第六章 基因表达调控

• λ噬菌体进入溶原周期 • CⅠ蛋白与操纵子的亲和力顺序： OR3<OR2<OR1， OL3<OL2<OL1；Cro蛋白与操纵子的亲和力顺序： OR3>OR2>OR1， OL3>OL2>OL1； • 当CⅠ蛋白表达以后，迅速占据OR1与OL1位点，由 于这两个操纵子被占据后，RNApol无法起使转录， PL与PR转录被迫终止； • PR不能转录， CⅡ就不能合成，那么CⅠ的合成也 将被关闭；这时，结合上OL1的CⅠ会促进PM的转录 ，当CⅠ过量时， CⅠ便会结合到OL3，而与后者的 结合则会影响PM的转录，因此CⅠ始终维持平衡； • CⅡ除了促进CⅠ蛋白的表达，还促进PI启动子的转 录，转录翻译出来的整合酶，促进λ噬菌体整和进宿 主的染色体ＤＮＡ，完成溶原过程。
葡萄糖与乳糖共存时怎么办？
• • • • • • 与乳糖操纵子一样，受到CAP-cAMP调控 那么： 1）有葡萄糖无半乳糖，转录关闭； 2）有葡萄糖有半乳糖，转录关闭； 3）无葡萄糖有半乳糖，转录打开； 4）无葡萄糖无乳糖，不用说。
有一个新的问题
半乳糖有两个作用 • 1）可以作为碳源供细胞生长 • 2）尿苷二磷酸半乳糖（UDPgal）是大肠杆菌细胞壁 合成的前体。 分析： UDPgal在细胞中必须存在；那体系中没有乳 糖怎么办？ UDPgal可用UDPglu异构而来；执行异构 反应的酶是GalE，后者是半乳糖操纵子的结构基因。 问题： GalE只有在葡萄糖不存在而半乳糖存在的 情况下才表达，可是细胞不管你有没有半乳糖，我 都需要GalE存在（因为需要UDPgal ）。矛盾？
6.
转录水平上的调控是最为经济, 灵活，又是 最为重要，复杂的调控
7. 遗传信息表达的方式
• • 组成型表达（constitutive expression）， Housekeeping gene 诱导型表达 （inducible expression）， Luxury gene
8. 顺、反因子间互作方式的基因表达调控
Chapter 6
原核生物基因表达的调控
本章内容
• • • • • • • • 概述 操纵子 乳糖操纵子 半乳糖操纵子 色氨酸操纵子 噬菌体基因表达的调控 信号转导系统 真核基因的表达调控
6.1 概述
1. 基因调控存在的生物学意义
• • • • 原核生物对环境的适应，相关的应答; 真核生物的细胞分化, 组织特化 , 个体发育. RNA转录的开/关，数量，选择性加工 蛋白质翻译速率，数量，加工与 降解和分泌…
• 半乳糖的代谢步骤：
• • • • Gal+ATP Gal-P+ADP (Galk) Gal-P+UDPGlu UDPGal+Glu-p (GalT) UDPGal UDPGlu (GalE) 总反应式： Gal+ATP ＝ADP＋Glu-p
GalR阻遏机理
无半乳糖： GalR接合两个调控区域，环化， RNApol无法正确启动； 有半乳糖：半乳糖结合GalR使其失去阻遏作用。
2. 基因表达的调控涉及 3. 原核生物与真核生物基因表达调控机制具有 惊人的相似性，共同的起源与共同的分子基 础
4.
• • •
调控机理
核酸分子间的互作 核酸与蛋白质分子间的互作 蛋白质分子间的互作
5.
• • • •
调控层次
transcriptional level post—transcriptional level translational level post—translational level
6.3.4 CAP-cAMP复合物在乳糖操纵子表达 中的作用----乳糖操纵子的正调控
葡萄糖耗尽
ATP
腺苷环化酶 促进RNApol 与启动子结合 ，起始转录
cAMP
cAMP+CAP
与CAP接受位点结合
CAP-cAMP正调空转录的机制
• 大多数原核启动子的-10区序列为TATAAT； • 而乳糖操纵子的-10区碱基序列为TATGTT，由于存在 G:C碱基对，使得RNA聚合酶无法解开双链进行转录 起始； • CAP-cAMP复合物的结合，使得CAP附近的G:C稳定 性降低，使得RNA聚合酶能顺利解开DNA双链，起始 转录； • 如果把-10区的碱基序列从TATGTT突变成TATAAT， 细胞将能同时利用葡萄糖和乳糖。
阻遏物
OFF
ON
6.3.2 诱导底物
别乳糖（诱导物）
β-半乳糖苷酶（LacZ）来源？
本底组成型表达
• 阻遏蛋白对lacO的结合并不是经久不变的，它有１０ －２０分钟的半衰期； • lacO处于游离状态的时间很短，新的阻遏蛋白会立即 结合上去； • 但有时ＲＮＡ聚合酶会抓住机会，进行一次转录，保 证每个细胞周期有一个lac mRNA分子，产生几个β-半 乳糖苷酶来巡逻执勤。
CAP结合位点
•CAP为二聚体， 45KD ，被cAMP 激活； •结合位点～22bp I -70 ~ -50 II -50 ~ -40
CAP的结合对DNA构型的影响
• DNA弯曲 • 弯曲点位于CAP结合位点二重对称的中心 • 弯曲使CAP能与启动子上的RNA pol 接触
6.4 半乳糖操纵子
6.5.1 转录水平的调控
通过阻遏物结合操纵子，转录效率降低 至1/70；然而细胞中，在阻遏状态下， trp酶系统的酶活却只有1/700，那么，是 不是还存在另外一个阻遏系统呢？
6.5.2 翻译水平的调控
前导肽的前后序列结构
4个片段进行配对，形成不同的二级结构
Lack of trp Lack of aminoacyl tRNA Ribosome pause at trp codons, occluding sequence 1 Form 2:3 hairpin antiterminator Transcription into trpE and beyond
噬菌体是如何进行选择，是进入裂解 还是溶原途径呢？
OR3 OR2 OR1
cro
cⅡ
PE tR1
O P Q
tR2 tR3 PR’
cⅢ
tL1
N
PLOL
cⅠ
PM
PROR
OL1 OL2 OL3
N CⅢ
Cro
早期 CⅡ
O P Q
晚早期
CⅠ CⅠ
PE PM
晚期
λ噬菌体基因调控过程
• 早期 • 由PL转录翻译出抗终止蛋白N，由PR转录出调节蛋 白Cro; • 晚早期 • 在N蛋白的作用下，使得RNApol 越过tL1、tR1、 tR2，从而使蛋白CⅢ、CⅡ、复制相关蛋白O、P， 抗终止Q等表达； • CⅢ与CⅡ共同作用，启动cro与cⅡ基因之间的启动 子PE，使得CⅠ的得以表达； • 转录出来的RNA含有cro基因的反义mRNA，后者抑 制了cro基因的翻译； • 由于PR和PE的RNApol会碰头， 负责PR的RNApol的 活性会被PE的RNApol排挤；
调节基因
开关序列
ß -半乳糖苷酶
半乳糖苷透性酶
乙酰基转移酶
6.3.1 调控机理
• 调控区结构
• • • • lacI, 1045bp，独立Pi P, 82bp，－82～＋1 O, 35bp，－7～＋28 lacZYA
阻遏状态
诱导状态
体外结合竞争实验
体外乳糖操纵子
阻遏物
RNA pol
RNA pol
• 大肠杆菌半乳糖操纵子(galactose operon)包括3个结构 基因，一个调节基因：
• • • • 异构酶(UDP-galactose-4epimerase,GalE)； 半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶(galactose transferase, GalT)； 半乳糖激酶(galactose kinase, Galk)。 阻遏蛋白（GalR）
阻遏蛋白的结合位点－－lacO的结构
对称轴，+11；对称序列，6bp
动画 lac.mov
Question • 当生长环境中没有乳糖时，乳糖操纵子是关闭 的；有乳糖添加进来后，乳糖操纵子应该正常 启动，但是当乳糖与葡萄糖共同存在时，发现 细菌先利用葡萄糖，葡萄糖耗尽后再来利用乳 糖，这又是为什么呢？ • 因此，细胞中必然存在另外一种机制，能够根 据葡萄糖存在状况，控制乳糖操纵子的开或关 。
6.3 乳糖操纵子 (负调控模式)
• 1940年， Monod发现：细菌在含葡萄糖和乳糖的培养 基上生长时，细菌先利用葡萄糖，葡萄糖用完后，才 利用乳糖；在糖源转变期，细菌的生长会出现停顿。 即产生“二次生长曲线”； • 1951年，Monod与Jacob合作，发现两个基因： • Z基因：与合成β-半乳糖苷酶有关； • I基因：决定细胞对诱导物的反应。 • Jacob：结构基因旁有开关基因（操纵基因），阻遏物 通过与开关基因的结合，控制结构基因的表达； • 1961年, F. Jacob & J.Monod提出乳糖操纵子概念； • 1965年诺贝尔生理学和医学奖。
gal操纵子的特点
• 它有两个相距仅5 bp启动子，其mRNA可从两个不同 的起始点开始转录； • P1起始（强启动）:需要半乳糖+CAP+cAMP • P2起始（弱启动）：低浓度cAMP-CAP（即存在葡萄 糖）。
总结起来： 1）无glu有gal，P1高效起始； 2）有glu无gal，P2低效起始。 问题： 1）有glu有gal，如何起始？ 2）无gal时，阻遏蛋白仍然结合O位点，RNApol 如何从P2起始呢？
• 细胞外研究诱导作用时 ，很少使用乳糖 • 替代物：
• IPTG，异丙基半乳糖苷 • TMG ，巯甲基半乳糖苷 • ONPG, O-硝基半乳糖苷
6.3.3 阻遏蛋白的作用机制
• 38KD，4 聚体; • lacI，组成型转录 ，Pi 弱启动子，5 －10个／cell； • 具有二重性：
• 阻止转录（与lacO 结合） • 开始转录（与诱导 物结合）
• λ噬菌体进入裂解周期 • 宿主中存在hfl基因，它的表达产物是蛋白CⅡ的水 解酶，水解了CⅡ， CⅠ将得不到表达…… • 而hfl基因的表达受到cAMP-CAP的负调控，存在 cAMP-CAP时， hfl基因关闭； 缺乏cAMP-CAP时 ， hfl基因打开； • 没有CⅠ蛋白， Cro蛋白将得到大量积累，而Cro结 合于OR3与OL3位点，不影响PL与PR转录的继续进行 ； • 当细胞中有足够的复制蛋白O、P，抗终止蛋白Q以 后，噬菌体结构基因A ……J表达，溶菌酶基因得已 表达，A蛋白切割cos位点，噬菌体包装后释放出来 。
High trp
Trp is inserted at the trp codons
Translate to the end of leader message Ribosome occlude sequence 2
Terminate transcription at (3:4 form terminator)
两个转录起始位点的生物学意义
• 半乳糖不仅作为碳源供细胞生长，另一方面尿苷二磷酸 半乳糖（UDPgal）是大肠杆菌细胞壁合成的前体； • 在半乳糖存在的情况下，由半乳糖操纵子合成UDP-gal ；在没有半乳糖的情况下，UDP-gal是通过半乳糖异构 酶的作用由UDP-Glu合成的，该酶是GalE基因的产物 ；因此，细菌必须以低水平不断合成GalE； • 若只有P1，当Glu存在时，无法合成GlaE，若只有P2 ，当Glu不存在而Gla存在时，无法高水平合成Gal酶系 统。
6.2 操纵子
• 又称操纵元，是一组核苷酸序列，包括了一个操纵序 列，一个普通的启动子，及一个或以上的结构基因被 用作生产信使RNA（mRNA）的基元。操纵子主要在 原核生物及线虫动物门出现 。 • 把生物学活性相关的基因放在一起，便于管理，一开 俱开，一关俱关。 I P O X Y Z
Operon control model
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 6.5 色氨酸操纵子
• 生物细胞中的氨基酸合成， 也受操纵元的调节。细胞 需要某种氨基酸时，其基因即表达，不需要时基因关 闭，达到经济的原则； • 色氨酸操纵子的结构
trpR, 阻遏蛋白 P，-40~+18 O, -21~+1 L, +1~+162 结构基因
t, A下游36bp, 不依赖p t’, t下游250bp，依赖p
衰减子普遍的生物学意义
6.6 噬菌体基因表达的调控
• λ噬菌体进入细菌细胞以后，可以按裂解或建立溶原两 种生活方式生存和繁殖； • 在每个菌体内繁殖100个左右的新噬菌体，并裂解细菌 释放出来，再度感染其它活菌，称为裂解； • λ噬菌体把自身DNA整合进细菌染色体DNA中，作为 细菌基因的一部分，随菌的细胞分裂而增殖，这种生 活状态称为溶原；