分子生物学实验讲义

《生化与分子生物学》
实验讲义
天津医科大学生物医学工程系
2005年
实验一自抗凝血中提取哺乳动物细胞基因组DNA
一、实验目的
1、了解核酸的基本特性。

2、掌握DNA提取和鉴定的方法。

二、实验原理
核酸的分离与提取是分子生物学研究中很重要的基本技术，核酸样品的质量可能直接关系到后续实验的成败。

核酸包括DNA、RNA两种分子，在真核细胞中都是以与蛋白质相结合的状态存在（DNA与组蛋白形成核小体，再折叠缠绕成染色体），真核生物基因组DNA 为双链线性分子，存在于细胞核内。

基因组DNA的提取需经过DNA的释放（破膜）、DNA与蛋白质的分离，DNA的沉淀等过程。

分离纯化核酸的总原则：
1、保证核酸一级结构的（核苷酸序列）的完整性，全部的遗传信息均储存在
一级结构中。

2、排除其它分子的污染。

a)对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子。

b)生物大分子：蛋白质、多糖和脂质。

c)其它核酸分子：RNA.
三、实验试剂
1、TKM缓冲液
10 mmol/L Tris-HCl pH 7.6 （Tris 三羟甲基氨基甲烷）
10 mmol/L KCl
2 mmol/L EDTA
4 mmol/L MgCl
2
2、TE缓冲液
10 mmol/L Tris-HCl
1 mmol/L EDTA pH 8.0
3、10％SDS
4、饱和氯化钠
四、实验步骤
1、取0.5ml EDTA抗凝的全血于清洁的1.5ml Eppendorf离心管中。

2、加入0.5ml TKM缓冲液，13μl Triton X-100（终浓度为1.2％），颠倒混匀。

在台式离心机上离心，5,000rpm×10分钟。

（低渗破红细胞膜）。

3、倾去上清液，在离心管中加入1.0ml TKM缓冲液，混匀后离心，5,000rpm ×10分钟，重复步骤3两次。

（清洗）
4、于沉淀中加入200μl TKM缓冲液和15μl 10％SDS（终浓度为0.7％），混匀后于55℃保温20分钟。

（破白细胞膜）注：此步中可加入少量蛋白酶K。

5、于离心管中加入75μl 饱和（≈6mol/L）氯化钠溶液（终浓度为 1.2 mol/L），混匀。

13,000 rpm离心5分钟。

（沉淀蛋白质）
6、小心吸取上清液约240μl转移至另一洁净的1.5ml Eppendorf离心管中。

加入750μl 95％的冷乙醇（终浓度为71％），－80℃放置30min。

离心1,5000 rpm ×20分钟，最好在4℃。

（沉淀DNA）
7、小心吸去上清，加入 1.0 ml 75％的冷乙醇，洗涤沉淀，相同条件再离心一次。

（脱盐）
8、弃去上清，用Parafilm膜封口，在膜上扎孔后置37℃温箱中干燥，以去除残余的乙醇。

9、将干燥后的DNA溶于50μl TE缓冲液中，置－20℃冰箱中备用；也可将干品置－20℃冰箱中备用，使用前用30μl重蒸水溶解。

10、OD
260/OD
280
的测定。

五、注意事项
为保证核酸分离的完整性和纯度，实验过程中应注意以下事宜：
1、量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏。

2、少化学因素对核酸的降解，避免过酸、过碱对磷酸二酯键的破坏。

3、减少物理因素的核酸的降解，如机械剪切力（强力高速的震荡）、高温（破
坏化学键，常规操作温度为0－4℃，可降低核酸酶的活性，减少核酸的生物降解）。

4、防止核酸的生物降解，核酸酶消化磷酸二酯键，破坏一级结构。

其中DNA
酶，需要二价金属离子的激活（Mg2＋），使用二价金属离子鳌合剂EDTA，基本上可抑制DNA酶的活性。

实验二聚合酶链式反应及DNA的琼脂糖凝胶电泳
一、实验目的
1、掌握PCR反应的原理，学习PCR的方法，熟悉PCR扩增仪的使用。

2、了解PCR反应条件的优化及引物设计。

3、掌握琼脂糖凝胶电泳的操作方法。

二、实验原理
聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）是Karry Mullis于1985年创立的一种通过体外酶促扩增获取大量特异DNA片段的方法。

PCR技术是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应，模拟天然DNA的复制机制。

PCR的特异性取决于引物和模板的特异性结合。

PCR的全过程是以变性、退火、延伸三步反应为一周期，通过若干轮的循环完成的，其中每一步的转换是通过改变反应温度来控制。

1、变性（denaturation）
模板DNA在95℃左右的高温条件下双链间的氢键断裂，双链DNA解链成为单链DNA并游离于反应液中。

2、退火（annealing）
热变性后将温度降低，人工合成的两个寡核苷酸引物分别与模板DNA扩增区域的两端准确配对结合，形成局部杂交链。

3、延伸（extension）
在四种dNTP底物及Mg2＋存在的条件下，DNA聚合酶在最适作用温度下可将脱氧单核苷酸从引物3’端掺入，并沿着模板以新合成的DNA单链的5’→3’方向延伸合成新DNA，以上三个步骤为一循环，每一循环的产物可作为下一循环的
模板。

如图所示，理论上PCR合成的数量经过每轮循环都将增加一倍，应按2n的指数方式递增。

PCR经30轮循环后，PCR扩增量应达到230个拷贝，约109个拷贝，但由于DNA聚合酶的质量、待扩增片断的序列及反应体系的条件等诸多因素的影响，实际扩增效率比预期的要低，一般可达106～107个拷贝。

三、实验流程
1、目的基因的PCR扩增
2、PCR产物的电泳检测
四、实验试剂
1、Taq DNA聚合酶：5 U/μl。

2、dNTP：4种dNTP按等比例混合，每种2.5mmol/L。

：，与缓冲液混在一起，无需单独配置。

3、MgCl
2
4、PCR引物：稀释为一定的浓度，扩增时用量为1～2μl反应体积。

5、缓冲液：10×PCR缓冲液浓度如下，使用时按比例稀释：
250～500mmol/L KCl
100～500mmol/L Tris-Cl （pH 8.4）
0.5% Tween-20
1mg/L BSA
6、琼脂糖凝胶：根据待分离样品分子质量的大小选择不同浓度的凝胶。

7、溴化乙锭（10mg/ml）在20ml双蒸水中溶解0.2g溴化乙锭，混匀后4℃避光保存，溴化乙锭是一种诱变剂，操作时应注意安全。

8、上样Buffer： 0.25％的溴酚蓝，使用时需加入一定浓度的甘油或蔗糖聚蔗糖，以使样品沉入加样槽。

五、实验步骤
1、PCR反应体系
O 13.5μl，primer A 总体积25μl（10×buffer 2.5μl，Mg2+ 1.5μl，ddH
2
2μl，primer B 2μl），模板DNA 1μl，Taq酶1.5μl）。

2、循环参数设定
（1）95℃ 1min 62℃ 1min
72℃ 1min
72℃延伸7min
（2）反应体系终止后。

2％琼脂糖电泳（溴化乙锭染色）
a、用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子。

b、根据核酸分子质量的大小配置不同浓度的琼脂糖凝胶，一般200～
400bp的DNA片段，可配置1.2～1.7％浓度的琼脂糖用于电泳。

c、在锥形瓶中配置0.5×TAE电泳缓冲液100ml，称取一定量的琼脂糖
粉放入沸水浴中或微波炉内加热熔化。

冷却至60℃（需要时可加入溴化
乙锭），倒入电泳槽中，待凝固。

d、向电泳槽中倒入配置好的凝胶，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去
梳子。

如样品孔内有气泡，应设法除去。

e、在DNA样品中加入0.2体积的上样缓冲液，混匀后，加入样品孔内。

f、接通电源，一般红色为正极，黑色为负极，DNA样品由负极往正极泳
动（靠近加样孔的一端为负）。

电压为1～5V/cm（长度以两个正极之间
的距离计算）。

g、根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳。

一般200～400bp的PCR
产物50V电压，电泳20～40分钟即可。

h、溴化乙锭染色后，紫外灯上观察电泳带的及其位置，并与标准分子质
量核酸比较扩增产物的大小。

实验三质粒的提取
一、实验目的
1、学习质粒DNA的基本知识。

2、掌握质粒的小量快速提取法。

二、实验原理
质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1~200kb之间，具有双链闭合环状结构。

主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中。

质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，表达它携带的遗传信息。

质粒可独立游离在细胞质内，也可整合到细菌染色体中，它离开宿主细胞就不能存活，它所控制的许多生物学功能也赋予宿主细胞某些特殊的表型。

所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。

采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate, SDS）也可使细胞壁裂解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌DNA附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。

用乙醇沉淀，即可得到质粒DNA。

质粒DNA分子量一般在106~107道尔顿范围内。

在细胞内，共价闭环DNA （covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。

若两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫作开环DNA（open circular DNA, 简称ocDNA）。

在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度都快，因此在本实验中，质粒DNA在电泳凝胶中可能呈现3条区带。

三、实验仪器及试剂
1、仪器与耗材
微量移液器、微量离心管（又称Eppendorf管）、常用玻璃器皿、台式高速离心机、分光光度计、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统等。

2、材料
大肠杆菌DH5α
3、试剂
（1）pH8.0 G.E.T 缓冲液（50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-HCl）。

O）（2）pH 4.8乙酸钾溶液（60ml5mol/L KAc，11.5ml冰乙酸，28.5ml H
2（3）酚/氯仿（1∶1，V/V）：酚需在160℃重蒸，加入抗氧化剂8-羟基喹啉，使其浓度为0.1%，并用Tris-HCl缓冲液平衡两次。

氯仿中加入异戊醇，氯仿/异戊醇（24∶1，V/V）。

（4）pH 8.0 TE缓冲液：10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，其中含有RNA酶（RNase）20μg/ml。

（5）TAE缓冲液：称取Tris10.88g、醋酸5.52g和EDTA 0.72g，用蒸馏水溶解后，定容至200ml，用前稀释10倍。

四、实验步骤
1、细菌的培养、质粒DNA的扩增和收集：
（1）挑取琼脂平板上的单一菌落，接种至20ml LB液体培养液中，37℃，300转/分振摇过夜。

（2）取1ml上述菌液于1.5ml Eppendorf管中，6000转/分离心3分钟，弃上清并重复1次，共收集2ml菌液。

（3）倒掉菌液上淸，将Eppendorf管倒置于滤纸上空干，同时配置溶液Ⅱ。

2、细菌菌体的裂解和初步纯化：
（1）在上述Eppendorf管中加入冰浴后的溶液Ⅰ100μl，剧烈振荡混匀。

（2）加入室温放置的溶液Ⅱ200μl，颠倒混匀，此时溶液会变澄清，冰上放置3分钟。

（3）加入冰浴后的溶液Ⅲ150μl，颠倒混匀，此时溶液中会出现絮状沉淀。

12000转/分离心5分钟，将上淸移至另一干净1.5ml Eppendorf管中（约有400μl）。

（4）每管加等体积的“酚：氯仿”（下层有机相），剧烈震荡混匀后12000转/分离心5分钟，将上淸液移至另一干净1.5ml Eppendorf管中（约300μl）。

（5）每管加入2.5倍体积95％乙醇（600μl）室温静置30分钟后12000转/分离心5分钟。

（6）倒掉上淸后将管底倒置于高压过的滤纸上控干。

（7）加入50μl TE（含无DNA酶的RNA酶20μl/ml）溶解质粒DNA，短暂震荡5分钟后，可进行内切酶实验或－20℃存储。

3、电泳鉴定空质粒载体大小位置
1％琼脂糖电泳鉴定质粒大小位置，观察没有经过酶切的质粒是否有松弛环状质粒DNA、线性质粒DNA及超螺旋状态质粒DNA上下三条带出现。

附：DNA的琼脂糖凝胶电泳：
1、琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的基本方法。

该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。

当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶（Ethidium bromide, EB）染色，在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。

此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后的克隆操作。

琼脂糖可以制成各种形状、大小和孔隙度的凝胶。

琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。

琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。

琼脂糖主要在DNA电泳中作为一种固体支持基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。

在电场中，中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移，其迁移速率由下列多种因素决定：（1）DNA的分子大小:
线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移越慢。

（2）琼脂糖浓度
一个给定大小的线状DNA分子，其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。

DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。

凝胶浓度的选择取决于DNA 分子的大小。

琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围
（3）DNA分子的构象
分子量相同，构象不同的DNA分子在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的，超螺旋DNA移动最快，而线状双链DNA移动最慢。

如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带，难以确定是质粒DNA不同构象引起，还是因为含有其他DNA 引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。

（4）电源电压
在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。

但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。

要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。

（5）嵌入染料的存在
荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强，还会使线状DNA迁移率降低15％。

（6）离子强度影响
电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。

在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶)，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液)，则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。

对于天然的双链DNA，常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA (pH8.0)和
Tris-乙酸]，TBE(Tris-硼酸和EDTA)，TPE(Tris-磷酸和EDTA)，一般配制成浓缩母液，储于室温。

（7）制备步骤
a、琼脂糖凝胶的制备：称取0.6g琼脂糖，置于三角瓶中，加入50 ml TAE 缓冲液，经沸水浴加热全部融化后，取出摇匀，此为1.2%的琼脂糖凝胶。

b、胶板的制备：取橡皮膏（宽约1cm）将有机玻璃板的边缘封好，水平放置，将样品槽板垂直立在玻璃板表面。

将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液，小心倒入凝胶液，使胶液缓慢展开，直到在整个玻璃板表面形成均匀的胶层，室温下静置30 min，待凝固完全后，轻轻拔出样品槽模板，在胶板上即形成相互隔开的样品槽。

用滴管将样品槽内注满TBE缓冲液以防止干裂，制备好胶板后立即取下橡皮膏，将胶板放在电泳槽中使用。

c、加样：用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品小槽内。

每次加完一个样品，要用蒸馏水反复洗净微量加样器，以防止相互污染。

d、加完样品后的凝胶板，立即通电。

样品进胶前，应使电流控制在20mA，样品进胶后电压控制在60~80V，电流为40~50 mA。

当指示前沿移动至距离胶板1~2cm处，停止电泳。

e、将电泳后的胶板在EB染色液中进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的DNA条带。

实验四限制性核酸内切酶分析及DNA的回收
一、实验目的
1、了解限制型核酸内切酶的性质及酶切反应的条件。

2、掌握DNA回收的方法。

二、实验原理
1、限制性内切酶的反应条件
a、缓冲系统：多数生物技术公司的产品目录中均提供了关于何种酶适合于何种缓冲液的资料。

为了简化操作，有人提出了
“通用缓冲液”的反应体系，组成如下：
Tris-HCl 50 mmol/L pH8.0
10 mmol/L
MgCl
2
二硫苏糖醇（DDT） 1 mmol/L
牛血清白蛋白 100μg/ml
NaCl 0μg/L （低盐缓冲液）
NaCl 50μg/L （中盐缓冲液）
NaCl 100μg/L （高盐缓冲液）
b、反应体积：一般不少于20μl，过少的反应体积在加入各种组分时，容易产生误差。

商品化的限制性内切酶溶液中含有50％（V/V）的甘油作为防冻剂，酶切体系中酶的用量不宜超过总体积的1/10，因为甘油含量若超过5％，则会抑制内切酶的活性。

c、反应温度：大多数常用的反应温度为37℃，相当一部分酶在反应温度升高时不稳定。

d、反应时间：由于商品形式提供的限制性内切酶只是相对纯的制剂，并不是绝对不含其它杂酶，若反应时间过长，有可能出现杂酶活力。

因此，在使用时要避免长时间的酶解反应，一般可选择1－1.5h，最长不要超过3h。

2、影响限制性内切酶酶解反应的因素
a、DNA纯度：纯度越高，酶解效率越高。

b、DNA分子的结构和构型：环状、超螺旋DNA分子的酶切率，线性DNA
分子，甲基化修饰作用可以阻碍DNA分子的切割。

c、反应体系：缓冲体系、pH值，Mg2＋浓度、NaCl浓度。

d、温度和时间：一般为37℃，在保证酶切效率的前提下尽量避免长时间
反应。

e、酶及酶量：选用高质量制剂，不要高浓度的酶，防止杂酶活性产生。

3、限制性内切酶的应用方法
a、小量酶解反应：主要用于质粒的酶切鉴定，典型的反应是20μl体积中含0.2－1.0μg DNA。

b、大量酶解体系：主要应用于大量制备基因片断，一般反应体积在50－100μl，DNA用量在10－30μg。

三、实验仪器及试剂
（一）仪器
水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪, 照相支架, 照相机及其附件。

（二）试剂
1、5×TBE电泳缓冲液。

2、6×电泳载样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。

3、溴化乙锭（EB）溶液母液：将EB配制成10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。

四、实验步骤
（一）DNA酶切反应
1、将清洁干燥并经灭菌的Eppendorf管(最好0.5ml)编号，用移液器分别加入DNA1μg和相应的10×限制性内切酶反应缓冲液2μl，再加入重蒸水使总体积为19μl，将管内溶液混匀后加入1μl酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可用微量离心机短暂离心一下，使溶液集中在管底。

此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加，漏加。

使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。

2、混匀反应体系后，将Eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上），37℃水浴保温2-3小时，使酶切反应完全。

3、每管加入2μl 0.1mol/L EDTA（pH8.0），混匀或加热，以终止反应，置于冰箱中保存备用。

（二）琼脂糖凝胶电泳
1、加样：取10μl酶解液与2μl 6×载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。

若DNA含量偏低,则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。

每加完一个样品要更换tip头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。

2、电泳：加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。

控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上。

当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。

五、注意事项
1、酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。

2、酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下，1小时完全降解1mg 1DNA的酶量为一个单位，但是许多实验制备的DNA不像l DNA 那样易于降解，需适当增加酶的使用量。

反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。

3、市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1×）进行稀释。

另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则，酶活性将受影响。

4、观察DNA离不开紫外透射仪，可是紫外光对DNA分子有切割作用。

从胶上回收DNA时，应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm)，以减少紫外光切割DNA。

5、EB是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB 洒到桌面或地面上。

凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。

6、当EB太多，胶染色过深，DNA带看不清时，可将胶放入蒸馏水冲泡，30分钟后再观察点击排行。

【附录】
1、限制性核酸内切酶作用及分类
限制性核酸内切酶（以下简称限制性酶）是一类识别双链DNA中特定核苷酸序列的DNA水解酶，以内切方式水解DNA的磷酸二酯键，产生5′-P和3′-OH 末端。

1952年Luria等及1953年Bertani等研究噬菌体时发现了宿主控制性现象。

Arber及其同事用放射性同位素标记证明，噬菌体在新品系中的损害伴随有其DNA的降解，但宿主自已的DNA并不降解，据此他们提出了限制- 修饰酶假说。

对于一个宿主细胞，限制性酶及DNA甲基化酶是其细胞中的一对酶，它们对DNA 底物可以有相同的识别顺序，但有相反的生物功能，限制性酶的功能是在DNA分子内部拆卸水解，甲基化酶是对所识别DNA分子的修饰，经修饰后就可逃避限制性酶的识别及切割。

甲基化酶只修饰宿主自身的DNA，从而避免了限制性酶对自身DNA的破坏。

限制性酶主要分为三种类型：Ⅰ型限制酶为复合功能酶，具有限制-修饰两种功能，但在DNA链上没有固定的切割位点，一般在离识别位点1kb到几kb的地方随机切割，不产生特异性片段。

Ⅲ型酶与Ⅰ型酶基本相似，不同的是Ⅲ型酶在识别位点之外，有特异性的切割位点，但这两类酶对DNA酶切分析的意义不大，通常所说的限制性内切酶是指Ⅱ型酶，它能够识别与切割DNA链上的特定的核苷酸序列，产生特异性的DNA片段。

2、识别序列及消化产物的末端结构
限制性内切酶的识别序列，大部分具有双轴对称性结构或称迴文序列，如Eco RI的识别序列为：
G↓AATTC
CTTAA↓G
这种结构又称为双重对称结构。

G表示酶的识别序列，箭头表示酶切口。

大部分酶的识别序列长度为4-6个核苷酸。

4核苷酸序列在DNA链中出现频率高，对一随机排列的DNA分子来说，出现几率为1/4
4，因此4核苷酸识别序列的限制性酶在DNA链上切点多，产生片段的数目多，长度短。

对于5和6核苷酸识别序列的酶，出现频率分别为1/45和1/46，因此，6核苷酸的特异性序列在DNA中出现频率低，而8核苷酸识别位点在DNA 链中出现机率更低(1/48 )。

一部分限制性酶具有非典型的双轴对称性序列，其迴文识别序列被一个或几个其它核苷酸所间隔，如BglⅠ的识别序列是：
A↓GATCT
TCTAG↓A
另外有些限制性酶(约10种，如BbVⅠ等)，其识别序列不表现为迴文结构，它们降解双链DNA时，酶切点大部分不在识别序列内，而是与识别序列相距5至13个核苷酸残基不等。

限制性酶切片段的末端结构：限制性酶不但有特定的识别序列，并且任何一种酶切割DNA链时，总是水解核苷酸3’和5’-磷酸二酯键的3’位磷酸酯键，使产物的5’端带磷酸单酯基团，而3’末端则为游离羟基。

一种酶的全部水解产物具有相同末端的结构。

根据酶解产物的结构特点，产物的末端可分为粘性末端和平末端两类。

粘性末端指酶切后DNA片段末端带有1-4个核苷酸残基的单链结构，且片段两端突出的单链具有互补性。

突出的单链因部位的不同，又可分为5’-与3’-粘性末端两种，突出的单链带5’磷酸单酯的称5’-粘性末端；突出的单链含3’-羟基则称3’-粘性末端。

平末端指酶切后，片段为齐头末端结构。

在DNA体外重组时，粘性末端是DNA连接酶的高效底物，有很高的连接效率。

限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。

用已知分子量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以粗略推测分子形状相同的未知DNA的分子量。

实验五大肠杆菌感受态的制备及质粒的转化
一、实验目的
1、了解细胞转化的过程及其在分子生物学研究中的意义；
2、学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受体菌感受
细胞并筛选转化体的方法。

二、实验原理
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ，Mˉ)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳
，RbCl（KCl）定地遗传给后代。

受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl
2
等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（competence cell）。

进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状（如抗生素的抗性）。

将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞）。

目前常用的感受态细胞制和RbCl（KCl）法，RbCl（KCl）法制备的感受态细胞转化效率较
备方法有CaCl
2
法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出高，但CaCl
2
的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年)，法为使用更广泛。

因此CaCl
2
本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞，并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pUC18质粒共保温，实现转化。

由于pUC18质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp抗性来筛选转化子。

转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。

三、实验仪器及试剂
（一）仪器和材料
恒温摇床、电热恒温培养箱、超净台、电热恒温水浴、分光光度计、台式离心机、离心管、移液器、Eppendorf管、E.coli DH5、pUC18质粒DNA等。

（二）实验试剂。