转基因动物研究概况
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49
4、细胞制备完毕，按常规方法制成外周血淋巴细胞的染色体标本。 5、用地高辛 （Dig－11－dUTP）通过缺口翻译的方法标记探针。 6、将标记好的探针去杂交固定在玻片上的猪染色体，分子杂交之后， 在PBS中洗涤玻片，并在除去多余的PBS之后，立即滴上胶体金标 记反应液（10μl胶体金标记的抗Dig抗体，加290μl含1mg/ml BSA 的PBS），室温下反应30分钟，用净水多次洗涤，除去氯离子。 7、在每张玻片上滴100μl银增加剂，在室温中避光放置30分钟，洗去 反应剂。 8、标记完毕的染色体标本经Giemsa和Hoechst33258染色显带，玻片 自然干燥后就可以在显微镜下观察结果。 在显微镜下挑选中期相染色体清楚的细胞数十个到数百个， 计算有银粒附着的频率，将银粒附着频率最高的染色体位点，定 为外源基因整合的位点。
23
眼肌面积测量
最后肋骨处 背最长肌 横断面面积， 用硫酸纸描绘 眼肌面积 （2次）
24
眼肌面积测量2
• 用硫酸纸描绘眼肌面 积（ 2 次），用求积仪 或方格计算纸求出眼 肌面积（cm2） • 或用下列公式：眼肌 面积（ cm2 ） = 眼肌高 度（ cm ）×眼肌宽度 （cm）×0.7 眼肌高度
• 脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(A-FABP)基因, Ch4, IMF
• 猪肌肉生长抑制素(MYOG), Ch9, 瘦肉率
32
兰尼定受体(RYR1)/氟烷基因(Hal)
1843C>T突变位点是造成猪应激综合症的主效基因位点。
Hha Ⅰ酶切
对于Hal基因，淘汰nn、Nn个体，留用NN个体。
33
雌激素受体基因(ESR)
38
三、转基因技术体系的建立
（一）母猪的超数排卵 直到目前为止，全世界生产转基因猪的主要 方法仍然是直接向单细胞的胚胎注射纯化的DNA 分子。在这种技术体系中，对母猪进行激素处理， 使其生产大量受精卵，是生产转基因猪的先决条 件。 要点：1、摸索出超排时激素的最佳剂量 2、多获得处于单细胞阶段的原核期的胚胎
42
在注射PMSG之后的124-129小时之间冲卵，可以 获得较高比例的单细胞胚胎(表6-2)。
• 在注射 HCG 后立刻进行自然交配或人工授精。 大群猪的超排实验证明，激素处理可以使受精卵 的获取量提高 2.1倍。
43
（二）自体移植技术在提高转基因猪生产效 率中的作用
自体移植：就是从一头猪的体内冲出单细胞胚胎之后，经 体外注射DNA处理，再把胚胎移植回同一头猪的体内。 条件：
眼肌宽度
25
肉质性能
• • • • • 水份、 蛋白质、 肌内脂肪、 大理石纹 其它指标
26
3、猪是单胃动物，饲料的主要成份是粮食和 块根、块茎。所以，猪的饲料和人的口粮是 竞争性关系，不是互补的关系。养猪太多和 猪的饲料转化效率太低，将会给种植业带来 很大负担。
27
28
养猪主产区主要分布在粮食主产区应为比较 合理的布局
44
优点：不但可以省去受体猪，而且猪的受孕率和产 仔率均显著高于异体移植（表6-3）。 原因：有可能是胚胎与母体发育同期化的程度比异 体移植的受体好，也可能胚胎和母体间的相容性 比异体好。
45
（三）外源GH基因定位和考贝数的测定
转基因猪的筛选一般是用PCR扩增特 异DNA片段或用斑点杂交作为初筛手段， 然后用southern杂交来进一步证实。
4
肉产品结构
Meat structure,%
鸡肉 20%
chicken
牛羊肉 15%
Beef and mutton
猪肉 65%
pork
5
• 2、由于国土面积辽阔，各地自然条件差别 很大，加上农业生产的产业化程度较低， 猪的品种主要是历史上形成的各种地方品 种及其杂交种。这些品种的优点是耐粗饲 和肉的风味好，缺点是瘦肉率低，生产单 位体重需要的饲料较多。
51
四、转基因猪的生产
此表列出了课 题生产转基因 猪的情况，同 时在表中也列 出了美国、英 国和澳大利亚 进行同类实验 的数据，以资 比较。
52
五、外源基因的遗传稳定性
外源基因一旦整合到猪的染色体上，其遗传是稳定的。
例：一个家系的4代转基因猪中外源GH基因的追踪试 验，可以肯定地证明从G0代传到G3代时，基因仍稳 定地整合在同一条染色体上(表6-7)。这个家系的猪都 在第13号染色体上含有外源的生长激素基因。
6
不同品种猪-毛色
黑色
毛色为黑白花、除头、耳、背、 腰、臀为黑色外，其余均为 白色，黑白交界处有4～5cm 的黑皮白毛的灰色带 7
毛色为中间白，两头乌 为特征。又称“两头乌”。但也 有少数猪在背部有黑斑。
体毛黑色， 四肢末端为白色
8
全白
棕红色
9
被毛黑色，在肩和 前肢有一条白带围绕
被毛灰白，夹有黑斑， 杂有部分红色。
41
什么时候冲卵可以得到较高比例的单细胞胚 胎，要靠大量实验才能找到。
• 除了促进母猪多排卵以外，多获得处于单 细胞阶段的原核期的胚胎也是至关重要的， 因为只有胚胎在单细胞阶段时，才能用于 基因转移。但是，猪是持续排卵的动物， 卵子从卵巢上排出是一个连续过程，从排 出第一个卵到排出最后一个卵，往往要持 续数小时。
31
此外一些与猪生产性能有关的基因
• 猪应激敏感基因(RYR1), Ch6, PSE肉, 应激
• 雌激素受体基因(ESR), Ch1, 产仔数
• 促卵泡素β亚基基因(FSHβ), Ch2，产仔数 • RN基因, Ch15, 酸肉, Napole产量 • 黑素皮质激素受体4(MC4R)基因, Ch1, ADG,BF,FI • 心脏脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因, Ch6, IMF
第九章
我国转基因动物研究概况
1
转基因动物前景广阔
提高动物的生长速度 改善畜产品的品质 珍稀药用蛋白的生产 （生物反应器或乳房生物反应器）
提供器官移植的供体
2
3
第一节 猪的基因工程育种
一、立项背景和研究目标 1、我国是传统的养猪大国，是世界上养猪最 多的国家。
就全国而言,生猪存栏和出栏基本保持平稳发展, 存栏和出栏呈现同步发展的趋势。2008年3月存栏 4.1亿头，6月达到4.7亿头。能繁母猪比重超过12%。
ESR基因是影响猪产仔数的主效基因
发现BB 型比AA 型猪头胎总产仔数高3.37 头
PvuⅡ酶切
34
目的基因的分离和表达载体的构建
以猪生长激素为例
克隆的猪生长激素基因全长约5.0kb，由4个外显子和3
个内含子以及5ˊ端和3ˊ端调控序列组成。
猪生长激素Genomic基因结构序列被置于羊MT基因启动 子控制之下，转基因在猪体内将受重金属离子诱导而表达。 5′MAR有屏蔽相邻基因影响的作用，而3′端增加微卫星旨在 提高整合率。
10
头型
头大，额皮中部 隆起成块，俗称 “盖碗”
嘴筒长直
11
头中等大，面直
头中等大，面微凹
12
猪的耳型描述
耳大下垂
耳大下垂
13
耳小而立
耳小向前平伸，
14
耳型
耳特大，下垂
耳小竖立
15
耳型
耳小向前平伸 耳中等大，竖立
16
体型
腹大下垂，背平
腹大拖地，背凹
17
体型
腹大下垂，不拖地
腹大下垂，不拖地
18
四肢
外展
内展
X型
19
几个概念
• • • • • 活体重 胴体重 瘦肉率 眼肌 肉质性能
20
猪的宰前活重（kg)
• 宰前12小时停食称重 • 屠宰日龄按当地习惯 并注明 •
21
胴体重
• • • • • 胴体重：去除头、 蹄、尾、内脏、 包括板油、肾的 左右两半胴体 总重。
22
瘦肉率
• 用手工剥离半胴体,分 成瘦肉、脂肪、皮、 骨四部分，分别称重， 再相加，作为100%； （不计算分割过程中 的损耗，不包括板油、 肾 ）。分别计算瘦肉、 脂肪、皮、骨所占的 比例。
50
一般文献中计算基因整合的考贝数，都是比较样品 DNA 与 质粒 DNA 标记物的强度，大致估计出外源基因的考贝数。 我们在研究中采用了放射性标记物计数的方法，也可以估计 基因的考贝数。 计算基因整合的考贝数： 方法： 1、提取组织中的DNA，再用同位素标记的探针去杂交，制 成一系列浓度梯度样品。 2、利用FJ-2101型双道液体闪烁计数器计算样品放射性读 数，按公式计算不同样品基因考贝数，取其平均数作为外 源基因整合的大致考贝数。
46
PCR
SOUTHERN
47
• 但是，对于培育转基因品种和目的基因稳 定性研究来说，只知道基因是否已经整合 是不够的，还应当知道基因在染色体上的 整合位点和整合的考贝数。
48
方法：
1、选用经过斑点杂交和southern杂交证明是转基因阳性的猪 6头，从静脉采血各5毫升，盛入放有肝素的生理盐水中摇 匀并放在4℃中静置，使红血球沉降至管子的底部。 2、取上层的血浆层0.5毫升，接种于含有青霉素、链霉素和 20％胎牛血清的RPM1/1064培养基中，使血淋巴细胞增 殖．经过在37℃下培养60小时后，加入100μg/ml 5ˊ-Brd11，继续培养12小时。 3、经过洗涤之后，将细胞重新悬浮在含有2.5μg／ml胸腺嘧 啶的新鲜培养基中，放置在37℃下再培养6小时，并于培 养结束之前30分钟加入秋水仙素0.04μg/ml。
53
54
六、转基因猪的生产性能
1、经过对三个世代的转基因猪进行严格的饲养实验， 证明表达外源性生长激素基因的确可以提高猪的生长 速度，饲料转化效率和瘦肉率。 2、在饲料中蛋白质含量达到18％ 的条件下，转基因猪 的生长速度提高10－15％，饲料报酬和瘦肉率提高 10％ 左右。与美国Pursel等和澳大利亚Vize等得到 的结果很相似（Pursel et al 1989; Vize et al，1988 年）。
Hale Waihona Puke Baidu39
40
例：湖北白猪
应该在发情周期的第15-18天，按每公斤体重一次肌 肉注射15个单位的用孕马血清促性腺激素 PMSG，促进 卵巢上卵泡的发育。在注射PMSG第72小时，每头猪一次 注射人绒毛膜促性腺激素 HCG500单位，促进卵子的排 出，并在注射HCG后立刻进行自然交配或人工授精（表61）。
35
为了能够人为地控制外源性猪生长激素基因的表达，采取了 基因融合表达的战略，用羊的重金属螯合蛋白 MT－1基因启 动子来驱动猪的生长激素结构基因表达.
1、分离了2.5kb的一个猪生长激素基因片段，除去了它的5ˊ端和3ˊ端调 控序列，只保留它的4个外显子和3个内含子。 2、将这个2.5kb的猪生长激素基因融合到长度为1.1kb羊MT－1基因启动 子的下游,构建成oMT／pGH融合基因，是目的基因的基本表达结构。 3、为了基因的整合效率，还在融合基因的下游3’增加了一段猪的微卫星 DNA序列； 4、而在它的5ˊ端，又装上鸡溶菌酶基因的MAR序列，目的是为了克服 或者更准确地说是减少基因表达时受邻近基因的干扰，便于从体外调 控基因的表达。
的布局。
29
4、在制订“863”计划生物技术领域“七五”计划 时，很自然的把利用转基因技术生产生长速度快、 饲料报酬高的基因工程猪作为动物生物技术的首 要课题。 5、课题的目标是通过10-15年的研究，利用在猪体 内表达外源性猪的生长激素基因，生产出增重速 度提高20％，饲料消耗节约15％，并能保持我国 猪肉特有品质的基因工程猪品种。
30
二、目的基因的分离和表达载体的构建 在我国设立转基因猪的研究课题之前，已有
美国、英国和澳大利亚等三个国家设立了同样的
课题。美国利用现成的人生长激素基因作为目的 基因，英国利用牛的生长激素基因，澳大利亚则 构建了含有猪生长激素基因cDNA片段和染色体 组基因片段的混合结构（mini-gene）。
36
37
我国是首先使用猪的染色体组基因生产转基因猪 的，实践证明，这种结构是有很多优点的。 第一、是没有异种蛋白质表达，生产出的猪仍 然是纯天然的； 第二、基因表达适度和可控性强，表现在生产 出生长速度比对照快70％的转基因猪，而健康状 况同正常猪没有差别； 第三、猪的死亡率低，生产转基因猪的效率比 同类实验约高出一倍。
1、必须能够通过超排处理，一次获得较多胚胎，因为在冲 卵过程中和显微注射时都会损失一部分胚胎，如果超排处 理两头供体才能够移植一头受体，就不可能实行自体移植。 2、显微注射技术必须很熟练，能在很短时间内完成注射并 且胚胎注射后的死亡率要很低，否则猪要长时间等在手术 台上，对其健康和转基因后胚胎的成活都不利。
• 当前我国生猪生产主要集中在四川盆地、黄淮流 域玉米、小麦主产区、东北玉米主产区和长江中 下游水稻主产区等四大地区。 • 从畜牧经济学角度出发，养猪业为耗粮型畜牧业， 需要消耗大量的玉米等粮食作物，为降低成本， 将粮食就地转化为畜产品，以提高农作物附加值， 养猪主产区主要分布在粮食主产区应为比较合理
4、细胞制备完毕，按常规方法制成外周血淋巴细胞的染色体标本。 5、用地高辛 （Dig－11－dUTP）通过缺口翻译的方法标记探针。 6、将标记好的探针去杂交固定在玻片上的猪染色体，分子杂交之后， 在PBS中洗涤玻片，并在除去多余的PBS之后，立即滴上胶体金标 记反应液（10μl胶体金标记的抗Dig抗体，加290μl含1mg/ml BSA 的PBS），室温下反应30分钟，用净水多次洗涤，除去氯离子。 7、在每张玻片上滴100μl银增加剂，在室温中避光放置30分钟，洗去 反应剂。 8、标记完毕的染色体标本经Giemsa和Hoechst33258染色显带，玻片 自然干燥后就可以在显微镜下观察结果。 在显微镜下挑选中期相染色体清楚的细胞数十个到数百个， 计算有银粒附着的频率，将银粒附着频率最高的染色体位点，定 为外源基因整合的位点。
23
眼肌面积测量
最后肋骨处 背最长肌 横断面面积， 用硫酸纸描绘 眼肌面积 （2次）
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眼肌面积测量2
• 用硫酸纸描绘眼肌面 积（ 2 次），用求积仪 或方格计算纸求出眼 肌面积（cm2） • 或用下列公式：眼肌 面积（ cm2 ） = 眼肌高 度（ cm ）×眼肌宽度 （cm）×0.7 眼肌高度
• 脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(A-FABP)基因, Ch4, IMF
• 猪肌肉生长抑制素(MYOG), Ch9, 瘦肉率
32
兰尼定受体(RYR1)/氟烷基因(Hal)
1843C>T突变位点是造成猪应激综合症的主效基因位点。
Hha Ⅰ酶切
对于Hal基因，淘汰nn、Nn个体，留用NN个体。
33
雌激素受体基因(ESR)
38
三、转基因技术体系的建立
（一）母猪的超数排卵 直到目前为止，全世界生产转基因猪的主要 方法仍然是直接向单细胞的胚胎注射纯化的DNA 分子。在这种技术体系中，对母猪进行激素处理， 使其生产大量受精卵，是生产转基因猪的先决条 件。 要点：1、摸索出超排时激素的最佳剂量 2、多获得处于单细胞阶段的原核期的胚胎
42
在注射PMSG之后的124-129小时之间冲卵，可以 获得较高比例的单细胞胚胎(表6-2)。
• 在注射 HCG 后立刻进行自然交配或人工授精。 大群猪的超排实验证明，激素处理可以使受精卵 的获取量提高 2.1倍。
43
（二）自体移植技术在提高转基因猪生产效 率中的作用
自体移植：就是从一头猪的体内冲出单细胞胚胎之后，经 体外注射DNA处理，再把胚胎移植回同一头猪的体内。 条件：
眼肌宽度
25
肉质性能
• • • • • 水份、 蛋白质、 肌内脂肪、 大理石纹 其它指标
26
3、猪是单胃动物，饲料的主要成份是粮食和 块根、块茎。所以，猪的饲料和人的口粮是 竞争性关系，不是互补的关系。养猪太多和 猪的饲料转化效率太低，将会给种植业带来 很大负担。
27
28
养猪主产区主要分布在粮食主产区应为比较 合理的布局
44
优点：不但可以省去受体猪，而且猪的受孕率和产 仔率均显著高于异体移植（表6-3）。 原因：有可能是胚胎与母体发育同期化的程度比异 体移植的受体好，也可能胚胎和母体间的相容性 比异体好。
45
（三）外源GH基因定位和考贝数的测定
转基因猪的筛选一般是用PCR扩增特 异DNA片段或用斑点杂交作为初筛手段， 然后用southern杂交来进一步证实。
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肉产品结构
Meat structure,%
鸡肉 20%
chicken
牛羊肉 15%
Beef and mutton
猪肉 65%
pork
5
• 2、由于国土面积辽阔，各地自然条件差别 很大，加上农业生产的产业化程度较低， 猪的品种主要是历史上形成的各种地方品 种及其杂交种。这些品种的优点是耐粗饲 和肉的风味好，缺点是瘦肉率低，生产单 位体重需要的饲料较多。
51
四、转基因猪的生产
此表列出了课 题生产转基因 猪的情况，同 时在表中也列 出了美国、英 国和澳大利亚 进行同类实验 的数据，以资 比较。
52
五、外源基因的遗传稳定性
外源基因一旦整合到猪的染色体上，其遗传是稳定的。
例：一个家系的4代转基因猪中外源GH基因的追踪试 验，可以肯定地证明从G0代传到G3代时，基因仍稳 定地整合在同一条染色体上(表6-7)。这个家系的猪都 在第13号染色体上含有外源的生长激素基因。
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不同品种猪-毛色
黑色
毛色为黑白花、除头、耳、背、 腰、臀为黑色外，其余均为 白色，黑白交界处有4～5cm 的黑皮白毛的灰色带 7
毛色为中间白，两头乌 为特征。又称“两头乌”。但也 有少数猪在背部有黑斑。
体毛黑色， 四肢末端为白色
8
全白
棕红色
9
被毛黑色，在肩和 前肢有一条白带围绕
被毛灰白，夹有黑斑， 杂有部分红色。
41
什么时候冲卵可以得到较高比例的单细胞胚 胎，要靠大量实验才能找到。
• 除了促进母猪多排卵以外，多获得处于单 细胞阶段的原核期的胚胎也是至关重要的， 因为只有胚胎在单细胞阶段时，才能用于 基因转移。但是，猪是持续排卵的动物， 卵子从卵巢上排出是一个连续过程，从排 出第一个卵到排出最后一个卵，往往要持 续数小时。
31
此外一些与猪生产性能有关的基因
• 猪应激敏感基因(RYR1), Ch6, PSE肉, 应激
• 雌激素受体基因(ESR), Ch1, 产仔数
• 促卵泡素β亚基基因(FSHβ), Ch2，产仔数 • RN基因, Ch15, 酸肉, Napole产量 • 黑素皮质激素受体4(MC4R)基因, Ch1, ADG,BF,FI • 心脏脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因, Ch6, IMF
第九章
我国转基因动物研究概况
1
转基因动物前景广阔
提高动物的生长速度 改善畜产品的品质 珍稀药用蛋白的生产 （生物反应器或乳房生物反应器）
提供器官移植的供体
2
3
第一节 猪的基因工程育种
一、立项背景和研究目标 1、我国是传统的养猪大国，是世界上养猪最 多的国家。
就全国而言,生猪存栏和出栏基本保持平稳发展, 存栏和出栏呈现同步发展的趋势。2008年3月存栏 4.1亿头，6月达到4.7亿头。能繁母猪比重超过12%。
ESR基因是影响猪产仔数的主效基因
发现BB 型比AA 型猪头胎总产仔数高3.37 头
PvuⅡ酶切
34
目的基因的分离和表达载体的构建
以猪生长激素为例
克隆的猪生长激素基因全长约5.0kb，由4个外显子和3
个内含子以及5ˊ端和3ˊ端调控序列组成。
猪生长激素Genomic基因结构序列被置于羊MT基因启动 子控制之下，转基因在猪体内将受重金属离子诱导而表达。 5′MAR有屏蔽相邻基因影响的作用，而3′端增加微卫星旨在 提高整合率。
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头型
头大，额皮中部 隆起成块，俗称 “盖碗”
嘴筒长直
11
头中等大，面直
头中等大，面微凹
12
猪的耳型描述
耳大下垂
耳大下垂
13
耳小而立
耳小向前平伸，
14
耳型
耳特大，下垂
耳小竖立
15
耳型
耳小向前平伸 耳中等大，竖立
16
体型
腹大下垂，背平
腹大拖地，背凹
17
体型
腹大下垂，不拖地
腹大下垂，不拖地
18
四肢
外展
内展
X型
19
几个概念
• • • • • 活体重 胴体重 瘦肉率 眼肌 肉质性能
20
猪的宰前活重（kg)
• 宰前12小时停食称重 • 屠宰日龄按当地习惯 并注明 •
21
胴体重
• • • • • 胴体重：去除头、 蹄、尾、内脏、 包括板油、肾的 左右两半胴体 总重。
22
瘦肉率
• 用手工剥离半胴体,分 成瘦肉、脂肪、皮、 骨四部分，分别称重， 再相加，作为100%； （不计算分割过程中 的损耗，不包括板油、 肾 ）。分别计算瘦肉、 脂肪、皮、骨所占的 比例。
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一般文献中计算基因整合的考贝数，都是比较样品 DNA 与 质粒 DNA 标记物的强度，大致估计出外源基因的考贝数。 我们在研究中采用了放射性标记物计数的方法，也可以估计 基因的考贝数。 计算基因整合的考贝数： 方法： 1、提取组织中的DNA，再用同位素标记的探针去杂交，制 成一系列浓度梯度样品。 2、利用FJ-2101型双道液体闪烁计数器计算样品放射性读 数，按公式计算不同样品基因考贝数，取其平均数作为外 源基因整合的大致考贝数。
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PCR
SOUTHERN
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• 但是，对于培育转基因品种和目的基因稳 定性研究来说，只知道基因是否已经整合 是不够的，还应当知道基因在染色体上的 整合位点和整合的考贝数。
48
方法：
1、选用经过斑点杂交和southern杂交证明是转基因阳性的猪 6头，从静脉采血各5毫升，盛入放有肝素的生理盐水中摇 匀并放在4℃中静置，使红血球沉降至管子的底部。 2、取上层的血浆层0.5毫升，接种于含有青霉素、链霉素和 20％胎牛血清的RPM1/1064培养基中，使血淋巴细胞增 殖．经过在37℃下培养60小时后，加入100μg/ml 5ˊ-Brd11，继续培养12小时。 3、经过洗涤之后，将细胞重新悬浮在含有2.5μg／ml胸腺嘧 啶的新鲜培养基中，放置在37℃下再培养6小时，并于培 养结束之前30分钟加入秋水仙素0.04μg/ml。
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六、转基因猪的生产性能
1、经过对三个世代的转基因猪进行严格的饲养实验， 证明表达外源性生长激素基因的确可以提高猪的生长 速度，饲料转化效率和瘦肉率。 2、在饲料中蛋白质含量达到18％ 的条件下，转基因猪 的生长速度提高10－15％，饲料报酬和瘦肉率提高 10％ 左右。与美国Pursel等和澳大利亚Vize等得到 的结果很相似（Pursel et al 1989; Vize et al，1988 年）。
Hale Waihona Puke Baidu39
40
例：湖北白猪
应该在发情周期的第15-18天，按每公斤体重一次肌 肉注射15个单位的用孕马血清促性腺激素 PMSG，促进 卵巢上卵泡的发育。在注射PMSG第72小时，每头猪一次 注射人绒毛膜促性腺激素 HCG500单位，促进卵子的排 出，并在注射HCG后立刻进行自然交配或人工授精（表61）。
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为了能够人为地控制外源性猪生长激素基因的表达，采取了 基因融合表达的战略，用羊的重金属螯合蛋白 MT－1基因启 动子来驱动猪的生长激素结构基因表达.
1、分离了2.5kb的一个猪生长激素基因片段，除去了它的5ˊ端和3ˊ端调 控序列，只保留它的4个外显子和3个内含子。 2、将这个2.5kb的猪生长激素基因融合到长度为1.1kb羊MT－1基因启动 子的下游,构建成oMT／pGH融合基因，是目的基因的基本表达结构。 3、为了基因的整合效率，还在融合基因的下游3’增加了一段猪的微卫星 DNA序列； 4、而在它的5ˊ端，又装上鸡溶菌酶基因的MAR序列，目的是为了克服 或者更准确地说是减少基因表达时受邻近基因的干扰，便于从体外调 控基因的表达。
的布局。
29
4、在制订“863”计划生物技术领域“七五”计划 时，很自然的把利用转基因技术生产生长速度快、 饲料报酬高的基因工程猪作为动物生物技术的首 要课题。 5、课题的目标是通过10-15年的研究，利用在猪体 内表达外源性猪的生长激素基因，生产出增重速 度提高20％，饲料消耗节约15％，并能保持我国 猪肉特有品质的基因工程猪品种。
30
二、目的基因的分离和表达载体的构建 在我国设立转基因猪的研究课题之前，已有
美国、英国和澳大利亚等三个国家设立了同样的
课题。美国利用现成的人生长激素基因作为目的 基因，英国利用牛的生长激素基因，澳大利亚则 构建了含有猪生长激素基因cDNA片段和染色体 组基因片段的混合结构（mini-gene）。
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我国是首先使用猪的染色体组基因生产转基因猪 的，实践证明，这种结构是有很多优点的。 第一、是没有异种蛋白质表达，生产出的猪仍 然是纯天然的； 第二、基因表达适度和可控性强，表现在生产 出生长速度比对照快70％的转基因猪，而健康状 况同正常猪没有差别； 第三、猪的死亡率低，生产转基因猪的效率比 同类实验约高出一倍。
1、必须能够通过超排处理，一次获得较多胚胎，因为在冲 卵过程中和显微注射时都会损失一部分胚胎，如果超排处 理两头供体才能够移植一头受体，就不可能实行自体移植。 2、显微注射技术必须很熟练，能在很短时间内完成注射并 且胚胎注射后的死亡率要很低，否则猪要长时间等在手术 台上，对其健康和转基因后胚胎的成活都不利。
• 当前我国生猪生产主要集中在四川盆地、黄淮流 域玉米、小麦主产区、东北玉米主产区和长江中 下游水稻主产区等四大地区。 • 从畜牧经济学角度出发，养猪业为耗粮型畜牧业， 需要消耗大量的玉米等粮食作物，为降低成本， 将粮食就地转化为畜产品，以提高农作物附加值， 养猪主产区主要分布在粮食主产区应为比较合理