肝细胞原代培养标准操作规程

细胞培养室肝细胞原代培养标准操作规程

实验试剂

培养基：William’s E Medium(GiBCO 12551-032), 谷氨酰胺(GiBco 21051-024-100g)292mg/L，双抗（GiBco 15140-122 penicillin +10,000Units/mL, streptomycin +10,000μg /mL）5mL/500mL, 胰岛素(GiBCO 12585-014 4 mg/mL)8μg/mL, 地塞米松（中国药品生物制品检定所）5mg/L。

D-Hanks’液（CaCl2 0.55g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, Na2HPO4•7H2O 0.06g/L, NaHCO3 0.35g/L, 三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2-7.4, 4℃保存）

0.05%胶原酶Ⅳ溶液(（Sigma C5138-1G） D-Hanks’液溶解, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌, -20℃

保存）)

PBS预灌流溶液（NaCl 8.0g/L, KCl 0.2g/L, KH2PO40.2g/L, Na2HPO4•7H2O 1.56g/L, EDTA 0.1mM, 三蒸水溶解, NaHCO3调pH 7.2-7.4, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存）

鼠尾胶原（GiBCO A10483-01 20mL/ 瓶）（0.05 mg/ mL）用0.02M 的醋酸稀释,临用现配）

0.02M 的醋酸：115μL的醋酸(大于99%)用水稀释至100mL

0.05 mg/ mL-200μL鼠尾胶原（5 mg/ mL）用0.02M的醋酸稀释至20 mL

Overlay(0.25 mg/ mL的Matrigel（BD 356237）(用William’s E Medium稀释，视具体批号而定稀释倍数，临用现配）

Hanks’液（CaCl2 0.14g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, MgCl2•6H2O 0.10g/L, MgSO4.7H2O 0.10g/L, Na2HPO4•7H2O 0.09g/L, NaHCO3 0.35g/L, D-葡萄糖 1.0 g/L，三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2附近，4℃保存）

实验仪器

CO2 恒温培养箱（日本SANYO 公司）；

Sigma高速离心机；

IX-51 型荧光倒置显微镜（日本尼康公司）；

DHL-A电脑恒流泵（上海青浦沪西仪器厂）；

液相-质谱联用分析系统（LC/MS/MS）由美国Thermo系列四元泵、在线脱气机、自动进样器、以及Thermo Finnigan LTQ线性离子阱质谱检测器，系统工作软件为XcaLibur（美国）；

Sigma5310离心机；

ZHWY-103B多振幅轨道式恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）。

实验方法

实验准备

在24孔板底涂布鼠尾胶原（0.05 mg/ mL）300 μL/well，置于室温下成胶1h后吸出多余胶原，细胞悬液种板前用William’ s E Medium培养基洗去表面的酸性物质。

体外灌流

分别取PBS预灌流溶液和0.05%Ⅳ型胶原酶液在水浴中预温敷至37℃。恒流蠕动泵接三号管，以6mL/min的速度匀速灌注75%酒精，PBS预灌流溶液。

腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠(0.5mL/100g)→仰卧固定，门静脉插入导管，动脉夹固定→剪断下腔静脉腹腔段，经门静脉插管以6mL/min的速度匀速灌注预温孵的PBS预灌流溶液以去除肝内血液及钙离子→当肝脏变苍白、下腔静脉流出液体变清时开始灌注预温的胶原酶液，流速约4mL/min，约6-10min→肝脏颜色变成土黄色、包膜下呈龟背状裂隙、压之凹陷不易恢复时停止灌注→完整摘除肝脏。

超净台内分离

在超净台中揭去被膜→将细胞混悬液用200目尼龙网筛过滤，滤液50g 低速离心3min→沉淀用William’s E Medium离心一次（50g，3min）→接着同法洗涤两次→最后加入William’s E Medium 制成细胞悬液，按1.5×106个/ml的细胞密度种板，每孔400μL，密度为1×106个/cm2，四小时后换William’s E Medium，间隔24小时换William’s E Medium（含0.25mg/mL的Matrigel）500 μL/well，以后每天换一次William’s E Medium(1000μL/well)，至第三天。

细胞计数和存活率判定

吸取50μL稀释悬液转到一EP管中，加入0.4%台盼蓝染液50μL（1:1）并混匀。在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液，在10×物镜下观察。先计数一个大方格内的死细胞数（蓝染者）和总细胞数，再计数全部4个大方格内的细胞总数，据公式：活细胞率 = 活细胞数/1大方格细胞总数×100%和细胞密度（个/mL）= （4大方格细胞总数/4）×104×稀释倍数，计算活细胞率和细胞密度，随后计算出肝细胞总数（产量）。

肝细胞诱导实验

肝细胞换液（William’s E）至第三天，加入诱导剂（诱导剂用William’s E稀释），每天换液（诱导剂）至第六天，加药前各孔加入37℃的空白Hanks’（PH=7.1～7.3）1mL，置于37℃摇床中，10min后轻轻吸干孔内Hanks’，以期在不破坏其单层膜的基础上除去细胞表面的杂质。将底物按设定浓度溶解于Hanks’液中，后加入各孔，（24孔板加入200μL/well， 12孔板加入400μL/well）置于37℃培养箱中，120min时迅速吸出药物，同时做空白对照（加入空白Hanks’）。样品-20℃储存待测。

样品处理方法

取出一定量的样品，加入等体积的含Tid（10μg/m L）的ACN，混合10min沉淀蛋白，离心