ｉ ｒ ｔ ｉ ｅ ｉｓ ｅ ｎ ｈ ｒ ｂ ｎ ｉ ｉ ｈ ｐ ｔ ｉ ｒ ｇ ｎ ｓｓ ｌ ｓｏ ｕ ｕ ｃｕ ｅ ｃ ｎ ｅ ｈ ｎ ｅ ｔ ｅ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｆＰ ＡＲ ｎ ｆｂ ｏｉ ｌ ｒｔ ｕ ｓａ ｄ ｔ ｅ ｅ ｙ ｉ ｈ ｂｔ ｅ ａｉ ｆ ｏ ｅ ｅ ｉ ． ｃ ｖ ｓ ｃ ｂ Ｋｅ ｒ ｓ ａ ｕ ｕ ｃｕ ｅ ｅ ａ ｉ ｆ ｒ ｓｓ ｅ ｏ ｉｏ ｒ ｌ ｅ ａｏ — ｃｉ ａｅ ｅ ｅ ｔ ｒ ｙ ｗｏ ｄ ： ｃ ｐ ｎ ｔ ｒ ；ｈ ｐ ｔ ｂ ｏ ｉ ；ｐ ｒ ｘｓ ｍｅ ｐ ｏｉ ｒｔ ｒａ ｔ ｔｄ ｒ ｃ ｐ ｏ － ｃｉ ｆ ｖ
四氯化碳致肝硬化大鼠高同型半胱氨酸水平和PCNA基因表达升高的实验研究
昆 明 医 学 院 学 报
２Ｏ 。（ ） １ ５ Ｏ ８ ６ ：ｌ —１
ＣＮ ３—１ ４ ／Ｒ ５ ０９
Ｊ ｕ ａ ｆＫｕ ｌ ｇ Ｍ ｅ ｉａ ｌ ｅ ｓｔ ｏ ｍ ｌ０ ｍｌ ｎ ｄｃ ｌ ｉ ｒｉｙ ｉ ＵｌＶ
四氯化碳 致肝硬化大鼠高同型半胱 氨酸水平和 Ｐ Ａ基 因表达升高 ＣＮ 的 实 验研 究
ＣａＩ ． ｂ０ｎ ｔ ａｃ ０ｒ ｄｅ Ｔｅ ｒ ｈｌ ｉ
ＭＡ ａ Ｌ ｎ—ｑ ｎ ｉ ｇ”， Ｇ ＡＯ Ｓ ｕ ｈ ｎ—ｙ ， ＨＵＡＮＧ Ｙｏ ｕ ｕ—ｇ ａ ｇ∞， Ｚ ｕｎ ＨＯＵ Ｗ ｅ ， Ｚ ｅ ｇ—ｇ ｎ ， ｉ ０Ｕ Ｃｈ ｎ ａｇ
Ｌ ｈｕ— ｄ ＩＳ ｅ３ ）
ｌｖ ｌ ０ ｓａｈ０ ｅ ｓｎｈ ｓ ｎ Ｃ ｒ ｅｅ ｔｄｂ — Ｃ Ｒｅ ｕｔ Ｉ１ ｖ ｌ ｆ ｌｓ Ｙ ａｓ ｅ ｅｓ ｆ ｖ ｔｔｉｎ — ｖ ｔａ ｅａ ｄＰ ＮＡ ｗｅｅｄ ｔｃｅ ｖＲＴ Ｐ Ｒ． ｃ ｓｌ ｓ １ｅｌ ｅ ａｍａＨＣ ｉ ｒｔ ｅ ０ｐ ｎ
ＰＮ Ｃ Ａ基 因表达测定采用 Ｒ — ｃ ．结果 ＴＰＲ
型胶 原蛋白 、透 明质酸水平呈相关性．血浆肝组织胱硫醚 Ｂ合成酶基因表达和酶活性均显著下 降．在肝硬化 的 大鼠中 ，主动脉血管 Ｐ Ｎ ｃ Ａ基 因表 达显著升 高．结论
肝硬化可能增加动脉粥样硬化的发病机率． ［ 关键词］同型半 胱氨酸 ；肝硬化 ；四氯化碳 ；胱硫醚 ？ 合成酶 ；增殖细胞核抗原 ［ 中图分类号］Ｒ ７ ［ ５ 文献标识码］Ａ ［ 文章编号］ ｌ０ —４ Ｏ （ｏ８ ６—０ ｌ —０ ０ ３ ７ ６ ２ ０ ）０ ０１ ５
Toll样受体4在四氯化碳致大鼠慢性肝损伤中的作用机制研究
Ｔ ｌ 受体 ４在 四氯 化碳 致 大 鼠慢性 肝 损 伤 中 ｏ样 ｌ 的作 用 机 制研 究
盛 云 建 陈圻 邓存 良
摘 要 目的 ： 态观 察肝 Ｋ ｐ ｅ 细胞 （ Ｃ ）ｏｌ 受体 ４ Ｔ Ｒ ） Ｎ 动 ｕｆｒ Ｋ ｓＴ ｌ样 （ Ｌ ４ ｍＲ Ａ及 蛋 白在 四氯化 碳 （ Ｃ 致 大 Ｃｌ ） 鼠慢性肝损伤 中的表 达及 作用 。 方法 ： Ｃ １诱导慢性肝损伤 大鼠模 型 ， ０ ４ ６ ８ １ 以 Ｃ 于 … 、 ０周采集标本 ， 离肝 分
蛋 白、 Ｃ Ｌ ４ｍＲ Ａ和 Ｔ Ｆ 在 第 ｌ 时较 第 ８周有轻度 下降 ； Ｋ ｓ Ｌ ４ｍ Ｎ Ｋ ｓ Ｒ Ｎ Ｔ Ｎ． ０周 肝 Ｃ Ｒ Ｒ Ａ的表 达与血 浆 内毒 Ｔ 素水平呈正相关 （ ＝０８ ５ Ｐ＜００ １ 。结论 ：ｃ ｒ ． ， ４ ． ） ０ ｃ ｈ诱导的慢性肝损 伤 中， 内毒 素可上调 Ｋ ｓ Ｌ ４的表 达 ， Ｃ Ｒ Ｔ 而
组织 Ｋ ｓ 以逆 转录聚合 酶链 反应检测 Ｔ Ｒ Ｒ Ａ的表 达； Ｃ并 Ｌ ４ｍ Ｎ 用基质显 色法测定 大鼠血 清 内毒素水平 ； 放射
免疫 法测定血清肿 瘤坏死 因子一 Ｔ Ｆ仅 和 白细胞介 素 １１ Ｉ ｌＢ 水 平 ； Ｌ ４蛋 白和核 因子 Ｋ （ Ｆ Ｋ （ Ｎ 一 ） － （Ｌ — ） ３ ＴＲ Ｂ Ｎ —Ｂ） 蛋 白采用免疫组化 ｓ Ｐ法检测 。结果 ： ０周组肝组 织 Ｔ Ｒ Ｌ ４蛋 白、 Ｃ Ｌ ４ｍＲ Ａ几乎无表 达 ， Ｆ Ｋ Ｋ ｓ Ｒ Ｎ Ｔ Ｎ —Ｂ蛋 白和
一
购 自 ｉｖｔ ｇ ｎ公 司 ； Ｔ Ｐ Ｒ试剂 盒 ，购 自宝 生 物 ｎ ｉｏｅ Nhomakorabea Ｒ ．Ｃ
柴胡疏肝散对四氯化碳诱导的早期大鼠肝纤维化的治疗作用
柴胡疏肝散对四氯化碳诱导的早期大鼠肝纤维化的治疗作用杨武斌;唐金凤;米本中【期刊名称】《山西医科大学学报》【年(卷),期】2022(53)9【摘要】目的探究柴胡疏肝散对四氯化碳诱导的早期肝纤维化模型大鼠的治疗作用。
方法60只SD大鼠随机分为正常组(腹腔注射橄榄油+蒸馏水灌胃)、模型组(腹腔注射40%CCl 4橄榄油溶液+蒸馏水灌胃)、秋水仙碱组(阳性对照,腹腔注射40%CCl 4橄榄油溶液+秋水仙碱0.2 mg/kg灌胃)、柴胡疏肝散低、中、高剂量组(腹腔注射40%CCl 4橄榄油溶液+分别含柴胡疏肝散3.5,6.3,12.6 g/kg灌胃),每组10只,雌雄各半。
连续给药10周,观察各组大鼠一般情况。
末次给药后,测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)变化。
采用HE染色观察肝脏组织病理变化。
反转录-定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测转化生长因子β1(TGF-β1)、Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)和α-平滑肌激动蛋白(α-SMA)mRNA表达水平。
结果与正常组比较,模型组大鼠血清ALT、AST、TBIL、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量均明显升高(P<0.01);HE染色显示模型组大鼠肝小叶被破坏,肝细胞不同程度的水肿、结构紊乱、明显肿胀变形;模型组大鼠肝组织TGF-β1、ColⅠ、α-SMA mRNA的表达升高(P<0.01)。
与模型组比较,秋水仙碱组和柴胡疏肝散低、中、高剂量组血清ALT、AST、TBIL、TNF-α、IL-6和IL-1β均有不同程度的下降(P<0.05或P<0.01);柴胡疏肝散高剂量组与秋水仙碱组血清ALT、AST、TBIL、TNF-α、IL-6、IL-1β含量相比差异无统计学意义(P>0.05)。
与模型组相比,柴胡疏肝散低、中、高剂量组大鼠肝组织病理损伤均得到不同程度的改善,肝细胞形状较为规则,细胞坏死减轻,肝小叶结构较完整,其中以柴胡疏肝散高剂量组的大鼠治疗效果最佳;秋水仙碱组与柴胡疏肝散高剂量组相比,肝小叶破坏和炎性因子浸润仍然存在,仅表现为破坏程度和数量减少,二者程度相当。
片仔癀对四氯化碳诱导肝纤维化大鼠肝功能及核因子κB蛋白表达的影响
片仔癀对四氯化碳诱导肝纤维化大鼠肝功能及核因子-κB蛋白表达的影响郑海音1，华丽萍2，张玉琴2，王晓颖2，徐伟21.福建中医药大学中西医结合学院，福建福州 350122；2.福建中医药大学药学院，福建福州 350122摘要：目的观察片仔癀对CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝功能和核因子-κB（NF-κB）蛋白表达的影响，探讨其作用机制。
方法将24只大鼠随机分为正常对照组、模型组、片仔癀组、秋水仙碱组，每组6只，50%CCl4灌胃8周制备肝纤维化模型。
末次给药1 h后，血清测定ALT、AST、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原、层黏连蛋白和透明质酸含量，取肝脏计算肝指数，HE染色和VG染色观察肝组织病理形态，Western blot检测NF-κB蛋白表达。
结果与正常对照组比较，模型组大鼠肝指数及ALT、AST、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原、层黏连蛋白、透明质酸含量和NF-κB蛋白表达明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠肝指数及ALT、AST、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原、层黏连蛋白、透明质酸含量和NF-κB蛋白表达均明显降低（P＜0.01）。
结论片仔癀对CCl4所致肝纤维化大鼠具有保护作用，其机制可能与抑制NF-κB的表达有关。
关键词：片仔癀；肝纤维化；核因子-κB；大鼠中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2019)04-0057-04DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.04.013 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Effects of Pien Tze Huang on Liver Function and Nuclear Factor-κB Protein Expression in Rats with Hepatic Fibrosis Induced by Carbon TetrachlorideZHENG Haiyin1, HUA Liping2, ZHANG Yuqin2, WANG Xiaoying2, XU Wei21. College of Integrative Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China2. Pharmacy College, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, ChinaAbstract: Objective To investigate the protective effects of Pien Tze Huang on liver function and NF-κB protein expression in rats with hepatic fibrosis induced by CCl4; To discuss its mechanism of action. Methods Totally 24 rats were randomly divided into four groups: normal group, model group, PienTze Huang group and colchicine group, with 6 rats in each group. The liver fibrosis model was prepared by intragastric administration of 50% CCl4 for 8 weeks. After 1 hour of the last administration, serum was used to determine the contents of ALT, AST, type Ⅲprocollagen, type collagen, laminin and hyaluronic acid.ⅣLiver was taken to calculate the liver index. HE and VG staining were performed to observe the pathological damage. The expression level of NF-κB protein was determined by Western blot. Results Compared with the normal group, the levels of liver index, ALT, AST, type procollagen,Ⅲtype Ⅳ collagen, laminin, hyaluronic acid and NF-κB protein in the model group significantly increased (P<0.01). Compared with the model group, the liver index , ALT, AST, type procollagen, type collagen, laminin,ⅢⅣhyaluronic acid and NF-κB protein significantly decreased in each administration group (P<0.01, P<0.05). Conclusion Pien Tze Huang has a significant protective effect on hepatic fibrosis induced by CCl4, which may be related to the inhibition of NF-κB expression.Keywords: Pien Tze Huang; hepatic fibrosis; NF-κB; rats肝纤维化是由多种原因引起的慢性肝损伤所致的病理改变，以过度的细胞外基质（ECM）沉积和纤基金项目：国家自然科学基金（81503513）；福建省高等学校新世纪优秀人才支持计划（NCETFJ）维状结构为特征，纤维疤痕破坏正常肝结构而影响肝功能最后导致肝衰竭[1-2]。
虾青素对四氯化碳诱导的慢性肝损伤大鼠的保护作用
虾青素对四氯化碳诱导的慢性肝损伤大鼠的保护作用黄铁军;余琼华;戴列军【摘要】探讨虾青素对慢性肝损伤大鼠肝功能的保护作用。
方法采用四氯化碳（CCl4）制备大鼠慢性肝损伤模型，设正常组、模型组、虾青素干预组。
通过酶联免疫法测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、总蛋白（TP）以及肝组织超氧化物歧化酶（ superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽转移酶（ glutathione-S-transfcrase，GST）活性、谷胱甘肽（glutathione，GSH）及丙二醛（malondialdehyd，MDA）水平。
对肝组织病理切片行Masson三色染色，检测肝纤维化情况，采用RT-PCR法检测Ⅰ型胶原mRNA水平。
结果正常组大鼠肝胶原指数为（0.42±0.12），模型组大鼠肝胶原指数为（1.84±0.24，P＜0.01），虾青素治疗组肝胶原指数为（0.89±0.12）,显著低于模型组（P＜0.05）；正常大鼠肝组织Ⅰ型胶原mRNA水平为（0.12±0.02），模型组为（0.48±0.06，P＜0.01），虾青素治疗组为（0.35±0.09），明显低于模型组（P＜0.05）；正常组肝组织MDA、GST、GSH和SOD水平分别为（1.93±0.76） nmol/mg、（18.43±5.34） U/mg、（75.45±9.67） mg/g、（678.80±76.56） U/mg，模型组MDA和GST分别为（6.56±1.09）nmol/mg、（54.34±7.65）U/mg，均显著升高（P＜0.05），而GSH为（35.45±9.01） mg/g，SOD为（203.89±89.00） U/mg，均显著降低（P＜0.01）；与模型组比，虾青素治疗组MDA为（3.34±1.12）nmol/mg，GST为（30.89±4.78） U/mg，均显著低于模型组（P＜0.01），而GSH为（56.78±7.78）mg/g，SOD为（432.34±92.56） U/mg，均较模型组显著升高（P＜0.01）。
中药肝复康对四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠肝组织P13K／PKB信号通路和PDGFR—β表达的影响
ｎ ｅ ｏ ｕ ｓ ｌ ｙ ａ ｎｄ ｗａ ｓ ｔ ｒ ｅａ ｔ ｅ ｄ ｗｉ ｔ ｈ Ｇａ ｎ～ｆ ｕ—ｋ ａ ｎｇ ． Ｔｈ ｅ ＰＤＧＦＲ —Ｂ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｉ ｎ ｌ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｗａ ｓ ｄｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｂｙ ｉ ｍ ｍｕ ｎｏ ｈ ｉ ｓ ｔ ｏｃ ｈ ｅ ｍ—
ｉ ｓ ｕ ￣ ￣ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ Ｐ Ｉ ３ Ｋ ａ ｎ ｄ Ｐ ＫＢ １ ｍＲＮＡ ｗｅ ｒ ｅ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｂ ｙ ｓ ｅ ｍｉ — ｑ ｕ ａ ｎ ｔ ｉ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｒ Ｔ－ Ｐ Ｃ Ｒ．Ｒｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ Ｔ ｈ ｅ ｈ ｅ ｐ ａ ｔ ｉ ｃ Ｐ ＤＧＦ Ｒ—
Ｐ Ｋ Ｂ １ ｍＲ Ｎ Ａ水平 的相对光密度值分别为 ２ ． ０ ８ ±０ ． ０ ９和 ２ ． ５ ４± ０ ． １ ０ ， 较对 照组均显著上升（ ０ ． ８ ６±０ ． ０ ４和 ０ ． ３ ６± ０ ． ０ ３ ，
Ｐ ＜ Ｏ ． Ｏ １ ） ， 但肝 复康治疗组其水平 均被 显著抑制（ 分别 为 ０ ． ８ ８± ０ ． ０ ５和 ０ ． ４ １ ±０ ． ０ ３ ， 与模 型组 比， Ｐ ＜ ０ ． ０ １ ） 。结论 肝
四氯化碳诱导肝纤维化早期大鼠肝窦内皮细胞及基底膜形态改变的动态研究
四氯化碳诱导肝纤维化早期大鼠肝窦内皮细胞及基底膜形态改变的动态研究黄月红;郭杞兰;陈治新;陈运新;张莉娟;王小众【摘要】目的：探讨四氯化碳诱导肝纤维化早期大鼠肝窦毛细血管化的形成过程。
方法：清洁级雄性SD大鼠采用随机数字表法随机分为2组：正常对照组（N组，6只）和肝纤维化模型组（ M组，32只）。
M组大鼠腹腔注射50％四氯化碳蓖麻油混合液，N组大鼠腹腔注射生理盐水，剂量为2 mL/kg，每周2次，共4周。
分别于造模第3天、1周、2周和4周处死大鼠，HE染色和Masson染色观察肝脏组织炎症及纤维化的改变，透射电镜观察肝窦内皮细胞（LSECs）窗孔与基底膜（BM）的改变，免疫组织化学检测LSECs 表面标志物CD31及基底膜成分IV型胶原（Col IV）和层黏连蛋白（LN）的改变。
结果：HE及Masson染色显示四氯化碳造模4周早期肝纤维化已形成。
肝组织透射电镜显示四氯化碳造模第3天后开始出现LSECs窗孔直径变小及数目减少，随着造模时间的延长，LSECs失窗孔现象逐步严重，至第4周时局部内皮下可见连续的基底膜。
免疫组化染色显示LSECs表面标志物CD31表达随着LSECs窗孔数目的减少而逐渐增强；基底膜成分Col IV于造模第2周时表达开始显著增强并随着造模时间延长表达逐渐增强，LN于造模第4周时表达开始显著增强。
结论：肝纤维化早期大鼠局部肝组织可见典型的肝窦毛细血管化形成；肝窦壁内LN沉积是肝窦毛细血管化时形成连续基底膜的关键因素。
%[ABSTRACT]AIM:Toexplorethedevelopmentofhepaticsinusoidalcapilla rizationintheearlystageofliverfi-brosis induced by carbon tetrachloride (CCl4) in rats.METHODS:Clean SD rats were randomly divided into normal con-trol group (group N, n=6) and liver fibrotic model group (group M,n=32).The rats in group N were intraperitoneal in-jected with saline and the rats in group M were intraperitoneal injected with CCl 4(2 mL/kg, twice a week for 4 weeks).At the end of the 3rd day and the 1st, 2nd and 4th weeks, all rats were killed and then the samples were collected .The patho-logical changes in the livers were observed by HE staining and Masson straining .The development of hepatic sinusoidal capillarization was observed by transmission electron microscopy (TEM) and immunohistochemical staining .The cell sur-face expression of vascular endothelium-associated marker CD31, collagen type Ⅳ(Col IV) and laminin (LN) was deter-mined.RESULTS:HE and Masson staining showed the formation of liver fibrosis after treatment with CCl 4 for 4 weeks. TEM showed that the fenestrate diameter of liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) grew down, the fenestrate numbers of LSECs were decreased along with the development of liver fibrosis , and the consecutive basement membrane was formed at the end of the experiment .The expression of CD31 was significantly increased along with the development of defenestration , and the expression of Col IV and LN was significantly increased after the treatment with CCl 4 for 2 weeks and 4 weeks , re-spectively .CONCLUSION:The typical hepatic sinusoidal capillarization was detected in the early stage of liver fibrosis , and the deposition of LN in the liver sinusoidal walls was the mainly factor of formation of the consecutive basement mem -brane .【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2014(000)008【总页数】6页(P1501-1505,1531)【关键词】大鼠;肝纤维化;肝窦毛细血管化;肝窦内皮细胞;基底膜【作者】黄月红;郭杞兰;陈治新;陈运新;张莉娟;王小众【作者单位】福建医科大学附属协和医院消化内科，福建福州350001;福建医科大学附属协和医院消化内科，福建福州350001;福建医科大学附属协和医院消化内科，福建福州350001;福建医科大学附属协和医院消化内科，福建福州350001;福建医科大学附属协和医院消化内科，福建福州350001;福建医科大学附属协和医院消化内科，福建福州350001【正文语种】中文【中图分类】R575肝窦是肝细胞与血浆之间进行物质交换的场所。
大鼠注射CCl4后血清羟脯氨酸和脯氨酸含量变化
［ ｙｗｏ ｄ ］ｌ ｅ ｉｈ ｓ ； ｙ ｒｘｐｌ ｅ ｒｌ ｅ ｃ ｒｏ ｅ ａ ｈｏｉｅ ａｓｉｂｅ ｔ ｉｓ Ｋｅ ｒ ｓ ｉ ｒ ｒ ｏｉ ｈ ｄｏｙ ｒｎ ；ｐｏｉ ； ａｂ ｎｔ ｒｃ ｌｒ ；ｒｔ， ｒｄｓ ａｎ ｖ ｃｒ ｓ ｉ ｎ ｔ ｄ ｎ ｒ
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第２ ７卷 第 ３期 ２０ ０ ２年 ６ 月
贵 阳 医 学 院 学 报
Ｊ ＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＧＵＩ ＹＡＮＧ ＥＤＩ Ｍ ＣＡＬ ＣＯＬＬＥＧＥ
Ｖｏ ． ７ １ ２ ＮＯ． ３ ２ ２ ６ ００ ．
大 鼠注射 Ｃ １ Ｃ４后 血 清 羟 氨 酸 和 脯 氨 酸 含 量 变 化 脯
Ｔｈ ａ ｇ ｓｏ ｅ ｕ Ｈｙ ｎ ｒ ｎ Ｒａ ｓａｔｒ Ｉ ｊ ｃｉｎ ｏ ４ ｅ Ｃｈ ｎ ｅ ｆＳ ｒ ｍ ｐ ａ ｄ Ｐ ｏ ｉ ｔ ｆ ｎ ｔ ｆＣＣＩ ｅ ｅ ｏ
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醇 ） 隔 日 １次 饮 用 含 ３ ％ 酒 精 的 饮 水 。 和 ０ １４ 检 测 指 标 分 别 于 复 制 模 型 前 及 复 制 模 型 ． ２ ４ ６ ８周 断 头 处 死 大 鼠 。 取 血 测 血 清 中 羟 脯 氨 ， ，， 酸 、 氨 酸 含 量 ； 脏 取 出 后 ， 无 水 乙 醇 和 脯 肝 用 丙 酮 脱 脂 ， 烘 干 ， 成 粉 末 ， 水 解 ， 后 测 定 羟 再 制 酸 最
（ ｅ ａｔ ｎ ｆＢｉｃ ｅ ｓｒ Ｄ ｐ ｒｍｅ ｔｏ ｏ ｈ ｍｉ ｙ，Ｇ ｉａ ｇ Ｍｅ ｉ ｌＣ ｌ ｇ ｔ ｕｙ ｎ ｄｃ ｏｌ ｅ，Ｇｕｙ ｎ ５ ０ ４，Ｃ ｉａ） ａ ｅ ｉａ ｇ ５ ０ ０ ｈｎ
四氯化碳腹腔注射致大鼠肝纤维化机理研究
四氯化碳腹腔注射致大鼠肝纤维化机理研究摘要四氯化碳（CCl4）在工业中被广泛使用，但同时也是致病性很强的化学物质之一。
大剂量的四氯化碳腹腔注射可以造成大鼠肝脏纤维化，这个过程涉及到许多细胞和分子，包括肝星状细胞、基质金属蛋白酶、肝细胞增殖因子等。
通过对四氯化碳致肝纤维化机制的探究，可以为预防和治疗肝纤维化提供理论依据。
本文综述了近年来对四氯化碳致大鼠肝纤维化机理的研究进展，以期为进一步深入研究提供指导。
引言肝纤维化是一种病理变化，主要表现为肝脏纤维化，细胞间质增生。
这种病理变化死亡率极高，导致的疾病有肝硬化等。
近年来，生物医学界对肝纤维化机理的研究非常活跃，多种因素可以导致肝纤维化。
其中，四氯化碳是致肝纤维化有力证据之一。
四氯化碳在工业中用于溶剂、引发剂等，同时也是致病性很强的化学物质之一。
另外，四氯化碳是一种引起腹腔注射、口服、吸入等损伤作用的化学物质。
研究四氯化碳致大鼠肝纤维化机制，对于预防和治疗肝纤维化具有重要的意义。
四氯化碳致大鼠肝纤维化机制及相关分子肝星状细胞肝星状细胞是肝组织中一个重要的细胞成分，其在肝纤维化的过程中起着重要的作用。
肝星状细胞是一种重要的合成胶原等结构蛋白的细胞，肝纤维化时会增殖并沉积更多的ECM（extracellular matrix，细胞外基质），导致肝脏脏器功能受损。
四氯化碳能够刺激肝星状细胞产生胶原等 ECM，长期刺激会导致肝组织生物学性质的改变，此时肝细胞开始发生变性、坏死，甚至引起肝硬化等，其机制是肝纤维化的重要组成成分。
基质金属蛋白酶基质金属蛋白酶（MMPs）是一类在肝脏纤维化过程中起重要作用的酶，它主要参与细胞外基质的分解、修复和代谢等生理过程。
细胞外基质主要为胶原、弹性纤维等结构蛋白，它们在细胞的形态和功能中起着重要的作用。
在肝脏纤维化过程中，MMPs主要功能是切割 ECM，将结构蛋白分解为小分子，使其成为肝星状细胞所需要的构成基质的单体，同时还能够促进肝星状细胞表达更多的 ECM。
四氯化碳肝纤维化大鼠储脂细胞表皮生长因子受体的变化
四氯化碳肝纤维化大鼠储脂细胞表皮生长因子受体的变化刘海林;李宣海;杨少平;王丹艺【期刊名称】《胃肠病学》【年(卷),期】1999(4)3【摘要】研究四氯化碳(CCl4)所致实验性肝纤维化大鼠肝脏储脂细胞(FSC)表皮生长因子受体(EGF-R)的变化，探讨EGF-R在FSC激活中的作用。
方法：125标记EGF，放射配体结合分析测定正常和CCl；肝纤维化大鼠肝脏原代FSC的EGF-R。
结果：CCI4肝纤维化大鼠肝脏FSC数量(6.71×10：±5．32×10)较正常大鼠(2．63x102±1．04×107)显著增多(P<0．05)：正常与CCI4；肝纤维化大鼠FSC 的EGF—R最大结合位点数(RT)、解离常数(kD)分别为：2．22×103sites．／cell．4，09×10-10M和9.27x103sites／cell．3．26×10-10M旰纤维化时EGF．R明显增高(P<0．05)。
结论：CCI。
引起肝纤维化时FSC增殖，同时EGF-R的表达增加。
【总页数】2页(P161-162)【作者】刘海林;李宣海;杨少平;王丹艺【作者单位】上海第二医科大学;上海第二医科大学附属第九人民医院消化内科200011【正文语种】中文【中图分类】R575.2【相关文献】1.储脂细胞的激活与肝纤维化的发生 [J], 谭龙益2.储脂细胞与肝纤维化 [J], 王要军3.四氯化碳肝纤维化大鼠的Ⅳ型胶原水平和超微结构的动态变化 [J], 黎俏梅;孟辉;黄真炎;徐勤4.GRP94在四氯化碳诱导大鼠肝纤维化过程中的动态变化 [J], 赵彩霞;申凤俊5.肝储脂细胞表达CYP11B2mRNA与实验性肝纤维化的关系研究 [J], 李旭;杨希山;吴平生;孟莹;李素梅;李先茂;赖文岩;张虹;Yoshiyu Takeda;lsamu Miyamon;Byoyu;Takeda因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
CCl_4诱导大鼠肝纤维化过程中α1（Ⅰ）、α1（Ⅲ）及α1（Ⅳ）前胶原基因表达的动态观察
CCl_4诱导大鼠肝纤维化过程中α1（Ⅰ）、α1（Ⅲ）及α1（Ⅳ）前胶原基因表达的动态观察杜卫东;张月娥;周筱梅;翟为溶;钱连芳【期刊名称】《徐州医学院学报》【年(卷),期】1996(16)4【摘要】利用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交技术对ＣＣｌ４诱导大鼠肝纤维化过程中α１（Ⅰ）、α１（Ⅲ）及α１（Ⅳ）３种前胶原ｍＲＮＡ的表达状况进行观察。
结果证实α１（Ⅰ）、α１（Ⅲ）及α１（Ⅳ）３种前胶原ｍＲＮＡ的表达均有增加，但三者的变化并不同步。
纤维化早期首先是α１（Ⅳ）前胶原ｍＲＮＡ表达增加。
随后是α１（Ⅲ）前胶原ｍＲＮＡ，后者在整个肝纤维化过程中呈优势性表达。
α１（Ⅰ）前胶原ｍＲＮＡ的增加又滞后于α１（Ⅲ）且上升缓慢，至第２０周时才逐渐与α１（Ⅲ）前胶原ｍＲＮＡ含量相近。
可能是由于存在反馈性抑制的缘故，使得前胶原基因表达的上调并非呈直线递增而是曲线上升。
【总页数】5页(P345-349)【关键词】前胶原;肝纤维素;基因表达【作者】杜卫东;张月娥;周筱梅;翟为溶;钱连芳【作者单位】上海医科大学病理学教研室,上海市肿瘤研究所癌基因与相关基因研究实验室【正文语种】中文【中图分类】R575.202;R362【相关文献】L_4诱导大鼠肝纤维化过程中IL-18的表达及临床意义 [J], 冯俊杰;商中华2.一贯煎对CCl_4诱导的肝纤维化大鼠肝组织胶原代谢的影响 [J], 王晓柠;陶庆;冯琴;彭景华;刘平;胡义扬3.强力宁对四氯化碳、乙醇诱导的肝纤维化大鼠模型肝脏Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA 表达的影响 [J], 郭津生;王吉耀;刘维田;余竹元4.丹酚酸B抑制CCl_4诱导大鼠肝纤维化形成的基因表达谱分析 [J], 王晓玲;刘平;胡旭东;应馨萍;李伯勤5.鳖甲煎丸对大鼠肝纤维化过程中肝脏胶原及血清前胶原Ⅲ等影响的动态观察 [J], 卢跃卿;任小巧;陈永旭;朱志军;高寒因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
红景天对大鼠肝纤维化肝脏组织中TIMP-1、Smad4表达的影响
红景天对大鼠肝纤维化肝脏组织中TIMP-1、Smad4表达的影响刘东璞卢凤美王明富孟庆媛郭梦凡姚海涛王抒（佳木斯大学司法鉴定中心，黑龙江佳木斯154007）〔摘要〕目的探讨红景天对四氯化碳（CCl 4）诱导的大鼠肝纤维化肝组织基质金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP-1）、Smad4基因表达的影响。
方法健康雄性SD 大鼠60只随机分为①正常对照组、②肝纤维化模型组、③红景天干预组，每组20只。
以CCl 4腹腔注射法诱导大鼠肝纤维化，红景天干预组大鼠在造模的同时给予红景天灌胃，正常对照组给予橄榄油和生理盐水灌胃，8w 实验结束时处死动物，留取的肝脏组织做HE 染色，按0 4期标准判定肝纤维化程度，应用半定量RT-PCR 检测肝组织中TIMP-1mRNA 、Smad4mRNA 的表达情况，用免疫组化检测肝组织中TIMP-1、Smad4的表达。
结果模型组大鼠肝纤维化程度处于2 4期，其中大部分达3期以上，红景天干预组大鼠肝纤维化程度明显减轻，只有少部分达3期。
红景天干预组大鼠肝组织中TIMP-1mRNA 阳性表达水平及蛋白阳性表达均低于模型组（P ＜0.05）；红景天干预性治疗组肝脏Smad4mRNA 及蛋白表达阳性率明显低于模型组（P ＜0.05）；肝组织TIMP-1，Smad4蛋白表达与TIMP-1，Smad4mRNA 水平变化呈正相关。
结论中药红景天能有效抑制CCl 4诱导的肝纤维化大鼠肝脏中TIMP-1、Smad4表达。
〔关键词〕红景天；肝纤维化；TIMP-1；Smad4〔中图分类号〕R57〔文献标识码〕A〔文章编号〕1005-9202（2012）12-2556-03；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.051基金项目：黑龙江省卫生厅科研资助项目（No.2009-355）通讯作者：卢凤美（1970-），女，硕士，副教授，主要从事肝脏疾病的防治与预防的研究。
第一作者：刘东璞（1969-），男，硕士生导师，副教授，主要从事肝纤维化研究。
内质网及氧化应激在大鼠慢性肝损伤中的变化
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肝脏 ２０ ０ ９年 ２月 第 １ 第 １ ４卷 期
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２ ・ ３
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论 著 ・
内质 网及 氧 化应 激 在 大 鼠慢 性 肝 损 伤 中的变 化
张海 燕 温韬 丁淑 芹 卢静 李胜 利 王 晶 晶 武 彦 宁 朴 正福
【 要】 目 的 标 在 四 氯 化 碳 诱 导 的 大 鼠慢 性 肝 损 伤 中 的 变 化 。方 法 四 氧
ｉ ｔ ａ ｅ ｉｏ ｅ Ｉ ． Ｔｈ ｓ ａ ｔ ｔ ｍｉ ｏ ｒ ｎ ｆ ｒ ｓ ＡＬＴ）ａ ｄ ａ ａ ｉ ｅ ａ ｎ ｔａ ｓ ｅ ａ ｅ （ Ｔ）ｉ ｅ ｕ ｗｅ ｅ ａ ａ ｙ ｅ ． ｎ ｒ ｐ ｒｔ ｎ ａ ｌ ｙ ｅ ａ ｐ ｒ ａ ｅ ａ ｎ ｔａ ｓ ｅ ａ ｅ（ ｎ ｌｎ ｎ ｍｉ ｏ ｒ ｎ ｆ ｒ ｓ ＡＳ ｎ ｓ ｒ ｍ ｒ ｎ ｌ ｚ ｄ Ａｄ ｉｉｎ ｌ ｄｔｏ ａ ｌ ｙ，ｈ ｓｏ ａ ｈ ｌ ｇ ｃ ｌ ｃ ａ ｇ ｓ ａ ｄ ｅ ａ ｏ ｙ ｅ ｐ ｐ ｏ ｉ ｉｔ ｐ ｔ ｏｏ ｉａ ｈ ｎ ｅ ｎ ｈ ｐ ｔ ｃ ｔ ａ ｏ ｔ ｓｓ ｗｅ ｅ ｅ ｅ ｔ ｄ ｙ ｒ ｄ ｔ ｃ ｅ ｂ Ｈ Ｅ ａ ｄ ＴＵ ＮＥＬ ｎ ｍｅ ｈ ｄ ． Ｔｈ ｔｏ ｓ ｅ
四氯化碳法制备肝硬化大鼠模型中重要脏器的病理改变
四氯化碳法制备肝硬化大鼠模型中重要脏器的病理改变张云巍;胡亚卓;徐丽娟;潘美妍;阎丽【期刊名称】《世界华人消化杂志》【年(卷),期】2014()1【摘要】目的:观察四氯化碳(CCl4)经腹腔注射法制备肝硬化动物模型(cirrhosis model,CM)实验中机体其他主要脏器的病理变化情况.方法:30只SD大鼠,随机分为对照组和模型组.模型组:22只,使用橄榄油配备浓度为600mL/L的CCl4按3μL/g体质量经腹腔注射,3次/wk,共计12 wk,制备肝硬化大鼠模型(假小叶形成为判定CM成功的标准);对照组:8只,按3L/g体质量给予橄榄油溶液腹腔注射,3次/wk,共计12 wk.两组大鼠均给予普通饲料加清水喂养,并监测实验期间大鼠体质量变化、活动及对外界的反应情况,同时记录大鼠的死亡情况及死亡时间.至12周末,模型组死亡6只,对照组全部存活.处死存活下来的模型组大鼠做肝脏病理,均符合肝硬化标准.造模成功的同时收集食管、结肠、脾、肺等组织行HE染色,肾脏组织行PAS染色、并在光镜下观察各器官的组织形态学改变.结果:与对照组相比,模型组的大鼠肝组织呈典型的假小叶改变;食管、结肠可见少量的炎症细胞浸润,肾脏可见肾小管细胞轻度水肿.肺泡结构破坏,部分区域内有肺泡间隔绷紧,有多个肺泡的融合,肺泡腔内见急性炎细胞及红细胞.脾的组织形态基本正常.结论:本文首次对CCl4腹腔注射法制备肝硬化动物模型的重要脏器进行病理学观察,证明该方法制备的肝硬化大鼠模型对主要脏器的影响小,与人类发生肝硬化时重要脏器的病理改变基本一致,因此,再次说明该方法是一种理想的实验性肝硬化动物模型的制备方法.【总页数】6页(P74-79)【关键词】四氯化碳;肝硬化;脏器损伤【作者】张云巍;胡亚卓;徐丽娟;潘美妍;阎丽【作者单位】中国人民解放军总医院南楼临床部消化内科;中国人民解放军总医院老年医学研究所病理科;中国人民解放军济南军区第二疗养院【正文语种】中文【中图分类】R575.2【相关文献】1.20％四氯化碳大鼠联合小牛血清制备肝硬化大鼠模型 [J], 张云瑞;梁瑞敏;刘改萍2.四氯化碳综合法制备大鼠肝硬化模型 [J], 叶春华;刘浔阳3.慢性阻塞性肺疾病模型大鼠多脏器病理改变及宣肺中药的干预作用 [J], 郑丰杰;李宇航;许红;吴莹;高誉珊;孙燕;王毅;徐云;林峻生4.腹腔注射40%四氯化碳加食用白酒制备肝硬化大鼠模型 [J], 陈菲;王建美;盛柳青;裘颖儿5.四氯化碳加乙醇制备实验性肝硬化大鼠模型 [J], 周婷;杨军;王勇因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
小牛肝去蛋白提取物对大鼠实验性肝损伤的保护作用
大鼠 ５ ０只 ，按 照 随机 数 字 法 分 为 ５组 ，每 组
Ｐ ＜ ０． ５ ０ ’ Ｐ ＜０ ０１ ．
ｌ ：①组 为正常对照组 ，按照 ９ ．２ ｍ ／ ｇ ０只 ８ １５ ｇ ｋ 尾
静 脉 注 射 生 理 盐 水 ② 组 为 模 型 对 照 组 ， 按 照 ９ ．２ｍｇｋ 尾 静脉 注射 生理 盐水 ，③ ④ ⑤分 别 为 ８１５ ／ ｇ 小 牛肝 去蛋 白提 取物低 、中 、高 剂量组 ，分 别 尾静 脉注射 ９ ．２ ｍ ／ ｇ ９．５ ｍ ／ ｇ ９ ．２ ｍｇ ８ １５ ｇ ｋ ，１６２０ ｇｋ ，４０ ６５ ／
常显 著性 差 异 （ ０ ０ ，Ｐ＜ ． １ 。 Ｐ＜ ． ５ ０ ０ ）
［ 作者简介】 李新宇 （９ ３一） １７ ，女 ，辽宁省 西丰人 ，讲师 ，在读硕士研 究生 ，主要研 究方向为生化 制药。 来自维普资讯 ５ ０
辽宁医学 院学报
２０ ０７年 ２月 ，２ （ ） ８ １
子 天 平 Ｍｅ ｅ Ｔｌ ｏ 仪 器 （ 海 ） 有 限 公 司 ｔ ｒ ｏｅ ｌ ｆ ｄ 上 Ｓ Ｚ ８水浴 恒 温振 荡 器 （ 苏 省 金 坛 市 医 疗 仪 器 Ｈ８ 江 厂 ）Ｌ ＩＡ切 片 机 （ 国 ） 光 学 显 微 镜 （ｌｐｍｓ ＥＣ 美 ｏ ｕ ｙ
日本 ）
１ ２ 方法 ．
２ ２ 急性肝 损 伤大 鼠肝 脏 病理 学 改变 ． 正常 对照 组大 鼠肝 脏 外观 呈红 褐 色 ，质 地 软而 富有 弹性 ，镜 下见 肝小 叶 清晰 ，细 胞排 列整 齐 ，大 小均 匀 ，分 界 清楚 ，细 胞 核位 于细 胞 中央 ，圆而清 晰 （ １ 。模 型 对照 组 大 鼠肝脏 明显 增 大 ，质 脆 ， 图 ） 边缘 钝 而厚 ，表 面 黄 褐 色 ，镜 下 见 肝 小 叶 结 构 破 坏 ，排列紊 乱 ，部 分肝 细 胞变 性 ，坏死 或 细胞 核溶
大鼠肝损伤实验报告
一、实验目的本研究旨在探讨四氯化碳（CCl4）诱导的大鼠急性肝损伤模型，并观察联苯双酯（DDB）对肝损伤的保护作用，为临床治疗肝损伤提供理论依据。
二、实验材料1. 实验动物：6-8周龄雄性SD大鼠，体重200-250g，由广东医学院动物实验中心提供。
2. 药品与试剂：四氯化碳（CCl4）、联苯双酯（DDB）、生理盐水、丙氨酸转氨酶（ALT）、天门冬氨酸转氨酶（AST）试剂盒等。
3. 仪器：高速离心机、显微镜、病理切片机等。
三、实验方法1. 分组：将24只大鼠随机分为3组，每组8只：正常对照组、肝损伤模型组（简称模型组）、DDB治疗组（简称DDB组）。
2. 模型制备：模型组和DDB组大鼠采用腹腔注射CCl4（0.3ml/100g体重）制备急性肝损伤模型，正常对照组大鼠注射等体积的生理盐水。
3. 干预：DDB组大鼠在注射CCl4后，每天给予联苯双酯滴丸（5mg/kg体重）灌胃，连续14天；模型组和正常对照组大鼠给予等体积的生理盐水灌胃。
4. 样本采集：实验结束后，各组大鼠空腹12小时，采集血液，检测血清ALT、AST水平；取肝脏组织，进行病理切片观察。
5. 数据处理：采用SPSS 20.0软件进行统计分析，数据以均值±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析。
四、实验结果1. 血清ALT、AST水平：DDB组血清ALT、AST水平较模型组明显降低（P<0.001），与正常对照组相比，DDB组血清ALT、AST水平无显著差异。
2. 肝脏病理学观察：DDB组大鼠肝组织切片中肝细胞脂肪变性、炎细胞浸润均较模型组明显减轻，且肝组织中无明显纤维增生。
五、讨论本研究采用CCl4诱导的大鼠急性肝损伤模型，成功复制了急性肝损伤病理过程。
联苯双酯作为一种肝保护药物，能够显著降低血清ALT、AST水平，减轻肝脏病理损伤。
1. CCl4诱导的大鼠急性肝损伤模型：CCl4作为一种亲肝的细胞毒性物质，能迅速被肝和脑吸收，通过自由基形成及引发的链式过氧化反应，损伤细胞膜、内质网膜等，导致肝细胞死亡。
益气逐瘀解毒颗粒对肝纤维化模型大鼠GIV_及下游信号通路PKA
㊃基础研究㊃基金项目:国家自然科学基金面上项目(82274323);四川省科技厅项目(2020YFS0379)作者单位:610072 成都中医药大学附属医院中心实验室[陶雨静(博士研究生)㊁李晖㊁陈婧㊁郭佳玲(硕士研究生)㊁张天洪㊁袁强华];成都中医药大学临床医学院[陶雨静(博士研究生)㊁郭佳玲(硕士研究生)]作者简介:陶雨静(1994-),2021级在读博士研究生㊂研究方向:肝纤维化基础与临床研究㊂E⁃mail:915114379@通信作者:李晖(1970-),博士,教授,中国防痨协会结核病与肝病专科分会常务委员㊂研究方向:肝纤维化基础与临床研究㊂E⁃mail:1400124746@益气逐瘀解毒颗粒对肝纤维化模型大鼠GIV 及下游信号通路PKA /CREB 表达的影响陶雨静 李晖 陈婧 郭佳玲 张天洪 袁强华【摘要】 目的 观察益气逐瘀解毒颗粒对四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl 4)诱导的肝纤维化模型大鼠的抗纤维化作用及其对与Gα相互作用的囊泡相关蛋白(Gα⁃interacting vesicle⁃associatedprotein,GIV)㊁下游信号通路蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)/环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cyclic adenosine monophosphate response element binding protein,CREB)表达水平的影响并探讨其作用机制㊂方法 SD 雄性大鼠予以CCl 4橄榄油混合物腹部皮下注射7周诱导肝纤维化模型,造模成功后随机分为益气逐瘀解毒颗粒高㊁中㊁低剂量组,扶正化瘀组及模型对照组,另设阴性对照组,共6组,每组大鼠8只㊂益气逐瘀解毒颗粒高㊁中㊁低剂量组分别予益气逐瘀解毒颗粒10.8g /(kg㊃d)㊁5.4g /(kg㊃d)㊁2.7g /(kg㊃d)灌胃给药,扶正化瘀组予扶正化瘀胶囊0.405g /(kg㊃d)灌胃给药,其余组等量蒸馏水灌胃,持续5周后处死大鼠收集标本㊂检测外周血丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)㊁天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST);肝组织苏木精 伊红(hematoxylin⁃eosin,HE)㊁MASSON 染色检测肝纤维化程度;免疫组化法检测肝组织α⁃平滑肌激动蛋白(alpha smooth muscle actin,α⁃SMA)含量,并采用实时荧光定量PCR 法(real time quantitative PCR,RT⁃qPCR)和蛋白免疫印迹法分别检测大鼠肝组织中Ⅰ型胶原α1链(collagen type I alpha 1chain,Col1A1)㊁Ⅰ型胶原α2链(collagen type I alpha 2chain,Col1A2)㊁GIV㊁PKA㊁CREB mRNA 和蛋白表达水平㊂结果 益气逐瘀解毒颗粒可减少肝纤维化模型大鼠胶原纤维增生及肝细胞损伤,且与模型对照组相比,益气逐瘀解毒颗粒各剂量组α⁃SMA 含量显著下降(P <0.05),Col1A1㊁Col1A2㊁GIV 表达显著下调(P <0.05),益气逐瘀解毒颗粒高㊁中剂量组PKA 表达上调(P <0.05),中剂量组CREB 表达显著上调(P <0.05);与扶正化瘀组比较,益气逐瘀解毒颗粒高㊁中剂量组α⁃SMA 含量显著下降(P <0.05),高剂量组GIV 表达下调(P <0.05),中剂量组PKA 表达上调(P <0.05)㊂结论 益气逐瘀解毒颗粒对CCl 4诱导的肝纤维化模型大鼠具有抗肝纤维化作用,可能与调节GIV 表达及其下游信号通路PKA /CREB 的表达有关㊂【关键词】 益气逐瘀解毒颗粒; 肝纤维化; 与Gα相互作用的囊泡相关蛋白; 蛋白激酶A /环磷酸腺苷反应元件结合蛋白信号通路【中图分类号】 R285.5 【文献标识码】 A doi:10.3969/j.issn.1674⁃1749.2024.01.002Study on the effect of Yiqi Zhuyu Jiedu granule by regulating GIV and PKA /CREB signal pathway on hepatic fibrosis in a carbon tetrachloride⁃induced rat modelTAO Yujing ,LI Hui ,CHEN Jing ,GUO Jialing ,ZHANG Tianhong ,YUAN QianghuaCentral Lab ,Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine ,Chengdu 610072,China Corresponding author :LI Hui ,E⁃mail :1400124746@【Abstract】 Objective Study the effect and mechanism of Yiqi Zhuyu Jiedu granule by regulating GIV and PKA/CREB signal pathway on hepatic fibrosis in the carbon tetrachloride(CCl4)⁃induced rat model.Methods Hepatic fibrosis was induced in male Sprague⁃Dawley rats by subcutaneous injection of mixture of CCl4and Olive oil twice a week for7weeks.The animals were randomly divided into six groups (each group,n=8)as follows:high,middle and low dose group each was treated with different dose of Yiqi Zhuyu Jiedu granule by gavage,the Fuzheng Huayu capsule group was treated with Fuzheng Huayu capsule,the model group and the control group was treated with distilled water.After5weeks,Alanine aminotransferase(ALT),aspartate aminotransferase(AST)were analyzed by ELISA and automatic biochemical instrument.The effect of Yiqi Zhuyu Jiedu granule on hepatic fibrosis was evaluated by histo⁃morphologically using hematoxylin and eosin(HE)staining and MASSON staining,and the collagen pro⁃portionate area was quantified.The content of alpha smooth muscle actin(α⁃SMA)in liver tissue was detected by immunohistochemistry.In addition,fibrosis⁃related factors,such as Collage typeⅠalpha1 chain(Col1A1),Collage typeⅠalpha2chain(Col1A2),Gα⁃interacting vesicle⁃associated protein (GIV),protein kinase(PKA)and cAMP response element binding protein(CREB)expression level, were evaluated using the method of real⁃time polymerase chain reaction and Western blot.Results Yiqi Zhuyu Jiedu granules could decrease collagen fiber hyperplasia and hepatocyte injury in liver fibrosis model pared with the model group,the content ofα⁃SMA in each group of Yiqi Zhuyu Jiedu granules group was significantly decreased(P<0.05),and the expression of Col1A1,Col1A2and GIV was significantly down⁃regulated(P<0.05).The expression of PKA in the high and medium dose groups was up⁃regulated(P<0.05),and the expression of CREB in the medium dose group was significantly up⁃regulated(P<0.05).Compared with the Fuzheng Huayu group,the content ofα⁃SMA in the the high and middle dose groups of Chinese medicine compound was decreased significantly(P<0.05),the expression of GIV in the high dose group was down⁃regulated(P<0.05),and the expression of PKA in the middle dose group was up⁃regulated(P<0.05).Conclusion Yiqi Zhuyu Jiedu granule has anti⁃hepatic fibrosis effect on CCl4⁃induced liver fibrosis model rats,which may be related to the regulation of GIV expression and its downstream signaling pathway PKA/CREB expression.【Key words】 Yiqi Zhuyu Jiedu granule; hepatic fibrosis; GIV; PKA/CREB 肝纤维化是由多种致病因素引起的慢性㊁持续性肝脏炎症或损伤后组织修复过程中的代偿反应,细胞外基质(extracellular matrix,ECM)合成大于降解,导致过度沉积,形成肝纤维化[1]㊂其中,肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSCs)的激活是其发生的中心环节[2]㊂肝纤维化甚至早期肝硬化可以通过治疗发生逆转[3],及时进行有效的抗肝纤维化治疗是防止慢性肝病向终末期肝病转化的必要措施㊂益气逐瘀解毒颗粒由膈下逐瘀汤合小柴胡汤加减化裁而形成,作为临方制剂应用多年,治疗肝纤维化有确切疗效,可促进肝纤维化的消退㊂前期动物实验证实,益气逐瘀解毒颗粒可促进四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)诱导肝纤维化大鼠模型的肝组织结构恢复,调节基质金属蛋白酶及其抑制剂的平衡[4],降低促纤维化因子的表达[5],抑制HSCs的活化[6],从而确切改善肝纤维化程度[7]㊂但益气逐瘀解毒颗粒抑制HSCs活化的具体分子机制仍需要进一步明确㊂与Gα相互作用的囊泡相关蛋白(Gα⁃interacting vesicle⁃associated protein,GIV),又称微丝附着梁蛋白[8],是多结构域信号转导子,可以通过鸟嘌呤核苷酸交换因子基序激活Gαi蛋白调控下游多个受体相关信号通路[9⁃11]㊂研究发现,GIV是肝纤维化信号网络的关键枢纽,在损伤后的肝脏中表达,是HSC活化所必需的[12];且一旦表达,GIV抑制抗纤维化通路 环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)-蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)-磷酸化cAMP反应元件结合蛋白(p⁃cAMP response element binding protein,pCREB),使信号网络偏向纤维化[13]㊂GIV位于多个肝纤维化受体信号系统的中心,在肝纤维化信号网络中起整合作用,有望成为肝纤维化治疗的重要靶点㊂本研究在构建CCl4诱导肝纤维化大鼠模型基础上,研究益气逐瘀解毒颗粒对该大鼠肝纤维化模型的治疗作用,并进一步探讨其对GIV表达及下游PKA/CREB信号通路的影响,明确其作用靶点㊂1 材料与方法1.1 实验动物健康SPF级雄性SD大鼠58只,7周龄,体质量(220±20)g,由成都达硕实验有限公司提供,实验动物许可证号:SCXK(川)2015⁃030㊂普通饮食,适应性喂养1周后开始实验㊂1.2 实验药物益气逐瘀解毒颗粒由成都中医药大学附属医院药剂科制备,由党参10份㊁黄芪15份㊁莪术10份㊁当归10份㊁川芎5份㊁赤芍10份㊁丹皮10份㊁丹参15份㊁柴胡5份㊁黄芩7.5份㊁甘草2.5份等组成㊂制备方法:全方药物加入8倍量水,浸泡40分钟,煎煮3次,每次50分钟,合并3次滤液,浓缩至相对密度1.3,加入糊精,混合,在75℃下鼓风干燥6小时,粉碎过筛,加入80%乙醇,制粒,65℃下鼓风干燥4小时,整粒,分包装至10g/袋(含生药21.25g);扶正化瘀胶囊购自上海黄海制药有限公司(批号:190912,规格:0.5g/粒)㊂1.3 实验试剂及主要仪器测定Ⅰ型胶原α1链(collagen type I alpha1 chain,Col1A1)多克隆抗体(84336)购自美国CST公司,大鼠GIV多克隆抗体(ab113890)㊁PKA单克隆抗体(ab75991)㊁CREB单克隆抗体(ab32515)㊁Ⅰ型胶原α2链(collagen type I alpha2chain,Col1A2)多克隆抗体(ab96723)及α⁃平滑肌激动蛋白(alpha smooth muscle actin,α⁃SMA)单克隆抗体(ab32575)购自英国abcam公司;上述蛋白的PCR引物序列见表1;7500荧光定量PCR仪为ABI公司产品㊂1.4 动物造模㊁分组与给药1.4.1 肝纤维化大鼠模型制备 对大鼠腹部皮下注射CCl4㊁橄榄油混合液(按2∶3配制而成),每周注射2次,前4周每次给予剂量4mL/kg,后3周每次给予剂量3mL/kg,共7周㊂第7周末随机处死造模组及阴性对照组大鼠各5只,收集外周血,4℃离心20分钟,血清检测生化指标,另取肝右叶组织标本,通过苏木精 伊红(hematoxylin⁃eosin,HE)染色和MASSON染色以确定肝纤维化模型制备成功与否,具体参见文献[14]㊂CCl4皮下注射7周后,进行外周血生化指标的检测,结果提示,模型大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)㊁天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)均出现明显的增高,提示CCl4皮下注射后,模型组大鼠出现明显的肝功能损害,与阴性对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)㊂见表2㊂表2 造模后大鼠生化指标结果比较(x±s,U/L)组别鼠只ALT AST模型组5364.20±58.12a515.00±83.51a阴性对照组547.20±12.07105.20±37.69注:与阴性对照组比较,a P<0.05㊂ALT正常范围:23.5~71.9U/L; AST正常范围:76.2~149.5U/L㊂肉眼观察肝脏标本表面明显颗粒样凸起,HE 染色见肝索排列紊乱,肝小叶结构损坏,肝纤维化弥漫整个视野;MASSON染色可见肝纤维化已从中央静脉和汇管区周围向周围延伸,有形成假小叶的趋势,参照Knodell肝纤维化分期标准,肝纤维化分级达3级,提示肝纤维化模型制备成功㊂1.4.2 动物分组及给药 造模结束后,肝纤维化模型大鼠随机分成益气逐瘀解毒颗粒高㊁中㊁低剂量组,扶正化瘀组及模型对照组,每组各8只,另设阴性对照组8只㊂大鼠用药剂量根据等效体表面积公式计算,益气逐瘀解毒颗粒高㊁中㊁低剂量组服用生药分别为10.8g/(kg㊃d)㊁5.4g/(kg㊃d)㊁2.7g/ (kg㊃d),将颗粒用温水溶解后等体积灌胃;扶正化瘀组使用扶正化瘀胶囊,药量为0.405g/(kg㊃d),等体积灌胃浓度;阴性对照组㊁模型对照组也均以等体积的蒸馏水灌胃,每日灌胃1次,连续5周㊂表1 PCR引物序列基因名称引物序列(5'-3')上游下游GIV GCCTTCCGATCCAAGCAATT TGCTAGTGGATGTTCTGCCA Col1A1TCAAGATGGTGGCCGTTACT CATCTTGAGGTC ACGGCATG Col1A2CAAGGTTTCCAAGGACCTGC ATCCATCCAGACCGTTGTGT PKA TTCCCATCCCACTTCAGCTC AAGTTACTCGTGTCCCCAGG CREB GCTGGCTAACAATGGTACCG AGGACGCCATAACAACTCCA β⁃actin GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG1.5 标本采集灌胃5周后,大鼠禁食12小时,用10%苯巴比妥腹腔注射麻醉,开腹充分暴露腹主动脉,采血,4℃离心20分钟,血清存于-80℃保存备用;然后取出肝脏,剪下大小约0.6cm×0.6cm×0.6cm的肝右叶组织,放入10%的中性甲醛中固定,常规石蜡包埋,切片备用㊂另取大小约0.1cm×0.1cm×0.1cm新鲜肝组织-80℃保存,以备实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR,RT⁃qPCR)检测使用㊂1.6 检测指标1.6.1 外周血生化指标检测 ALT㊁AST检测采用速率法,全自动生化检测仪进行检测㊂1.6.2 HE染色㊁MASSON染色进行病理组织学观察 标本取自肝右叶,10%的中性甲醛固定,常规石蜡包埋,切片,分别进行肝组织的HE染色和MASSON染色㊂参照Knodell肝纤维化分期标准,对大鼠肝纤维化程度进行评估,并参照肝纤维化SSS 计分标准,给予每个样本半定量评分㊂1.6.3 免疫组化法检测大鼠肝组织中α⁃SMA的表达 样本切片进行抗原修复,用3%的过氧化氢阻断其内源性过氧化物酶活性,清洗后,按照说明书分别加入一抗㊁二抗,DAB试剂盒显色,脱水㊁透明㊁风干后用中性树胶封片,再加盖玻片,显微镜下观察㊂1.6.4 RT⁃qPCR法检测大鼠肝组织中目标蛋白mRNA的表达 Trizol®Reagent提取转染肝组织总RNA,取纯化后的总RNA进行逆转录,37℃水浴1.5小时以合成cDNA模板进行qPCR检测,经过95℃10分钟预变性,95℃变性15秒,60℃退火㊁延伸15秒,共40个循环㊂以β⁃actin为内参,Col1A1㊁Col1A2㊁GIV㊁PKA㊁CREB基因的相对表达情况㊂1.6.5 Western blot检测大鼠肝组织中目标蛋白的表达 RIPA裂解液及超声破碎,提取大鼠肝组织总蛋白,BCA检测蛋白浓度,SDS⁃PAGE电泳㊁转移至PVGF膜,5%脱脂奶粉封闭,分别加一抗㊁二抗孵育,经ECL发光,X线胶片曝光,显影及定影,并以计算机图像扫描进行图像分析,测定灰度值,代表蛋白的表达量㊂1.7 统计学分析实验所得数据为计量资料,使用SPSS21.0统计软件进行处理㊂以均数±标准差(x±s)来描述计量资料的结果㊂组间结果比较统计分析前,经检验数据符合正态分布且方差齐,采用t检验进行结果分析,P<0.05表示差异具有统计学意义㊂2 结果2.1 生化指标比较灌胃治疗肝纤维化模型大鼠5周后,进行外周血生化指标的检测,结果提示,血清中ALT㊁AST 均在正常范围内,各组之间比较无显著差异(P>0.05)㊂见表3㊂表3 各组肝纤维化模型大鼠生化指标结果比较(x±s,n=8)组别ALT(U/L)AST(U/L)益气逐瘀解毒颗粒高剂量组31.83±4.1685.00±9.07益气逐瘀解毒颗粒中剂量组30.66±5.2786.60±16.05益气逐瘀解毒颗粒低剂量组36.00±3.0392.80±10.91扶正化瘀组41.16±1.8393.60±9.94模型对照组43.80±3.03101.00±17.89阴性对照组31.20±12.0775.50±6.34 2.2 肝组织病理学情况益气逐瘀解毒颗粒各剂量组肝小叶结构大多清晰,中㊁高剂量组胶原纤维主要分布在汇管区㊁中央静脉及其周围,高剂量组仅少数小叶周边可见有纤维组织增生,肝纤维化分级在1级左右;低剂量组中可见少数胶原纤维形成细条索状结构延伸至周围,延伸距离较短,未形成环状结构分割肝小叶㊂模型对照组肝索排列不整齐,纤维组织明显增生,形成较粗的纤维间隔向周围延伸分割肝小叶,同时肝细胞出现明显的空泡样变及点状坏死,汇管区可见扩大,肝纤维化分级多数在3级或以上㊂扶正化瘀组中,部分肝小叶结构被纤维间隔分割㊂见图1㊂与阴性对照组比较,模型对照组SSS评分显著升高(P<0.05);与模型对照组和扶正化瘀组比较,益气逐瘀解毒颗粒高㊁中㊁低剂量组SSS评分显著降低(P<0.05);同时益气逐瘀解毒颗粒各剂量组SSS 评分比较,无显著差异(P>0.05)㊂见表4㊂2.3 肝组织中α⁃SMA含量比较与阴性对照组比较,模型对照组α⁃SMA含量显著升高(P<0.05);与模型对照组比较,益气逐瘀解毒颗粒高㊁中㊁低剂量组α⁃SMA含量显著下降(P<0.05);与扶正化瘀组比较,益气逐瘀解毒颗粒高㊁中剂量组α⁃SMA含量显著下降(P<0.05),低剂量组无显著差异(P>0.05)㊂结果见表5㊁图2㊂注:A:益气逐瘀解毒颗粒高剂量组;B:益气逐瘀解毒颗粒中剂量组;C:益气逐瘀解毒颗粒低剂量组;D:扶正化瘀组;E:模型对照组;F:阴性对照组㊂图1 各组肝纤维化模型大鼠肝组织病理情况(×100)注:A:益气逐瘀解毒颗粒高剂量组;B:益气逐瘀解毒颗粒中剂量组;C:益气逐瘀解毒颗粒低剂量组;D:扶正化瘀组;E:模型对照组;F:阴性对照组㊂图2 各组肝纤维化模型大鼠肝组织α⁃SMA表达情况(免疫组化,×100)表4 各组肝纤维化模型大鼠MASSON染色SSS评分结果比较(x±s)组别鼠只SSS评分(分)益气逐瘀解毒颗粒高剂量组8 2.00±0.63bc益气逐瘀解毒颗粒中剂量组8 4.16±1.33bc益气逐瘀解毒颗粒低剂量组8 5.33±1.21bc扶正化瘀组812.78±8.99b模型对照组826.00±3.28a阴性对照组80.75±0.46注:与阴性对照组比较,a P<0.05;与模型对照组比较,b P<0.05;与扶正化瘀组比较,c P<0.05㊂表5 各组肝纤维化模型大鼠α⁃SMA表达情况比较(x±s)组别鼠只α⁃SMA 益气逐瘀解毒颗粒高剂量组80.86±0.14bc益气逐瘀解毒颗粒中剂量组8 1.33±0.21bc益气逐瘀解毒颗粒低剂量组8 2.00±0.19b扶正化瘀组8 2.28±0.18b模型对照组8 3.69±0.21a阴性对照组8 1.00±0.00注:与阴性对照组比较,a P<0.05;与模型对照组比较,b P<0.05;与扶正化瘀组比较,c P<0.05㊂2.4 肝组织中Col1A1㊁Col1A2㊁GIV㊁PKA㊁CREB 的mRNA表达比较与阴性对照组比较,模型对照组Col1A1㊁Col1A2及GIV的mRNA表达量显著升高(P<0.05),PKA的mRNA表达量显著下降(P<0.05),CREB的mRNA 表达量无显著差异(P>0.05)㊂与模型对照组比较,益气逐瘀解毒颗粒各剂量组Col1A1㊁Col1A2㊁GIV的mRNA表达量显著下降(P<0.05),高剂量组PKA的mRNA表达量显著升高(P<0.05)㊁CREB的mRNA表达量无显著差异(P>0.05),中剂量组PKA㊁CREB的mRNA表达量均显著升高(P<0.05),低剂量组PKA㊁CREB的mRNA表达量无显著性差异(P>0.05)㊂与扶正化瘀组比较,益气逐瘀解毒颗粒各剂量组Col1A1㊁Col1A2的mRNA表达量显著下降(P<0.05),高剂量组GIV的mRNA 表达量显著下降(P<0.05),中剂量组PKA的mRNA表达量明显升高(P<0.05),高剂量组PKA 的mRNA表达量无显著性差异(P>0.05),低剂量组PKA的mRNA表达量显著下降(P<0.05),中㊁低剂量组CREB的mRNA表达量显著降低(P<0.05),高剂量组CREB的mRNA表达量无显著性差异(P>0.05)㊂见表6㊂2.5 肝组织中Col1A1㊁Col1A2㊁GIV㊁PKA㊁CREB 的表达比较与阴性对照组比较,模型对照组Col1A1㊁Col1A2㊁GIV表达量显著升高(P<0.05)㊂与模型对照组比较,益气逐瘀解毒颗粒各剂量组Col1A1㊁Col1A2㊁GIV表达量显著下降(P<0.05),高㊁中剂量组PKA的表达量显著升高(P<0.05),中剂量组CREB的表达量显著升高(P<0.05)㊂与扶正化瘀组比较,益气逐瘀解毒颗粒高剂量组GIV表达显著降低,PKA表达显著升高(P<0.05),中剂量组PKA㊁CREB的表达水平显著升高(P<0.05),低剂量组CREB的表达水平显著升高(P<0.05)㊂益气逐瘀解毒颗粒各剂量组之间Col1A1㊁Col1A2表达无显著差异(P>0.05)㊂见表7㊁图3㊂3 讨论3.1 益气逐瘀解毒颗粒具有抗纤维化作用肝纤维化的病理实质是各种致病原因导致ECM的过度沉积,其中ECM的主要来源是HSCs 的激活[15]㊂因此抑制HSCs的激活,有助于ECM 的减少,改善肝纤维化㊂HSC的活化受多种细胞因子的调控,表型活化改变后α⁃SMA表达是HSCs活化的一个重要标志[16]㊂α⁃SMA参与合成Ⅰ型胶原㊁Ⅲ型胶原㊁纤维连接蛋白等多种细胞外基质成分,促进肝纤维化的发生㊂同时,肝脏ECM成分以Ⅰ㊁Ⅲ和Ⅳ型胶原为主,其中Ⅰ型胶原是纤维间隔非常重要的来源,由Col1A1和Col1A2编码的两条链形成三螺旋结构㊂本实验为验证对ECM的影响,通过免疫注:A:益气逐瘀解毒颗粒高剂量组;B:益气逐瘀解毒颗粒中剂量组;C:益气逐瘀解毒颗粒低剂量组;D:扶正化瘀组;E:模型对照组; F:阴性对照组㊂图3 各组肝纤维化模型大鼠肝组织中Col1A1㊁Col1A2㊁GIV㊁PKA㊁CREB表达情况表6 各组肝纤维化模型大鼠肝组织中Col1A1㊁Col1A2㊁GIV㊁PKA㊁CREB的mRNA表达情况比较(x±s,n=8)组别Col1A1Col1A2GIV PKA CREB 益气逐瘀解毒颗粒高剂量组0.516±0.062bc0.012±0.004bc0.053±0.010bc67.678±17.436b 2.461±1.308益气逐瘀解毒颗粒中剂量组0.614±0.133bc0.017±0.005bc0.125±0.008b79.290±27.011bc 2.176±0.534bc 益气逐瘀解毒颗粒低剂量组0.591±0.079b0.020±0.005bc0.133±0.024b31.096±7.519ac 1.331±0.589c 扶正化瘀组 1.008±0.1650.066±0.004b0.116±0.017b48.316±16.461a 3.529±0.602ab 模型对照组 1.080±0.187a0.134±0.036a0.323±0.078a25.540±7.894a 1.560±0.470c 阴性对照组0.469±0.1730.041±0.0080.154±0.03887.159±45.490 2.250±1.123注:与阴性对照组比较,a P<0.05;与模型对照组比较,b P<0.05;与扶正化瘀组比较,c P<0.05㊂表7 各组肝纤维化模型大鼠肝组织中Col1A1㊁Col1A2㊁GIV㊁PKA㊁CREB表达情况比较(x±s,n=8)组别Col1A1Col1A2GIV PKA CREB 益气逐瘀解毒颗粒高剂量组0.405±0.019b0.059±0.004b0.028±0.003bc 2.232±0.459bc 1.448±0.292益气逐瘀解毒颗粒中剂量组0.377±0.065bc0.235±0.012bc0.226±0.022b 3.282±0.668bc 4.036±0.873bc 益气逐瘀解毒颗粒低剂量组0.426±0.015b0.147±0.004bc0.202±0.136b 1.662±0.243 2.315±1.086ac 扶正化瘀组0.638±0.0120.346±0.018ab0.086±0.017b 1.645±0.477 1.014±0.263b 模型对照组0.814±0.007a0.969±0.014a0.322±0.039a 1.528±0.459 1.946±0.319c 阴性对照组0.374±0.0140.193±0.0190.024±0.009 1.240±0.223 1.191±0.197注:与阴性对照组比较,a P<0.05;与模型对照组比较,b P<0.05;与扶正化瘀组比较,c P<0.05㊂组化法检测大鼠肝组织中α⁃SMA含量,RT⁃qPCR 法和Western blot法检测Col1A1㊁Col1A2表达水平,发现益气逐瘀解毒颗粒各剂量组α⁃SMA含量显著下降,且可显著降低Col1A1㊁Col1A2的表达水平,病理组织学肝纤维化程度显著改善,优于扶正化瘀组和模型对照组㊂3.2 GIV/PKA/CREB在CCl4诱导的肝纤维化发病中的作用肝纤维化发生的中心环节是HSCs的激活, GIV的表达与HSCs的活化之间具有双向调节性㊂GIV通过影响HSCs的迁移㊁增殖及细胞骨架重构活化HSCs,同时活化的HSCs又使GIV的表达量增加,共同促进肝纤维化㊂当GIV表达下调时,可加速HSCs的凋亡,缓解肝纤维化[9]㊂作为G蛋白信号级联的第二信使,cAMP与GIV之间有着重要的关系㊂GIV表达量不足时,cAMP在HSCs中积聚,一方面使HSCs的趋化㊁增殖及胶原合成作用受到抑制,另一方面又可增强基质金属蛋白酶降解胶原的作用[17]㊂此外,GIV的下调还能够有效的调控PKA⁃CREB依赖途径,达到抑制转化生长因子⁃β(transforming growth factor⁃β,TGF⁃β)⁃SMAD蛋白信号的作用[18⁃19],通过负向调控使肝纤维化趋向消退㊂本实验采用RT⁃qPCR法和Western blot法检测大鼠肝组织中GIV表达情况,模型对照组GIV表达水平较其他组明显上调,说明GIV表达上调在肝纤维化发病中具有重要意义㊂经过益气逐瘀解毒颗粒及扶正化瘀胶囊的灌胃干预,发现益气逐瘀解毒颗粒高剂量组GIV表达水平显著降低,并优于扶正化瘀组;而中㊁低剂量组降低GIV表达水平不及高剂量组和扶正化瘀组㊂同时,益气逐瘀解毒颗粒中剂量组中PKA㊁CREB的蛋白表达水平显著上调,优于高㊁低剂量组和扶正化瘀组㊂上述结果说明益气逐瘀解毒颗粒在调控GIV㊁PKA㊁CREB表达方面具有剂量依赖性㊂此外值得注意的是,益气逐瘀解毒颗粒高剂量组显著抑制GIV的表达,但PKA/CREB的表达并没有相应的升高,不及中剂量组PKA/CREB的表达显著,这说明除GIV外,还有其他影响PKA/CREB升高的因素,需要进一步深入研究㊂3.3 益气逐瘀解毒颗粒抗纤维化作用机理分析课题组通过多年的临床及基础研究,结合四川盆地独特的湿热型地域特点,以及肝纤维化病机的复杂性,提出 气虚血瘀,湿热未清”的病机学说,以健脾祛瘀㊁疏肝清热为基本治则,创立益气逐瘀解毒方㊂方中莪术破血逐瘀,黄芪益气扶正,共为君药;党参助黄芪益气,补脾气升清阳,当归㊁川芎补血㊁活血,行气,与逐瘀药同用,使瘀血祛而又不伤阴血;丹参助莪术活血祛瘀,赤芍㊁丹皮清热凉血,活血化瘀,以解未尽之热毒,共为臣药;柴胡㊁黄芩和解少阳,黄芩清泄少阳半里湿热,柴胡疏肝解郁,升达清阳,共为佐药;甘草为使,调和诸药㊂全方配伍得当,标本兼治,化瘀解毒不伤正,益气扶正不碍邪,在健脾祛瘀的同时,通畅气机,清解湿热余毒,可促进肝纤维化的消退㊂纵观本研究实验结果,得出初步结论,益气逐瘀解毒颗粒可显著改善CCl4诱导肝纤维化大鼠的肝纤维化程度,而GIV可能是其关键作用靶点之一,通过降低GIV表达水平,解除对下游抗肝纤维化PKA/CREB信号通路的抑制,使PKA㊁CREB表达水平上升,达到改善CCl4诱导肝纤维化大鼠的肝纤维化程度的目的㊂此外,益气逐瘀解毒颗粒尚可通过调控基质金属蛋白酶及其抑制剂的平衡㊁抑制HSCs的活化㊁降低TGF⁃β1的表达水平等方面达到抗肝纤维化的目的[7,14],表现为多靶点调控的特点,但对关键靶点确认,尚需进一步完善其作用机制㊂参考文献[1] Ralf W,Sabine W,Frank T.Recent advances in understandingliver fibrosis:bridging basic science and individualizedtreatmentconcepts[J].F1000Res,2018,7:F1000Faculty Rev⁃921.[2] Rosenbloom J,Macarak E,Piera⁃Velazquez S,et al.Humanfibrotic diseases:Current challengesin fibrosis research[J].Methods Mol Biol,2017,1627:1⁃23.[3] Ebrahimi H,Naderian M,Sohrabpour A A.New concepts onreversibility and targeting of liver fibrosis:A review article[J].Middle East J Dig Dis,2018,10(3):133⁃148.[4] 谭勤锐.益气逐瘀解毒方抗肝纤维化作用及机制研究[D].成都:成都中医药大学,2017.[5] 杨琪.益气逐瘀解毒颗粒调节Th17/Treg细胞平衡的抗肝纤维化作用机制研究[D].成都:成都中医药大学,2018. [6] 韩朋丽.益气逐瘀解毒颗粒调节Girdin表达治疗大鼠肝纤维化的作用机制研究[D].成都:成都中医药大学,2018. [7] 李晖,谭勤锐,韩朋丽,等.益气逐瘀解毒方抗四氯化碳诱导大鼠肝纤维化的作用研究[J].中华中医药学刊,2019,37(4):956⁃959,1045⁃1047.[8] Eonomoto A,PING J,Tiakahashi M.Girdin,a novel actin⁃binding protein,and its family of proteins possess versatilefunctions in the Akt and Wnt signaling pathways[J].Ann N YAcad Sci,2006,1086:169⁃184.[9] Garcia⁃Marcos M,Ghosh P,Farquhar M G.GIV is anonreceptor GEF for G alpha i with a unique motif that regulatesAkt signaling[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2009,106(9):3178⁃3183.[10] Garcia⁃Marcos M,Ghosh P,Farquhar M G.GIV/Girdintransmits signals from multiple receptors by triggering trimeric Gprotein activation[J].J Biol Chem,2015,290(11):6697⁃6704.[11] Ghosh P,Garcia⁃Marcos M,Farquhar M G.GIV/Girdin is arheostat that fine⁃tunes growth factor signals during tumorprogression[J].Cell Adh Migr,2011,5(3):237⁃248. 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[14] 李晖,杨琪,韩朋丽,等.益气逐瘀解毒颗粒调控MMPs/TIMPs平衡抗大鼠肝纤维化的作用研究[J].新中医,2019,51(5):17⁃22.[15] Tsuchida T,Friedman S L.Mechanisms of hepatic stellate cellactivation[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol,2017,14:397⁃411.[16] 武希润,吕敏和,王琦,等.α⁃平滑肌肌动蛋白表达及血浆转化生长因子β1变化在肝纤维化发生发展中的作用[J].中华肝脏病杂志,2004,12(7):21⁃23.[17] Acquaviva A,Vecchio D,Arezzini B,et al.Signaling pathway⁃sinvolved in isoprostane⁃mediated fibrogenic effects in rat hepaticstellate cells[J].Free Radic Biol Med,2013,65:201⁃207.[18] LIU X,SUN S Q,Hassid A,et al.cAMP inhibits transforminggrowth factor⁃beta⁃stimulated collagen synthesis via inhibitionofextracellular signal⁃regulated kinase1/2and Smad signaling incardiac fibroblasts[J].Mol Pharmacol,2006,70(6):1992⁃2003.[19] 谭勤锐,李晖,杨超.转化生长因子⁃β1调控与肝纤维化治疗的研究进展[J].广东医学,2015,36(13):2109⁃2111.(收稿日期:2022⁃12⁃02)(本文编辑:张楠)。
片仔癀对四氯化碳诱导肝纤维化大鼠肝功能及核因子-κB蛋白表达的影响
片仔癀对四氯化碳诱导肝纤维化大鼠肝功能及核因子-κB蛋白表达的影响郑海音;华丽萍;张玉琴;王晓颖;徐伟【摘要】目的观察片仔癀对CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝功能和核因子-κB(NF-κB)蛋白表达的影响,探讨其作用机制.方法将24只大鼠随机分为正常对照组、模型组、片仔癀组、秋水仙碱组,每组6只,50％CCl4灌胃8周制备肝纤维化模型.末次给药1 h后,血清测定ALT、AST、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原、层黏连蛋白和透明质酸含量,取肝脏计算肝指数,HE染色和VG染色观察肝组织病理形态,Western blot 检测NF-κB蛋白表达.结果与正常对照组比较,模型组大鼠肝指数及ALT、AST、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原、层黏连蛋白、透明质酸含量和NF-κB蛋白表达明显升高(P<0.01);与模型组比较,各给药组大鼠肝指数及ALT、AST、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原、层黏连蛋白、透明质酸含量和NF-κB蛋白表达均明显降低(P<0.01).结论片仔癀对CCl4所致肝纤维化大鼠具有保护作用,其机制可能与抑制NF-κB的表达有关.【期刊名称】《中国中医药信息杂志》【年(卷),期】2019(026)004【总页数】4页(P57-60)【关键词】片仔癀;肝纤维化;核因子-κB;大鼠【作者】郑海音;华丽萍;张玉琴;王晓颖;徐伟【作者单位】福建中医药大学中西医结合学院,福建福州 350122;福建中医药大学药学院,福建福州 350122;福建中医药大学药学院,福建福州 350122;福建中医药大学药学院,福建福州 350122;福建中医药大学药学院,福建福州 350122【正文语种】中文【中图分类】R285.5肝纤维化是由多种原因引起的慢性肝损伤所致的病理改变，以过度的细胞外基质（ECM）沉积和纤维状结构为特征，纤维疤痕破坏正常肝结构而影响肝功能最后导致肝衰竭[1-2]。
肝纤维化的进展往往与肝硬化及肝癌有关[3-4]。
肝纤维化虽可逆，但由于对病因及发病机制缺乏全面深入了解，至今临床上未有上市的抗肝纤维化药物[5]。
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又 双 丙 烯 酰 胺 、苯 甲 基磺 酰 氟 （ ＭＳ 、超 纯 尿 Ｐ Ｆ）
素 、过 硫 酸 铵 、Ｎ，Ｎ，Ｎ 四 甲基 乙 二 胺 ，Ｎ 一 （ ＭＥ 、二硫 苏糖醇 （ ＴＴ） ＴＥ Ｄ） Ｄ 、甘 氨 酸 、甘 油 均 购 于 Ｂ Ｉ 司 ；３ ［ 一 （ 酰 胺 基 丙 基 ） 甲 氨 Ｂ 公 ～－ ３ 胆 二
四 氯 化 碳 （ Ｃ 是 工 业 实 验 室 常 用 的 溶 剂 ， 具 Ｃ １） 有 很 强 的 毒 性 作 用 ，可 引起 中枢 神 经 系 统 、 肝 、 肾
Ｗ ｉ ａ 大 鼠 为 研 究 对 象 ，运 用 蛋 白 质 组 学 技 术 比 ｓ ｒ ｔ
较分析 了 Ｃ １ 伤 大 鼠的肝 细 胞蛋 白质 表达 谱 的 Ｃ 损 变化 ，对差 异 蛋 白进 行 质谱 鉴 定 ，为 寻 找 Ｃ １ Ｃ 致 肝纤维 化早 期生 物效应 的相关 蛋 白提供实 验基础 。
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工 业 卫 生 与 职 业 病 ２０ ０ ８年 第 ３ ４卷 第 ３ 期
Ｉ ｄＨ ｌ ＆ Ｏｃ ｕ ｓ ２ ０８， Ｖｏ１ ３ ，Ｎｏ．３ ｎ ｔ ． ｃ ｐ Ｄｉ ｈ ０ ． ４
【论 著 】
四氯 化碳 诱发 大 鼠肝脏 蛋 白质 表达 变 化的 分析
色按 照 Ａｍｅｓ ａ ｈ ｒ ｃ 公 司推 荐 的方 法进 行 ｒｈ ｍ Ｐ ａｍａｉ ａ 考染 和银 染 。用 Ｉ ｇ ｃｎ ｅ ｍａ ｅＳ ａ ｎ ｒⅡ光 学扫 描仪 扫 描 凝 胶 ，利 用分 析软 件 Ｉ ｇ ｓｅ ２ ｌｔ ｕ ｍａ ｅ Ｍａｔｒ Ｄ Ｐａｉ ｍ进 ｎ
Ａｍｅｓｏ 司 ；低 分 子 量 标 准 蛋 白质 购 于 上 海 生 化 ｒｃ 公
１ ３ ４ 胶 内酶切及 质 谱 分析 用 解 剖 刀 片沿 染 色 ．． 边缘 切下 选定 的蛋 白点 ，乙腈 、碳酸 氢铵 混合液 振 荡脱 包至蓝 色褪尽 ，乙腈 脱水 ２次 ，加入 １ ｇ ｍｌ ０ｔ ／ ￣ 胰 蛋 白酶 ，４ ￣ 置 ３ ｉ ，３ ℃ 保 温 过夜 ，取 上 Ｃ放 ０ｒ ｎ ７ ａ 清 液 ，再 用三 氟 乙酸和 乙腈 混 合液提 取 ２次 ，合并 上 清液 ，浓缩 至 ４ １ ～５ｔ ，获得 肽 混 合 物 样 品 ，进 Ｌ 行 基质辅 助激 光解 吸飞 行 时 间质 谱 （ ＭＡＬ Ｉ ＯＦ Ｄ— Ｔ — ＭＳ 分析 ，获得 的 图谱在 ＮＣ Ｉ ） Ｂ 数据 库 中搜 索 。
Ａｎ ｌ ａ ｙ ｉ ｎ Ｐｒ ｔ ｉ ｐｒ ｓ ｉ ｎ Ｖａ ｉ ｔｏ
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维 化早 期 生 物 效 应 的 相 关 蛋 白 提 供 实验 基 础 。方 法
大 鼠血 清生 化 指 标 和 观 察 肝 组 织病 理学 的变 化 ，提 取 大 鼠肝 细 胞 总 蛋 白 并 采 用 二 维 凝 胶 电 泳 （ － Ｅ 进 行 分 ２Ｄ ） 离 ，Ｉ ｇ ｓｅ Ｄ Ｐａｉｕ 软 件 分 析 电 泳 图谱 ，选 择 表 达 有 显 著 差 异 的 蛋 白 点进 行 基 质 辅 助 激 光 解 吸 电 ｍａ ｅ Ｍａｔｒ ｌ ｎ ｍ ２ ｔ 离 飞行 时间 质 谱 （ Ａ Ｉ Ｏ — ） 定 。结 果 大 鼠血 清 生 化 指 标 和病 理 学 结 果 提 示 肝 纤 维 化 造 模 成 功 ， Ｍ Ｉ — Ｆ ＭＳ 测 Ｄ Ｔ Ｃ Ｉ 伤 组 肝 细 胞 蛋 白 质 ２Ｄ Ｃ 损 － Ｅ图 谱 表 达 发 生 改 变 ， 差 异 点 经 ＭＡＬ Ｉ ＯＦＭＳ分 析 和 数 据 库 搜 索 ，鉴 定 Ｄ— Ｔ — 出 ４个 已知 序 列 蛋 白 。 结论 应 用 蛋 白质 组 学 技 术 筛 选 和 鉴 定 出 的 蛋 白 可 能 与 肝 纤 维 化 的 发 生 发 展 有 关 ，
为进 一 步 研 究 Ｃ Ｉ 发 肝 纤 维化 机 制 提 供 依 据 。 Ｃ 诱 【 关键 词 】 肝 纤 维 化 ；四 氯化 碳 ；二 维 凝 胶 电泳 ；蛋 白质 组
［ 图分 类 号 ］ Ｒ １ ５ １ 中 ３ ，
［ 献 标识 码］ Ａ 文
［ 章 编 号］ １０ —１４ ２ ０ ）３０ ４—３ 文 ０ ０７ ６ （０ ８ ０ —１６０
１ １ 试剂 与仪器 ．
Ｉ ｍｍｏ ｉｎ Ｔ ｙ ｔ ｐ 干 胶 条 （ Ｈ ３～ １ ， ｂｌ ｅＭ Ｄｒｓｒ ｉ ｉ ｐ ０
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徐 乃 玉 ，等 ． 四氯 化 碳 诱 发 大 鼠肝 脏 蛋 白质 表 达 变 化 的 分 析
１ ｃ 、 Ｉ Ｇ Ｂ ｆ ｒ ｐ ～ １ ） 于 Ａｍｅｓ ａ 公 ｍ） Ｐ ｕｆ （ Ｈ３ ０ 购 １ ｅ ｒｈ ｍ 司 ；Ｔ ｉ、十 二 烷 基 磺 酸 钠 （ Ｄ ） 丙 烯 酰 胺 、 甲 ｒ ｓ Ｓ Ｓ、
行点 的检 测 、背 景 消 减 、分 子 量 和 等 电 点 校 正 、
归 一化 处理 分析 蛋 白 图谱 ， 当不 同胶 匹 配 点 的相 对 含量 比值 ＞ ２或 者 ＜ ０ ５时 ，可 认 为 匹 配 点 间 ．
存 在差 异 。
基］ 丙磺 酸 盐 （ ＣＨＡＰ ） ｓ 、碘 代 乙 酰 胺 、硫 脲 购 于
ｍｏ ｅ ｗａ ｎ ｕ ｅ ｂ ｕ ｃ ｔｎ ｏ ｓ ｉｊｃｉｎ ｏ Ｉ ｎ ｅｕ ｂｏ ｈ ｍｉａ ｒ ｅ ｓｗｅｅ ｄ ｔｒ ｎ ｄ ａ ｄ ｄ ｌ ｓ ｉｄ ｃ ｄ ｙ ｓ ｂ ｕａ ｅ ｕ ｎｅ ｔ ｆＣＣ ｛ａ ｄ ｓ ｒ ｍ ｉｃ ｅ ｃｌｍａ ｋ ｒ ｒ ｅｅ ｍｉｅ ｎ ｏ
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徐 乃 玉 张 素 萍 聂继华 ， ，丁 建松 ，童建
，
（ ．苏 州大 学 药 学 院 ，江 苏 苏 州 ２ ５ ２ ；２ 苏 州 大 学 放 射 医 学 与 公 共 卫 生学 院 ， 江苏 苏 州 ２ １ ３ １ １１ ３ ． １ ２） ５
【 要 】 目的 摘
分 析 四氯 化 碳 （ Ｃ 诱 发肝 纤维 化 大 鼠 肝 脏 细 胞 蛋 白 表 达 的 变 化 ，为 寻 找 Ｃ Ｉ 肝 纤 Ｃ Ｉ） Ｃ 致 采 用 皮 下 注 射 Ｃ Ｉ 发 实 验性 大 鼠肝 损 伤 模 型 ，测 定 Ｃ 诱
损 害 ，严重 者可引 发肝硬 化甚 至肝癌 。蛋 白质组学 研 究方 法对疾 病发病 机制研 究及 发现疾 病标 志物 和