肝细胞原代培养标准操作规程
遗传学实验课：实验一肝细胞的原代分离与培养
血球计数板使用方法
• 静置片刻，待细胞沉降到计数板，不再随液 体漂流
• 如细胞位于大方格的双线上，计数时则数上 线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。
血球计数板使用方法
• 计数重复3次，取其平均值 • 使用完毕，用自来水清洗血球计数板，勿用
硬物洗刷
• 计数板计算公式
细胞数/ml=(4个大方格内的细胞数/4)×104×稀释倍数
细胞存活率计算
• 细胞存活率=活细胞数/细胞总数×100%
思考题
• 1、什么是细胞的原代培养与传代培养？ • 2、除了台酚蓝染液，还有哪些染液可用于细胞死活
的鉴定？ • 3、简述采用灌流方法分离肝细胞的技术有哪些？ • 4、血球计数板的使用方法及注意事项？并计算本实
验中的细胞数量。
操作步骤
3、用手术剪将肝脏剪成小块（约1mm3）， 再用玻片充分研磨，转移到离心管，离心 1000 rpm，5min。
注意：玻片研磨既需要充分又不能用力太大
操作步骤
4、视组织或细胞量加入5-6倍（3-5mL）胰酶， 37℃水浴中消化20分钟，每隔5分钟振荡一 次，或用吸管轻柔吹打一次，使细胞分离。
操作步骤
2、用针头将小鼠四肢固定在泡沫板上,腹部朝上。镊 子捏起腹部皮肤，剪刀剪一小口，暴露腹壁。
注意：不要一刀剪破腹壁，这样毛容易进入腹腔， 里面就不是无菌的了。 镊子夹起腹壁，剪开腹腔，取出肝脏，置于培养 皿中，剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物，转移 到另一个盛有PBS液的平皿中。
镊子捏起腹部皮肤，剪刀剪一小口，暴露腹壁。 镊子夹起腹壁，剪开腹腔，取出肝脏，
9、细胞计数前，先用台酚蓝染料染色，细胞悬液与 0.4%台酚蓝溶液以9:1混合均匀，用血球计数板计 数，计数活细胞。
细胞毒理学实验一小鼠肝细胞原代培养
6. 用手术剪将肝脏剪成小块（1mm3）,无血清培养基 冲洗三次。
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7. 将组织转移到一次性培养皿中，排列贴附于皿底。 组织块间间隔约0.5-1cm,静置数分钟。
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8. 待组织粘附后，缓缓加入含血清的培养基，切勿 将组织块冲起，做好标记，转入培养箱培养，镜 检观察。
② 实验后，请将解剖器械、离心管冲洗干净（自来水-去 离子水-三蒸水），放入烘箱烘干，超净工作台内擦拭 干净，酒精喷洒消毒，并将酒精擦干净，打开紫外灯 灭菌。
③ 各个实验小组的同学负责将垃圾带走，值日生打扫实 验室卫生。
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光源
目镜 光亮度调节
电源开关
环状光阑
物镜 粗/细准焦螺旋
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取出的剩余肝组织充分剪碎后，用剪过的蓝枪头将其转入离心 管，1000rpm离心5min，弃上清，根据组织量的多少加入 0.25%胰蛋白酶1-1.5ml。
37℃水浴消化约10-15min，每间隔5min，振荡一次，促使 细胞分离。
待组织变得疏松，略发白时，加入1ml含血清的DMEM培养 基，终止胰蛋白酶的消化作用。
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1. 总结原代培养的实验步骤以及在操作过程中需要 注意的问题。
2. 绘图表示所观察到的实验结果，并对其予以分析。
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1. 你认为原代培养中最关键的步骤是什么？为什么？ 2. 在毒理实验的检测中，原代培养细胞具有什么样
的优势？
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2. 将胎鼠或新生小鼠引颈处死，置于75%消毒酒精浸 泡2~3s，带入超净工作台。
肝脏细胞培养方案实验操作版本
肝脏细胞的分离及培养一、试验器械及用品1. 肝细胞分离器械及用品1.1 分离器械及用品1）20 mL注射器3个2）输液管2条3）普通剪刀（大）1把4）手术剪刀1把5）眼科剪刀2把6）手术结扎线1圈（不小80 cm长）7）止血钳2把8）动脉夹1个9）纱布（擦血）2条（长宽不限，每条至少可擦2次）10）纸巾（擦血）10条（卷纸，每条用三截折叠，共可擦10次）11）托盘两个12）1 mL枪及枪头1把和1盒13）大镊子1把14）温水（37°C左右）1~2 L（在实验当天开始前准备好）15）玻璃分针两支1.2 试剂：（准备量可适当加大）1）灌流液A 250 mL 1瓶2）灌流液B 250 mL 1瓶，100 mL 2瓶3）CaCl2溶液（60 g/L） 5 mL4）IV型胶原酶（20 g/L） 5 mL5）麻醉剂（犬眠宝，动物医院）2支6）肝素钠（1750 IU/mL）2支1.3 相关试剂配制（剂量可根据试验需要准备）1）无Ca2+、Mg2+ PBS溶液：称8 g NaCl、0.20g KCl、1.83 g Na2HPO4•12H2O、0.2g KH2PO4、2 g葡萄糖，溶于三蒸水中，调pH值至7.2，定容至1000mL，0.22 µm微孔滤膜过滤除菌，分装后4°C保存。
（约2L）2）灌流缓冲液A：无Ca2+、Mg2+ PBS溶液加入终浓度为5 mM的EDTA，0.22 µm微孔滤膜过滤除菌，分装后4°C保存。
(约1L)3）灌流缓冲液B：不含EDTA的无Ca2+、Mg2+ PBS溶液，分装，4°C保存。
灌流缓冲液B1：在无Ca2+、Mg2+PBS溶液中缓慢滴加无菌的60g/LCaCl2溶液，使含有0.6g/L CaCl2和0.4g/L胶原酶，分装后4°C保存。
（或者现配现用）约需300ml。
4）灌流缓冲液C：在无Ca2+、Mg2+PBS溶液中缓慢滴加无菌的60g/L CaCl2溶液，然后加入20g/L IV胶原酶，使含有0.6g/L CaCl2和0.4g/L胶原酶，分装后4°C保存。
大鼠肝星状细胞原代培养实验具体步骤及方法
大鼠肝星状细胞原代培养实验具体步骤及方法将小鼠的肝细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
步骤一、实验材料准备1. 动物：雄性SD大鼠(体重250-450 g)。
2. 试剂：戊巴比妥钠，小牛血清(或胎牛血清，则更好)，DMEM，酶消化液I、Ⅱ(以HBSS配)，18% Nycodenz(以GBSS配)，D-Hanks' 液(KCl 0.4 g/L，KH2PO4 0.06g/L，NaCl 8.0 g/L，NaHCO3 0.35 g/L，Na2HPO4·7H2O 0.06 g/L或Na2HPO4 0.053 g/L，可加酚红0.02 g/L)，HBSS，台盼兰等。
3. 器械：手术器械，200目尼龙网，相差显微镜，荧光显微镜。
二、原代培养方法1. 大鼠腹腔麻醉后在超净台上剖腹，进行门静脉插管，以D-Hanks'液灌注，同时剪开下腔静脉，冲掉血液后，改灌以100 ml酶消化液I(0.05% IV型胶原酶)。
2. 待肝脏变软后，离体肝脏并剪碎，继续以酶消化液II(含20 U/ml DNase I的0.05% IV型胶原酶)消化15 min，尼龙网过滤后以450 g 离心5 min(4℃，下同)。
3. 以HBSS重悬沉淀至10 ml，再混以20 ml Nycodenz液，分置于离心管中，并分别覆以2-3 ml HBSS，1450 g离心16 min后取界面细胞。
4. 以HBSS重悬后再次离心收集细胞，以DMEM重悬后进行细胞计数，并判断存活率和产量，最后按照常规方法接种(105细胞/cm2)，次日换液，以后每2-3天换液一次。
三、传代方法弃去培液后以D-Hanks'液洗两次，加0.125%胰酶(原代最好加0.05% EDTA)消化，镜下观察细胞突起回缩(2-5 min左右)，以完全培液(DMEM+10% NBS)终止反应(若不用EDTA，可以不需离心)，充分吹打后以1:2-1:3接种，然后继续培养(5%CO2，37℃)。
原代肝细胞培养
原代肝细胞培养原代肝细胞培养1．实验材料灌流液：NaCl、KCl、NaH2PO4.2H2O、Na2HPO4.H2O、NaHCO3、HEPES、EDTA、Glucose （国药或阿拉丁）。
消化液：Collagenase IV（Yeasen，翊圣生物，产品货号：40510ES60，100 mg ，279￥）、CaCl2。
Percoll：Percoll（GE Healthcare，17-0891-02）我买的是分装的100ml，450￥的17-0891-01-1。
麻醉剂：10%水合氯醛。
实验器材：200目细胞筛、20ml 注射器、头皮针、手术剪3把、手术镊3把（实验前灭菌），细胞培养皿2个，离心机，实验前备冰盒及水浴锅，鼠板及大头针（实验前酒精及紫外消毒）。
2. 实验前准备1) 灌流液Perfusion SolutionNaCl KCl NaH2PO4.2H2O Na2HPO4.H2O NaHCO3 HEPES EDTA Glucose离子）。
用前37℃温育。
每只老鼠消耗15ml灌流液。
2）消化液100× CaCl2：560mg CaCl2，加入10 ml PBS/ ddH2O，分装-20℃保存。
10× CollagenaseIV：100 mgCollagenaseIV粉末溶于20 mlDMEM（无血清），0.22 uM滤膜过滤除菌，每管1.5ml分装。
消化液：13.5 mlDMEM（无血清）加入150 μl100× CaCl2（终浓度5 mM），再加入1.5 ml10× CollagenaseIV（终浓度0.5 mg/ml），于37℃温育。
每只老鼠消耗15ml消化液。
3）40%Percollg/L 8.0 0.4 0.078 0.151 0.35 2.380 0.19 0.9调节pH 7.2-7.4，配好后过滤除菌。
（不能高压灭菌，其中含葡萄糖及HCO3-16.2 ml 100%percoll原液，加入1.8 ml10×PBS，再加入27ml 1×PBS，得45 ml。
心肌细胞或肝细胞原代培养的方法
心肌细胞或肝细胞原代培养的方法下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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原代肝细胞
原代肝细胞原代肝细胞分离培养与方法肝细胞的分离和培养是体外组合性生物人工肝研究的基础，但单纯机械分离法对肝细胞损伤较大，分离后的肝细胞体外培养的难度亦较大，方法复杂，成本较高体外培养肝细胞的关键是如何分离得到形态完整、体外代谢活性高的肝细胞.1 非酶分离细胞法1．1 直接分离法：麻醉或处死动物后，取出肝脏，剪成小块，通过机械方法(挤压、剪碎、震荡、吹打)得到单个细胞，多与 EDTA螯合法、灌注法相结合，即先用 EDTA溶液进行充分的灌流，再剪成组织小块，然后用各种机械的方法分离得到肝细胞。
该方法操作简单、流程短，不需要复杂仪器和昂贵的胶原酶。
但实验操作对细胞的损伤大，尤其是造成细胞表面蛋白不可逆的机械性损伤，导致细胞的获得率和存活率较低。
1．2 组织块培养法：用麻醉剂 (乙醚、戊巴比妥纳等 )将动物麻醉或直接断头处死，取出肝脏，用缓冲液充分洗涤后，剥离肝被膜，将其剪成 1 mm。
的组织小块，充分洗涤后，以 0．5 cm的间隔接种于培养器皿中(25 m L的培养瓶中可接种 3O块 )，先加入少量的培养基，静置培养 12～ 24 h后再加入足量的培养基。
该操作过程短，污染少，损伤小，细胞成活率很高而成本低。
但纯度不高，且形成典型上皮细胞层所需时间较长，在细胞爬出后还需剔除组织块，易造成二次污染。
可能是因为成年动物的结缔组织比新生动物的结缔组织致密，肝细胞难以迁出，故此法多用于 1～ 6 d的新生动物或动物胚胎。
2．离体肝脏酶消化分离法2．1 胰蛋白酶、胶原酶消化法：麻醉或处死动物后，取出肝脏，用缓冲液充分洗涤后，剥离肝被膜，将其剪成 1 mm。
的组织小块，充分洗涤后，在 37℃下用胰酶或 (和)胶原酶消化，待消化物成蓬松的絮状物后加入培养基终止消化，吹打均匀后经 200目不锈钢网筛过滤后，离心、重悬即可获得肝细胞。
胶原酶只消化细胞间质而对肝细胞机械性损伤较小，也能较完整地保存膜蛋白¨7]，分离效果好。
鸭胚原代肝细胞分离培养方法
鸭胚原代肝细胞分离培养方法鸭胚原代肝细胞是一种重要的细胞模型，常被用于研究肝细胞的生理和病理过程。
本文将介绍一种鸭胚原代肝细胞分离培养的方法，帮助科研人员顺利地获得高质量的细胞。
材料与试剂：1. 鸭胚（15-18天的胚龄）2. 70%乙醇3. 磁力搅拌器4. 50ml离心管5. 无菌PBS缓冲液6. 透明良液（胎牛血清/培养基=1：1）7. 原代培养基8. 胶原酶Ⅰ9. 钙镁自由Hanks平衡盐液10. 1%胰酶溶液11. 无菌生理盐水12. 0.1%胚胎牛血清白蛋白（BSA）步骤：1. 将鸭胚从孵化器中取出，用70%乙醇对表面进行消毒，并将其置于无菌操作室中。
2. 按照胚龄切下每个胚胎的肝脏部位，并移入50ml离心管中加入3ml Hanks平衡盐液，使用磁力搅拌器均匀悬浮。
3. 将悬浮液通过70μm的滤网过滤到新的离心管中，去除固定残渣和大块组织。
4. 将胆固醇缩合酶加入过滤后的细胞悬液中（20μl/ml），并与悬液搅拌混匀。
将其放在冰箱内，4°C下培养30-45min。
5. 把上清液移入50ml离心管中，加入同等体积的透明良液，轻轻混匀后配制成原代培养基。
6. 将经过以上处理的细胞悬液在无菌工作台中进行培养，加入10%FBS（final 8-10%）的原代培养基中，放回温度为37℃且5%CO2的细胞培养箱内培养。
7. 初始培养后24小时加入1%胰酶溶液（final 0.1%）静置20min，观测细胞体积萎缩并向外浮起，加入0.1%BSA（final 0.01%）使细胞暴露在酶液中加速酶解。
8. 用细胞崩解剂去除细胞表面上的胶原质，如可用0.25%胶原酶Ⅰ。
一般情况下，胶原酶活性需先用实验将胶原质提前转化，胶原质酶解比例可依所得细胞的特点和生长状态相应进行调整。
9. 加入0.5倍的原代培养基，抽取细胞液用离心机离心5min、1500rpm去掉明显的细胞碎块。
10. 用原代培养基重新悬浮细胞并从融合之前的根基上重新培养。
原代肝细胞培养方法
原代肝细胞培养方法原代肝细胞培养是一种重要的技术手段，它可以使我们更好地理解肝细胞的生物学特性和功能，同时也被广泛应用于药物筛选、毒性研究和肝脏疾病模型的建立。
本文将探讨原代肝细胞培养的方法。
原代肝细胞是从动物（如小鼠、大鼠、猪等）或人体新鲜肝组织中分离得到的肝细胞。
它们具有种独立性和细胞特异性功能，是进行体外研究的理想模型细胞。
原代肝细胞培养的主要步骤包括：肝组织的分离、肝细胞的分离和纯化、肝细胞的培养和维持。
首先，肝组织的分离是原代肝细胞培养的起始步骤。
一般来说，选择健康的动物或人体捐赠的新鲜肝组织，快速解剖分离，并将其置于含有冷蘸过消毒的生理盐水或缓冲液的离心管中。
然后，用小剪刀对肝组织进行切细，使其暴露于细胞分离液或酶溶液中。
常用的细胞分离液包括肝素-胰酶、胰酶、胶原酶、凝集酶及胰蛋白酶。
这些酶能够降解结缔组织，使肝细胞从肝组织中游离出来。
接下来，肝细胞的分离和纯化是确保原代肝细胞培养成功的关键一步。
一般而言，将细胞分离液转移至新离心管，并用对应的培养基对其停滞，使浮游的肝细胞顺应性地附着在组织培养器皿的底部。
在培养基的作用下，非肝细胞（如纤维细胞和非肝上皮细胞）会悬浮离开，而肝细胞则紧密附着在培养器皿上。
此时，我们可以通过控制等粘附时间、细胞数目、培养基的组分和浓度，使纯化程度达到最佳。
然后，肝细胞的培养和维持是原代肝细胞培养的持续关键步骤。
首先，选择合适的培养基是非常重要的。
常用的培养基包括DMEM、威利精简培养基和L-15培养基等。
这些培养基中会添加适量的营养物质（如葡萄糖、氨基酸和维生素）和生长因子（如胰岛素、胆固醇和转铁蛋白）。
其次，细胞密度的控制也非常重要。
通常，当细胞趋于稳定时，可以通过减少培养皿内细胞的数量来避免细胞互相竞争和过度分泌胺碱酸等蛋白质。
此外，保持培养环境的稳定也是原代肝细胞培养的重要环节。
温度、湿度、CO₂浓度和培养基的更新等因素都会对肝细胞的生长和功能有一定的影响。
原代肝细胞培养
试验动物:８～９周龄健康雌性小鼠１０只。
供试小鼠自由饮食，二级饲养，试验前２４ｈ禁食。
主要试剂:1.Solution C:480Mm KCL120Mm MgSO4120Mm KH2PO42.Buffer A(1L):NaCL 7gNaHCO3 2g1M HEPES Ph7.45 5mlSolution c 10mlGlucose 1gAdd ddw and adjust pH to 7.43.灌洗液A:Buffer A with 1Mm EGTA +PS 过滤，37度温浴待用4.灌洗液B（50ml）：Buffer A with 5Mm CaCL2, 25mg胶原酶IV + PS 过滤，37度温浴待用5.胶原酶Ⅳ，购自Ｓｉｇｍａ公司；6.ＲＰＭＩ－１６４０细胞培养液7.透析胎牛血清（ＦＢＳ）8.青霉素－链霉素双抗9.0.4%的Trypan Blue：0.4g Trypan Blue to 100ml ddw用NaOH调PH值7.2-7.3, 4度储存。
步骤:1.经腹部注射巴比妥钠（50-100ｍｇ／ｋｇ）麻醉供试小鼠，5-10min。
70％乙醇消毒皮肤后，将小鼠移至超净工作台，固定于消毒的聚乙烯泡沫板上.2.剪开小鼠腹部，剥离皮肤，将静脉留置针插入肝脏门静脉，剪开下腔静脉，灌注预热（37 ℃）的灌注液A，保持灌注液流速为10～15ｍＬ／ｍｉｎ3.至小鼠肝脏完全变灰黄、下腔静脉已无血丝流出时，改用３７～３８℃预热的灌注液B继续灌注小鼠肝脏，同时在下腔静脉插入留置针，通过医用输液管收集消化酶液，循环灌注液B，保持灌注液流速为10～15ｍＬ／ｍｉｎ，持续灌注10～15min，使肝脏完全充盈消化酶液；4.剪下整个肝脏组织，将肝脏置于60mm培养皿中用10％ＦＢＳ的ＲＰＭＩ－１６４０细胞培养液终止消化，撕去肝包膜，用移液管轻轻吹吸两次，经100目网过滤到50ml离心管中，去除未消化肝脏组织块，补至30ml，于室温下1500转/分钟（50-80g）离心5ｍｉｎ重复2-3次，收集纯化的小鼠肝细胞，将纯化的小鼠肝脏细胞重悬于10ｍＬＲＰＭＩ－１６４０培养液中。
动物细胞原代培养流程
动物细胞原代培养流程
1. 取材。
- 从健康动物体内取出所需组织，如肝脏、肾脏等，尽量选择新鲜、无菌的组织材料。
- 取材过程要迅速，减少组织暴露在外界环境中的时间，以降低污染风险。
2. 组织处理。
- 将取出的组织块用平衡盐溶液（如PBS）清洗，去除表面的血液、杂质等。
- 把组织剪成小块，一般为1 - 3mm³大小，便于后续消化。
3. 消化。
- 加入适量的消化酶（如胰蛋白酶或胶原酶），在适宜的温度（通常为37°C）和时间（根据组织类型和酶的活性而定）下进行消化。
- 消化过程中可轻轻摇晃容器，使消化酶与组织充分接触。
4. 终止消化。
- 当组织块变得松散，大部分细胞游离出来时，加入含血清的培养液终止消化。
血清中的某些成分可以抑制消化酶的活性。
5. 过滤。
- 将消化后的细胞悬液通过滤网（如200目滤网）过滤，去除未消化完全的组织块。
6. 离心。
- 将过滤后的细胞悬液进行离心，转速一般为1000 - 1500r/min，离心时间5 - 10分钟。
- 离心后弃去上清液，得到细胞沉淀。
7. 细胞计数与活力检测。
- 用适量的培养液重悬细胞沉淀，然后进行细胞计数（可使用血球计数板等工具）。
- 同时检测细胞活力（如台盼蓝染色法，活细胞不着色，死细胞被染成蓝色）。
8. 接种培养。
- 根据细胞计数结果，将适量的细胞接种到培养容器（如培养瓶、培养皿）中。
- 加入适量的培养液，放入培养箱中，在适宜的温度（37°C）、湿度（95%左右）和二氧化碳浓度（5%）下进行培养。
肝细胞的原代培养
肝细胞的原代培养1．准备工作及肝细胞的分离（1）对所要用的工具和器械进行高温高压消毒，对所要的培养液，平衡盐溶液，蛋白酶消化液用微孔滤膜过滤除菌（手术剪，镊子，止血钳，空针，解剖针，不锈钢呢绒晒网，培养皿，小烧杯，吸管，离心管，三角瓶，棉球，血细胞技术板）（2）工作台面取材前30分钟紫外线消毒，酒精棉球擦洗（3）操作者洗手着装（新洁尔灭浸泡前臂1min）（4）试验动物消毒（70％或75％乙醇浸泡）（5）切取动物组织，洗取血污，剔去多余部分，将所取组织放入不含Ca2＋的HEPES缓冲液（培养液）的培养皿中（6）将所取组织切碎，将组织块连同组织液用吸管吸至离心管中静置片刻待组织块下沉后吸去上清液（7）将组织块转移至一加入含0。
05％胶原酶－2和5mMCacl2的HEPES的小烧杯或小培养瓶中37C恒温床消化15－45min（也可加磁力棒）（8）用吸管吸去含酶溶液加入不含Ca2＋的HEPES 缓冲液并用吸管吹打使组织块刚好散开（9）用不锈钢筛网过滤，若未过滤组织块较多重复（7）（10）对过滤液离心，转速80－1000r /min 时间5－10min（50×g？）（11）弃上清液，将细胞沉淀用少量培养液重新悬浮（12）重复（10）（11）3次（13）用血细胞计数板计数密度（14）用培养液调节细胞悬液密度至期望密度（每75ml烧瓶8×106个细胞）准备接种2．培养(1) 培养基：75％Eagle MEM＋25％medium 199＋10nginsulin/m+0.2%bovin serum albumin+10%fetal calf serum(2) 将分离的肝细胞种在10ml培养基里(3) 过12小时换液(4) 以后每天换液且加入7×10-5 hydrocortisone hemisaccinate（去小牛血清加入1.5%的二甲基亚砜）。
肝脏细胞培养方案实验操作版本
肝脏细胞的分离及培养一、试验器械及用品1. 肝细胞分离器械及用品1.1 分离器械及用品1）20 mL注射器3个2）输液管2条3）普通剪刀（大）1把4）手术剪刀1把5）眼科剪刀2把6）手术结扎线1圈（不小80 cm长）7）止血钳2把8）动脉夹1个9）纱布（擦血）2条（长宽不限，每条至少可擦2次）10）纸巾（擦血）10条（卷纸，每条用三截折叠，共可擦10次）11）托盘两个12）1 mL枪及枪头1把和1盒13）大镊子1把14）温水（37°C左右）1~2 L（在实验当天开始前准备好）15）玻璃分针两支1.2 试剂：（准备量可适当加大）1）灌流液A 250 mL 1瓶2）灌流液B 250 mL 1瓶，100 mL 2瓶3）CaCl2溶液（60 g/L） 5 mL4）IV型胶原酶（20 g/L） 5 mL5）麻醉剂（犬眠宝，动物医院）2支6）肝素钠（1750 IU/mL）2支1.3 相关试剂配制（剂量可根据试验需要准备）1）无Ca2+、Mg2+ PBS溶液：称8 g NaCl、0.20g KCl、1.83 g Na2HPO4•12H2O、0.2g KH2PO4、2 g葡萄糖，溶于三蒸水中，调pH值至7.2，定容至1000mL，0.22 µm微孔滤膜过滤除菌，分装后4°C保存。
（约2L）2）灌流缓冲液A：无Ca2+、Mg2+ PBS溶液加入终浓度为5 mM的EDTA，0.22 µm微孔滤膜过滤除菌，分装后4°C保存。
(约1L)3）灌流缓冲液B：不含EDTA的无Ca2+、Mg2+ PBS溶液，分装，4°C保存。
灌流缓冲液B1：在无Ca2+、Mg2+PBS溶液中缓慢滴加无菌的60g/LCaCl2溶液，使含有0.6g/L CaCl2和0.4g/L胶原酶，分装后4°C保存。
（或者现配现用）约需300ml。
4）灌流缓冲液C：在无Ca2+、Mg2+PBS溶液中缓慢滴加无菌的60g/L CaCl2溶液，然后加入20g/L IV胶原酶，使含有0.6g/L CaCl2和0.4g/L胶原酶，分装后4°C保存。
小鼠肝脏细胞原代培养
1瓶
RPMI1640培养液 1瓶
废片缸
1
（四）实验步骤
1.75%酒精棉球擦拭超净台，将试验所 需试剂、耗材等置于超净台中紫外照 射30min后，关闭紫外灯打开照明，通 风15min。
2.取一只小鼠置于含乙醚的废片缸中使 其麻醉，脱臼处死，75%酒精中浸泡并 移置于超净工作台内，将小鼠放在无 菌平皿中，用手术剪和镊子撕开腹部 皮肤，再换一套手术剪和镊子剪开腹 膜暴露内脏。
3.取另一无菌平皿，倒入少许PBS置于 一旁备用 4.用镊子取出肝脏置于含有PBS的无菌 平皿内,清洗2次，除去杂物后，用手术 剪将肝脏剪成1mm³小块。
组织块法：
用镊子夹取组织块并将其转移到克氏 瓶底部，组织块之间有一定间隔（5mm 左右），等组织块粘在克氏瓶上不滑动， 将培养瓶翻转180度组织块朝上，加入 2ml含10%胎牛血清DMEM培养液，盖上 瓶盖，做好标记，37℃ 5% CO2培养箱中 静置培养4小时后待组织块完全粘在克氏 瓶上轻轻翻转克氏瓶，使组织块浸入培 养液中，隔天换一次液，观察细胞是否 贴壁。
3.吸取上层清液加入到1.5mlEP管中， 配平，800rpm，10min，离心。离心 后弃上清，沉淀用1mlPBS重悬，吹打 混匀，1000rpm离心10min，弃上清， 加入RPMI1640(10%胎牛血清)1ml重悬， 吸取20μl加入到含等体积0.4%台盼蓝 的1.5mlEP管中，混匀吸取20μl血球计 数板计数。
1.组织块法: 2.消化法:细胞数:
将细胞浓度调整到2*106个/ml， 细胞稀释 倍
细胞生长状态: 培养基颜色: 更换培养基次数:
（六）注意事项
1.工作台面上在实验前要用酒精棉擦， 用品要布局合理。 2.用过的培养瓶、离心管等需及时清洗。 3.实验结束后及时清洗用过的玻璃器材、 收拾台面、倒垃圾。
小鼠原代肝细胞培养
一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法1材料与方法1.1动物2～4周龄BALB/C小鼠，雌雄不限（湖北省防疫站动物房提供）。
1.2试剂D-hank's液；消化液Ⅰ：含1 g/L胰蛋白酶、10 g/L聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrolidone, PVP)及0.3 g/L EDTA(武汉中健公司提供)；消化液Ⅱ：含2 g/L胶原酶Ⅳ（上海华美生物工程公司提供）及10 g/L PVP；基础培养液为DMEM，另含青霉素100u/ml、链霉素100 μg/ml、50 mmol/L HEPES、30 g/L谷氨酰胺（武汉中健公司提供）；小牛血清（BS，GIBCO公司提供）；培养基内其他因子：胰岛素5 μg/ml 、转铁蛋白5 μg/ml (上海华美生物工程公司产品)、促甲状腺素释放因子10－6 mol/L（Sigma公司产品）、促肝细胞生长因子20 μg/ml、氢化可的松10－6 mol/L（广东阳江制药厂产品）。
1.3鼠肝组织块培养1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。
2）肝组织用4℃D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分；3）将肝组织切为约1mm3小块，再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清，4）加入消化液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育12 min，再用培养液洗3次以清除胰酶。
5）将消化好的肝组织块贴于25cm2培养瓶中，加少许含100 ml/L BS培养液置37℃、5% CO2条件下2～3h后再补充6 ml含100 m l/L BS培养液。
待细胞长出生长晕后改为50 ml/L BS培养液。
1.4鼠肝细胞单层培养动物和肝组织处理同上，加入消化液Ⅱ，置4℃过夜消化，去除消化液加含100 ml/L BS培养液，用滴管轻轻吹打成细胞悬液，经200目尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，4 ℃50 g离心4 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>80%,按5×105/ml密度接种，于37℃、5% CO2条件下培养，待细胞贴壁生长后改为50ml/L BS培养液。
牛肝细胞原代培养
牛肝细胞原代培养1材料1.1牛肝脏来源用于获得原代细胞的牛肝脏来自南京市郊某小牛血清制备厂，小牛年龄1–2d。
1.2 主要试剂II型胶原酶( collagenase II)和DMEM/F12培养基为Invitrogen公司产品，小牛血清为明海生物工程有限公司产品，HEPES sodium salt、两性霉素B、L-谷氨酰胺、EGTA、牛血清白蛋白(BSA)为Amresco公司产品，转铁蛋白、牛胰岛素、台盼蓝为Sigma公司产品，地塞米松为Promega公司产品，6孔细胞培养板为costar公司产品。
1.3 采肝脏、灌注消化及分离肝细胞所用的器械大号手术剪刀3把，小手术剪刀2把，止血钳4把，长镊子4把，手术刀柄2个，刀片2片，小镊子4个，乳胶手套4付，100 mL玻璃注射器2个，导液管3条，铝饭盒3个，500 mL、100 mL烧杯各2个，瓶皿2个，200目不锈钢网筛1个，50 mL塑料离心管2个，细胞计数板3个。
1.4 主要仪器普通光学显微镜，细胞培养箱，倒置显微镜，超净工作台，冰箱，电热恒温水浴锅，低速离心机，电子天平。
2 方法2.1 实验方案新生小牛采血结束→无菌采取一部分肝后叶→4 ℃冲洗液冲洗掉血液并保存于4 ℃运送回实验室→37 ℃冲洗液冲洗让肝脏升温→37 ℃水浴锅里灌注消化肝脏→撕开肝被膜分散肝细胞→过滤沉淀离心→获得纯化的肝细胞→细胞计数和计算即时存活率→稀释细胞接种于牛尾胶原包被的细胞板→置37 ℃、5% CO2加湿环境中培养→观察记录细胞生长情况。
2.2 工作溶液的配制2.2.1 冲洗液A分别称取8.588 g HEPES sodium salt、7.468 g NaCl、0.234 g KCl、0.228 g EGTA、0.250 g Na2HPO4·12H2O，用1.0 mol/L HCl 调pH至7.6，用去离子水定容至1000 mL，0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌，4 ℃贮存。
肝细胞原代培养实验方案
原代培养肝细胞是肝细胞移植、生物人工肝的最佳生物材料。
长期以来, 国内外众多学者对肝细胞分离方法、培养条件进行了大量的研究 , 但要获得高活率、功能好的肝细胞,至今仍非易事。
早期主要用非酶法分离肝细胞 ,包括机械法( 如匀浆法) 及螯合法。
机械法对肝细胞损伤大, 细胞活率低; 螯合法是用可结合 Ca2+ 、M g2 +的螯合剂(如枸橼酸盐或 EDTA) 分离肝细胞,但螯合剂单独使用效果不好 ,常需与酶法结合使用。
后期逐渐改为酶消化法分离肝细胞 ,包括胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法。
后者对酶浓度及作用时间要求十分严格, 且由于胰蛋白酶是一种强蛋白质消化酶, 对肝细胞膜破坏严重 , 因而易造成肝细胞死亡 , 导致分离失败。
胶原酶消化法对肝细胞损伤较小 , 虽然肝细胞膜在消化过程中也会受到损害, 但经培养后可完全修复。
胶原酶在消化肝的同时解除了细胞间接触抑制或活化了潜在的蛋白激酶、生长因子或受体, 使肝细胞能逐渐适应消化分离过程中所发生的细胞内、外环境及细胞间的各种改变。
这些改变对离体肝细胞修复、生长及其功能有重要的促进作用 ,有利于肝细胞的培养。
这种适应性改变恰恰是机械分离法所没有的。
因此 ,要获取理想的肝细胞,酶消化这一重要环节不可缺少。
Seglen 二步灌注法为经典的胶原酶消化法,但所需设备较复杂 ,胶原酶消耗量大。
本研究在其基础上略加改进。
作者认为 ,采用胶原酶消化法 ,胶原酶的用量、作用时间及作用条件是分离成功与否的关键。
胶原酶的浓度过高 ,作用时间难以控制 ; 浓度过低 ,则作用时间过长、细胞活率降低。
事先用无Ca2 +、M g2+的灌注液进行预灌注, 去除 Ca2+依赖性粘附因子 ,使桥粒断裂; 然后用含 Ca2+的胶原酶消化 ,胶原酶的作用需要 Ca2+的活化 , 在 5 mmol/LCa2 +浓度下 ,用浓度为 500 mg/ L 的胶原酶 37 ℃条件下消化 15 min 最佳。
在进行肝细胞洗涤、离心、重悬等纯化操作时 ,温度需保持在 0 ～4 ℃。
小鼠肝细胞原代培养、灌注
小鼠肝细胞原代培养+灌注我把我整理和收集战友的一些资料供你分享：材料：小鼠器具：饭盒、纱布、小剪子、小镊子、大镊子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管（15/50ml）、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器试剂：DMEM（含血清）、无血清DMEM培养基、胰酶、PBS准备：酒精擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。
操作步骤：1、将小鼠断颈致死，置75%酒精泡2-3秒钟，取肝脏，置于盛有PBS的平皿中。
2、剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物,转移到另一个盛有PBS液的平皿中。
3、用手术剪将脏器剪成小块（1mm2），玻片研磨，转到离心管，离心1000rpm，5min。
4、视组织或细胞量加入5-6倍（3-5ml）胰酶，37℃中消化20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
5、加入3-5ml含血清的培养液以终止胰酶消化作用。
6、用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。
7、1000rpm，离心5分钟，弃上清液。
8、加入无血清培养液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
9、加入含血清的培养液l-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。
10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至6孔培养板中，37℃下培养。
肝细胞生长不良涉及到细胞的取材、分离、纯化、培养条件，现分别介绍如下，首先介绍原代肝细胞的分离。
目前肝细胞的分离主要采用经典的改良的Salgon经门静脉插管两步灌流法分离肝细胞。
具体操作步骤如下：1: 供体肝脏的游离：选择Mercedes手术切口，即人字型切口，进入腹腔，暴露肝脏，分离肝脏镰状韧带、左、右三角韧带（为了便于手术，可以用生理盐水纱布将肝脏轻柔的向下牵引，并向两侧移动，显露膈下空间），解剖肝十二指肠韧带，确认胆总管，应尽可能靠近远心端结扎（从十二指肠后面进行）。
分离肝动脉，确认胃十二指肠动脉，并将其仔细结扎，但切勿影响肝动脉腔。
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细胞培养室肝细胞原代培养标准操作规程
实验试剂
培养基：William’s E Medium(GiBCO 12551-032), 谷氨酰胺(GiBco 21051-024-100g)292mg/L，双抗（GiBco 15140-122 penicillin +10,000Units/mL, streptomycin +10,000μg /mL）5mL/500mL, 胰岛素(GiBCO 12585-014 4 mg/mL)8μg/mL, 地塞米松（中国药品生物制品检定所）5mg/L。
D-Hanks’液（CaCl2 0.55g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, Na2HPO4•7H2O 0.06g/L, NaHCO3 0.35g/L, 三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2-7.4, 4℃保存）
0.05%胶原酶Ⅳ溶液(（Sigma C5138-1G） D-Hanks’液溶解, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌, -20℃
保存）)
PBS预灌流溶液（NaCl 8.0g/L, KCl 0.2g/L, KH2PO40.2g/L, Na2HPO4•7H2O 1.56g/L, EDTA 0.1mM, 三蒸水溶解, NaHCO3调pH 7.2-7.4, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存）
鼠尾胶原（GiBCO A10483-01 20mL/ 瓶）（0.05 mg/ mL）用0.02M 的醋酸稀释,临用现配）
0.02M 的醋酸：115μL的醋酸(大于99%)用水稀释至100mL
0.05 mg/ mL-200μL鼠尾胶原（5 mg/ mL）用0.02M的醋酸稀释至20 mL
Overlay(0.25 mg/ mL的Matrigel（BD 356237）(用William’s E Medium稀释，视具体批号而定稀释倍数，临用现配）
Hanks’液（CaCl2 0.14g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, MgCl2•6H2O 0.10g/L, MgSO4.7H2O 0.10g/L, Na2HPO4•7H2O 0.09g/L, NaHCO3 0.35g/L, D-葡萄糖 1.0 g/L，三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2附近，4℃保存）
实验仪器
CO2 恒温培养箱（日本SANYO 公司）；
Sigma高速离心机；
IX-51 型荧光倒置显微镜（日本尼康公司）；
DHL-A电脑恒流泵（上海青浦沪西仪器厂）；
液相-质谱联用分析系统（LC/MS/MS）由美国Thermo系列四元泵、在线脱气机、自动进样器、以及Thermo Finnigan LTQ线性离子阱质谱检测器，系统工作软件为XcaLibur（美国）；
Sigma5310离心机；
ZHWY-103B多振幅轨道式恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）。
实验方法
实验准备
在24孔板底涂布鼠尾胶原（0.05 mg/ mL）300 μL/well，置于室温下成胶1h后吸出多余胶原，细胞悬液种板前用William’ s E Medium培养基洗去表面的酸性物质。
体外灌流
分别取PBS预灌流溶液和0.05%Ⅳ型胶原酶液在水浴中预温敷至37℃。
恒流蠕动泵接三号管，以6mL/min的速度匀速灌注75%酒精，PBS预灌流溶液。
腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠(0.5mL/100g)→仰卧固定，门静脉插入导管，动脉夹固定→剪断下腔静脉腹腔段，经门静脉插管以6mL/min的速度匀速灌注预温孵的PBS预灌流溶液以去除肝内血液及钙离子→当肝脏变苍白、下腔静脉流出液体变清时开始灌注预温的胶原酶液，流速约4mL/min，约6-10min→肝脏颜色变成土黄色、包膜下呈龟背状裂隙、压之凹陷不易恢复时停止灌注→完整摘除肝脏。
超净台内分离
在超净台中揭去被膜→将细胞混悬液用200目尼龙网筛过滤，滤液50g 低速离心3min→沉淀用William’s E Medium离心一次（50g，3min）→接着同法洗涤两次→最后加入William’s E Medium 制成细胞悬液，按1.5×106个/ml的细胞密度种板，每孔400μL，密度为1×106个/cm2，四小时后换William’s E Medium，间隔24小时换William’s E Medium（含0.25mg/mL的Matrigel）500 μL/well，以后每天换一次William’s E Medium(1000μL/well)，至第三天。
细胞计数和存活率判定
吸取50μL稀释悬液转到一EP管中，加入0.4%台盼蓝染液50μL（1:1）并混匀。
在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液，在10×物镜下观察。
先计数一个大方格内的死细胞数（蓝染者）和总细胞数，再计数全部4个大方格内的细胞总数，据公式：活细胞率 = 活细胞数/1大方格细胞总数×100%和细胞密度（个/mL）= （4大方格细胞总数/4）×104×稀释倍数，计算活细胞率和细胞密度，随后计算出肝细胞总数（产量）。
肝细胞诱导实验
肝细胞换液（William’s E）至第三天，加入诱导剂（诱导剂用William’s E稀释），每天换液（诱导剂）至第六天，加药前各孔加入37℃的空白Hanks’（PH=7.1～7.3）1mL，置于37℃摇床中，10min后轻轻吸干孔内Hanks’，以期在不破坏其单层膜的基础上除去细胞表面的杂质。
将底物按设定浓度溶解于Hanks’液中，后加入各孔，（24孔板加入200μL/well， 12孔板加入400μL/well）置于37℃培养箱中，120min时迅速吸出药物，同时做空白对照（加入空白Hanks’）。
样品-20℃储存待测。
样品处理方法
取出一定量的样品，加入等体积的含Tid（10μg/m L）的ACN，混合10min沉淀蛋白，离心
（15300rpm,10min）一次，取50μL进板。