09转基因动物研究及其进展

• 2. 抗流感基因工程育种
Aunheiter等将MXI蛋白的cDNA导入对流感病 毒敏感的小鼠受精卵,获得了抗病转基因小鼠。 3. 抗肿瘤动物模型 美国培育出易发乳腺癌的转基因小鼠，为研
究癌诱发和抗肿瘤药物筛选提供了研究的动物模
型。迄今已培育出许多与癌基因有关的转基因小
鼠。
（三）用作生物反应器生产昂贵药物
1.概述
利用生物反应器包括细菌基因工程、细胞 基因工程、转基因动物生物反应器可以生产 出各种稀有的、用其它方法不易得到的有生 物活性的各种药用蛋白，其中研究最深入、 应用最广泛的是转基因动物生物反应器。
二、转基因动物的技术方法
（一）上游—基因改造与载体构建
为了改进产品的功能和知识产权以及 特异性高效表达，需对外源基因进行有目 的得改造，并构建载体。 改造并构建的外源基因可能包含调控 元件的旁侧序列、结构基因序列和转录终 止信号，同时还可引入报告基因与天然启 动子。将强启动子序列与目的基因拼接成 融合基因。
1994年德国成功培育出转入生长素的转 基因猪，出现了壮如小牛的“超级猪”。
生长激素(GH)基因转移:表达水平差异很大
动物 猪 猪 研究者 Pursel 陈永福,魏 庆信等 小鼠 李宝林 1990 发表时间 1989 1995 结 果
饲料利用率提高17%,胴体脂肪 降低50% 饲料利用率提高10%,生长速度 提高11.8%～14.2%,瘦肉率有所 增加 产出116只小鼠,4只生长快速, 比对照小鼠大0.8～1.2倍,但雌 鼠的生殖功能受到一定损害 结果与猪类似
外源基因的拷贝 数
中等
1%～10% 中等 高 低
高
约100% 低 低 中等到高
中等
约20% 低 低 中等
低
100% 无 可选择 低
多位点整合
（三）下游—基因整合、表达检测与转 基因动物克隆以及产品的纯化或利用
1. 基因整合与表达检测 （1）DNA水平：可采用Southern 印迹杂交、原位杂交、Dot杂交法或 PCR进行检测； （2）RNA水平：用Northern blot 杂交方法或RT-PCR法； （3）蛋白水平：可用Western blot法分析。
只定点整合的转基因羊，并申请了专利，用于一些人类蛋
白的开发。 • 毫无疑问，该方法产生个体的外源基因整合率为100%，但 是核移植技术难度较大，成功率较低，且胎儿成活率不高。
5. 胚胎干细胞介导法：
将外源基因导入ES细胞后在体外培养增殖，
经过筛选扩增以后将其植入正常发育的囊胚腔中，
ES细胞会很快地与受体内细胞团聚集在一起共同 参与正常胚泡的发育，从而发生个体基因的转移。
• 该方法能大大提高整合率,且技术难度不高, 实验成本也较低,但存在着携带的外源基因 大小受到限制、会产生多位点整合导致后 代遗传差异以及外源基因的表达受到影响 等不足。
反转录病毒法生产转基因动物的流程图
3. 精子载体法：
即将外源基因片段与获能精子一起孵育，然
后用携带有目的基因的精子进行人工授精。此方 法的最大优点是不需要昂贵复杂的设备，而且可 省略不少繁杂的操作。
获得嵌合体小鼠 均获得成功 得到可遗传的转基因动物 制备出Hprt基因定点突变的转 基因小鼠 成功
7只鸡活到性成熟,1只公鸡给后 代传递外源基因 注入后24h或85～90h,有47.6% 胚体表达了外源基因 突破体细胞核克隆,获得带有人 基因的Polly羊
国内转基因动物研究首创记录
发表 时 间 单位及研究者 基因种类 转入 动物 结果
2. 反转录病毒感染法：
RNA病毒感染宿主细胞后，反转录成相应的 DNA，并整合到宿主的染色体DNA上，得到转基因 动物。这是最早使用的动物转基因方法。 1998年，Chan等将携带外源基因的复制缺陷 型病毒注入到牛MII期卵子的透明带下，然后经 过体外受精与胚胎发育，桑椹胚中整合阳性率高 达56%。
转基因动物的基因导入方法
向受精卵雄（精）原核注入DNA
显微注射法转基因的效率
动物 种类 小鼠 家兔 大鼠 绵羊 猪 牛 注射胚胎数 12314 1904 1403 5424 19397 1018 后代数 转基因动 备注 物（%） 1847 2.6 18 次 218 353 556 1920 193 1.5 4.4 0.9 0.9 0.7 1次 5次 10 次 20 次 7次
ES细胞制备转基因
三种转基因方法图解
wenku.baidu.com
几种不同转基因方法比较
原核注射 基因准备 转移基因大小 定点整合 技术要求 胚胎存活 易 中等 有可能 高 中等 反转录病毒 感染 难 小 不可能 低 高 精子携带 易 无限制 不可能 低 中等 体细胞核移植 中等 无限制 有可能 高 低
胎儿存活 转基因胎儿比 例 嵌合体的比例
报告基因
• 绿色荧光蛋白(GFP)基因：在蓝光的激发下
可发出绿色荧光，可活体观测 • ß-半乳糖苷酶基因（ ß-gal） • 氯乙酰转移酶基因（CAT）
• 荧光素酶基因
• 人生长素基因（hGH）
转入基因结构
1.含MAR序列、微卫星序列的转入基因结构； 2.tPA转基因鼠的转入基因结构
（二）中游—基因转移、胚胎 移植与建系 将已构建好的携带外源基因 的基因载体系统通过转基因技术 导入细胞内，最后通过胚胎移植 获得后代。
细胞的分裂而增殖，在动物体内得到表达，
并能稳定地遗传给后代。
• 随着转基因技术的发展，转基因动物育种与生产
性能提高、生物反应器、器官移植以及基因治疗
与免疫等方面的研究广泛地开展了起来，特别是
乳腺反应器在生物制药方面显示出了巨大的应用
前景。
国外转基因动物研究首创记录
发表时间 1974 1980 1981 研究者 Janisch Gordon等 Constantini等 基因种类 SV4DNA HSV-TK基因 兔β-珠蛋白基因 转入动物 小鼠 小鼠 小鼠 结果 40%子鼠器官中整合有 外源基因 78只子鼠中有2只为转基因鼠 24只子鼠中有9只为转基因鼠
转基因动物研究及其进展
王 锋 王子玉
动物科技学院 动物胚胎工程技术中心
• 一、概 述 • 二、转基因动物的技术方法 • 三、转基因动物的研究现状及 应用 • 四、转基因动物研究面临的问 题
一、概 述
转基因动物就是用实验室方法将人们需
要的目的基因导入动物的受精卵，使外源
基因与动物本身的基因整合在一起，并随
羊
Rexroad
1991
例如：
改善食物质量 – 通过操作生物合成途径，减少或改变脂 肪成分（瘦肉/脂肪比率）。 增加食物数量 – 饲养效率、转化率、畜牧的数量和大小。 提高天然畜牧产品 – 羊毛、皮革、脂肪、牛奶(酪蛋白、 乳糖、脱脂乳)等。
存在问题 ：
生长激素转基因猪 – 关节疾病、骨骼
异常、代谢率增加、胃溃疡和不育。
1984
发育所路德裕 等 发育所史瀛仙 等 发育所于建康 等
β珠人蛋白
小鼠
个体大，基因可连续传递，但表型似不能保持DNA 能转录成RNA的小鼠 体型大，未能转录成RNA的不大，说明基因在体内 一定要转录成RNA，并翻译成蛋白质，才能起促进 生长的作用 产21只，2只的DNA中含有大肠杆菌galk和gpt基因
它在理论研究和实践应用中都将起到重要作用。
4. 整合外源基因体细胞核移植的方法
Schnieke等用阳离子脂质体介导外源 基因转染到培养的绵羊胎儿成纤维细胞中， 然后将细胞融入去核卵母细胞中，经激活 后在体外培养至囊胚移入同步受体母羊中， 最后获得6只转基因绵羊。
• Cibelli 等用此方法获得了3只转基因牛。英国PPL医药公 司将外源基因插入培养的动物体细胞染色体的特定位点， 然后筛选出阳性细胞进行核移植，通过该技术已获得了两
DNA与精子共培育
受精卵细胞
体外培养
移植到受体羊
筛选阳性动物
• 1989年，Lavitrano等首次报道用活精子作为载体进行转 基因获得了转基因小鼠，但一直存在着争议。 • 1999年，Perry等先通过去垢剂、冻融或冻干来破坏小鼠
精子的膜,促使外源基因在与精子共孵育时能结合在精子 表面甚至接触到高密度的精子ＤＮＡ，然后将精子通过胞 质内精子注射的方法注入ＭⅡ期小鼠卵子中，从而可以避 免外源基因在胞质内被降解，获得了64%～94%的表达外源 基因的胚胎，以及17%～21%携带外源基因的个体。
• 该方法应用前景好，容易操作，可以利用大片段外源基因。
外源目的基因进入精细胞可通过与精子共育 法、电穿孔导入法和脂质体转染法。 DNA与精子共育法是将0.5ml精液与溶于TBS 溶液中的100μlDNA直接混合，或先以含BSA的 PBS对精液进行稀释，使其浓度达1×106-1×103 个/ml，再取0.5ml与100μl上述DNA混合，孵育 20～40min。
1986
牛及人生长激素 大肠杆菌galk和gpt基 因
小鼠
1987
小鼠
1995
北京农大陈永 福等 中国农科院畜 牧所黄少华等 江苏农科院 范必勤等
上海儿童医院 曾溢滔,黄淑浈 上海儿童医院 曾溢滔，黄淑 浈
ZPL线性化的DNA导 入猪受精卵 微注射SMT-PGH基因 到猪早期胚胎
用体外获能的精子为 载体，通过体外受精 导入基因 人凝血因子
2. 转基因动物克隆以及产品的纯化或 利用 对转基因动物进行克隆，可以由 一头转基因动物生产出性能一致的群 体。获得的转基因动物要进行合理的 饲养管理和利用。从乳腺反应器获得 的产品作药用，纯度极高，需要纯化 技术。
三、转基因动物的研究现状及应用
（一）改良动物的生产性能
利用转基因技术,将所需的优良基 因直接转入待改良群体中,增加新的遗 传品质，形成优良的转基因畜禽,从而 改良畜禽生产性能，如生长速度、繁 殖率、瘦肉率、产毛量等，最终培育 成满足人们需要的、具有优良品质的 畜禽及鱼类新品系。
• 电穿孔导入法是通过高压电场使胞浆膜通透性产
生暂时的可逆性变化，从而使DNA分子进入细胞内， 并于染色体DNA整合。
• 脂质体转染法是通过脂质体与DNA相互结合形成脂
质体-DNA复合物，复合物可以很容易得与胞浆融
合，使DNA进入到细胞内部，部分整合到染色体上。
直接共育法DNA吸附到精子上的水平较低，但由 该精子获得的受精卵整合外源DNA水平较高，几 乎占受精卵数量的50%。 电穿孔精子虽然吸附DNA水平较高，但由于该精 子受精的卵及胚胎整合的DNA水平最低，可能是 电穿孔后精子顶体遭到破坏所致。 相比而言，用脂质体-DNA转染的精子受精的卵表 现出正常的活力，外源DNA的整合率也最高。
猪
获转基因猪。为避免猪过早死亡，采用先传代后诱 导表达法 妊娠率随移入胚胎数的增多而提高，以20～29枚为 宜 建立新的基因导入方法
1996
猪
1997
猪
1998
山羊
产出5只转基因山羊，其中1只母羊乳汁中含有凝血 因子
1999
人血清白蛋白
奶牛
移植8头牛，妊娠3头，产1头公牛，携带有人血清白 蛋白基因。
1982
1985 1985 1986 1987 1988 1990 1994 1994 1998
Palmiter
Wagner等 Hammer等 Robertson等 Thomas等 Biery等 Hochi,Mullius和 Ganten等 Love等 Ono等 Wilmut等
将MT启动子和大鼠GH 基因拼接成的融合基因
• 利用精子作为目的基因的载体，进而制备转基因动物，在 实践中还存在分歧，其具体机制也还不清楚。但由于这一 技术至少是从构想上，对于大牲畜的转基因研究具有潜在
的重要意义，尤其是只需通过人工受精技术就能完成DNA
到胚胎的转移。 • 因此，有关利用精子作为载体的试验在猪、禽类及牛等动
物中不断有报道出现，目前这一技术在不断完善和发展，
（二）抗病育种
利用干扰素、白介素等细胞因子的DNA或cDNA及核酶
等导入细胞，转化细胞，使之获得抗病毒感染能力，
希望形成抗病毒感染新品种。 1. 抗猪瘟基因育种 谢庆阁等设计合成了阻断猪瘟病毒复制的核酶 (ribozyme)基因，研究了其抗病毒感染的功能。郑新
民等（1998）获得了抗猪瘟病毒的转基因猪。
拼接有Neo基因的逆转录 病毒 制备转基因 MPSA-mos-Neo逆转录病 毒 利用ES细胞法结合同源 重组技术 牛转基因 大鼠 线性质粒 基因微注射 绵羊乳腺细胞
侏儒小鼠
小鼠 兔、羊、猪 感染ES细胞 小鼠 牛 同时报道转基因大 鼠制备成功 鸡 鹌鹑 绵羊
7只转基因鼠中,6只生长加快, 明显增大